何志旭; 严虎; 刘俊峰; 舒丽萍; 汪浩文

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2013.06.011

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• 小儿神经基础与临床 •

骨髓间充质干细胞移植治疗缺血再灌注脑损伤

中华实用儿科临床杂志, 2013,28(6) : 435-439. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2013.06.011

摘要

目的

探讨骨髓间充质干细胞(MSC)移植对缺血再灌注脑损伤的治疗效果及机制。

方法

采用线栓法制备缺血再灌注脑损伤SD大鼠模型。96只大鼠随机分为4组：模型组、MSC移植组、PBS对照组和假手术组，每组24只。取体外培养至第6代的骨髓MSC，经烟酸己可碱33342标记后，于造模24 h后经阴茎静脉进行移植，对照组注射等量PBS。分别于实验第2、3、4、8、15、22天对各组大鼠进行神经损伤严重程度(NSS)评分，通过荧光显微镜观察MSC在脑组织内的定植情况，并对脑组织进行2，3，5－氯化三苯四唑(TTC)染色及神经干细胞、神经元、星形胶质细胞的特异性标志物[神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]的免疫组织化学染色。

结果

MSC移植后2 d在受损的脑组织局部便可见蓝色荧光分布，并于15 d时达到高峰。免疫组织化学结果显示，与模型组和对照组相比，MSC移植组大鼠受损脑组织局部Nestin、NSE、GFAP阳性细胞的数量均明显增多，差异均有统计学意义(P均<0.05＝。MSC移植组自第8天受损部位脑梗死的范围即出现显著缩小，NSS评分也明显下降，且与模型组及对照组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05＝。

结论

骨髓MSC移植可有效增加缺血再灌注脑损伤局部神经干细胞、神经元、星形胶质细胞的数量，对神经损伤的修复起一定的促进作用。

引用本文: 何志旭, 严虎, 刘俊峰, 等. 骨髓间充质干细胞移植治疗缺血再灌注脑损伤 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2013, 28(6) : 435-439. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2013.06.011.

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目前缺血再灌注脑损伤已经成为缺血性脑卒中治疗过程中所面临的难题，因为传统的治疗方法无法有效地促进神经元再生及修复受损的神经，所以，部分患者即使存活也会遗留不同程度的神经系统后遗症。如何安全有效地修复由于缺血再灌注导致的脑组织结构和功能上的损伤已经成为当前亟待解决的一项研究课题。间充质干细胞(MSC)作为一种具有多系分化潜能的原始细胞，对许多的器官组织损伤性疾病有良好疗效。同时，由于其抗原性较弱，具有良好的组织相容性，便于进行异体移植，因此极具临床应用前景。本研究通过建立实验性缺血再灌注脑损伤大鼠模型，应用体外培养的骨髓MSC对其进行移植治疗，以探讨该疗法的有效性及可行性。

1　材料与方法

1.1　材料

兔抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体、兔抗大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体购自武汉博士德公司；大鼠血清NSE酶联免疫吸附测试试剂盒、烟酸己可碱33342购自美国Sigma公司，山羊抗大鼠CD₂₉、CD₃₄、CD₄₅、CD₇₁流式细胞抗体购自美国B&D公司。

1.2　方法

1.2.1　实验动物及分组

96只雄性SD大鼠，3～4月龄，体质量280～300 g。按随机数字表法分为4组：模型组、MSCs移植治疗组(移植组)、PBS对照组(对照组)和假手术组，每组各24只。另取4只1月龄SD大鼠行骨髓MSC培养用。所有实验动物购买并饲养于贵阳医学院动物实验中心(SCXK黔2002-0001)，研究方法经贵阳医学院动物实验中心伦理委员会批准。

1.2.2　缺血再灌注脑损伤模型的构建

采用改良Longa线栓法^[1]制备缺血再灌注脑损伤模型，实验当天定为0 d：大鼠以100 mg/L水合氯醛(300 mg/kg)行腹腔麻醉，颈部正中切口，分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。电凝颈外动脉分支，结扎并游离颈外动脉主干远端。将栓线从颈外动脉残端起始部插入。插入深度约距颈总动脉分叉处(18.0±0.5) mm，遇阻力即停止进线，固定栓线结扎缝合。2 h后回抽栓线使其头端回到颈外动脉内(回抽约10 mm)，恢复灌注。

1.2.3　骨髓MSC的分离培养

SD大鼠予脱颈处死，消毒后于无菌条件下取双侧股骨，显露骨髓腔，用低糖的DMEM培养基(L－DMEM)冲洗骨髓获取骨髓细胞，经PBS洗涤1000 r/min离心5 min后，以L－DMEM液(含100 mL/L胎牛血清)重悬细胞，并调整细胞密度为1×10¹⁰/L，将其接种于25 mL培养瓶中，于37 ℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养。定期于倒置显微镜下观察细胞形态，并常规进行传代扩增。流式细胞仪检测细胞表面CD₂₉、CD₃₄、CD₄₅、CD₇₁抗原表达并进行鉴定，MTT法检测细胞增殖活力。

1.2.4　MSC荧光标记及移植

取培养5～6代生长状态良好的MSC，在培养基内加入烟酸己可碱33342至终质量浓度为2 mg/L继续培养60 min，经PBS洗涤离心3次后以2.5 g/L胰蛋白酶常规消化细胞，并以PBS将其制备为3×10⁹/L的细胞悬液。移植组于缺血再灌注脑损伤模型构建后24 h进行MSC单次移植。大鼠经100 mg/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，经阴茎静脉缓慢注入1 mL烟酸己可碱33342标记的MSC细胞悬液。对照组注射等量的PBS。各组大鼠分别于实验的第2、3、4、8、15、22天进行相关检测。

1.2.5　行为学观察

各组大鼠分别于实验的第2、3、4、8、15、22天随机选取4只大鼠按照Longa的评分标准^[1]进行神经损伤严重程度(neurological severity score, NSS)评分。0分：无神经功能缺损；1分：不能伸直左侧前肢；2分：向左侧转圈；3分：向左侧跌倒；4分：意识状态差。

1.2.6　脑损伤的组织学评价

大鼠取血后行断头处死，取出脑组织，于视交叉处沿冠状位行连续切片，经2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)染色后，应用Laika全自动图像分析系统对图像分析，并根据公式V＝t(A₁＋…＋A_n)－(A₁＋A_n)t·2^－1(t为切片厚度，A为梗死灶面积)计算梗死体积占前脑体积的百分比。同时利用荧光显微镜观察烟酸己可碱33342标记的MSC局部植入情况，并通过免疫组织化学染色观察脑组织细胞Nestin、GFAP、NSE的表达情况。

1.3　统计学处理

应用SPSS 10.0统计软件进行分析。计量数据以±s表示，多组样本间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　MSC体外生长情况

大鼠骨髓细胞在体外培养至第8天时可见到大量梭形细胞生长，且相互融合至旋涡状，见图1A。经过连续传代培养5、6代细胞纯度可达95%，且MTT法显示细胞仍具有很强的增殖活性，见图1B，6代以后细胞增殖活性降低。经流式细胞仪检测显示，其细胞表面CD分子表达情况为CD₂₉(87.3±6.5)%、CD₇₁(22.1±4.7)%、CD₃₄(2.5±1.3)%、CD₄₅(7.6±3.5)%(见图2)，符合MSC的特征。

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图1

大鼠骨髓MSC生长情况

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注：A：原代MSC(×200)；B：第6代MSC(×200)

图1

大鼠骨髓MSC生长情况

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图2

大鼠骨髓MSC流式细胞检测结果

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图2

大鼠骨髓MSC流式细胞检测结果

2.2　NSS评分结果

假手术组大鼠行为学正常，各时间点NSS评分均为0分。而在缺血再灌注脑损伤模型构建后的各组大鼠活动明显减少，并出现不同程度的运动障碍，体质量减轻，神情呆滞。在实验的2～3 d，各组NSS评分达高峰，之后逐渐下降。与模型组及对照组相比，MSC移植组NSS评分的下降趋势更为明显，见表1。

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表1

对照组、模型组及移植组NSS评分的比较(分，±s)

表1

对照组、模型组及移植组NSS评分的比较(分，±s)

组别	2 d	3 d	4 d	8 d	15 d	22 d
对照组	2.83±0.67	2.91±0.59	2.68±0.43	2.28±0.38	2.13±0.19	1.71±0.31
模型组	2.98±0.57	3.04±0.38	2.59±0.62	2.41±0.49	2.05±0.24	1.67±0.28
移植组	3.05±0.48	2.88±0.33	2.53±0.61	2.01±0.44^a	1.64±0.32^a	1.23±0.17^a
F值	0.91	0.87	1.61	5.16	25.37	25.11
P值	>0.05	>0.05	>0.05	<0.01	<0.01	<0.01

注：与模型组、对照组比较，^aP<0.05

2.3　MSC移植后在脑组织的定植情况

烟酸己可碱33342标记的MSC移植后第2天(即实验的第3天)，通过荧光显微镜在大鼠的大脑皮层及海马区可见少量蓝色荧光表达，随时间延长，其荧光强度逐渐增大，直至第15天时达到高峰，之后虽有所下降，但第22天时仍可见到少量荧光表达。

2.4　MSC移植对脑损伤修复的影响

假手术组大鼠脑组织结构正常，未见任何梗死迹象。而在缺血再灌注脑损伤模型构建后的第2天，各组大鼠在位于包括大脑皮层及基底核在内的右大脑中动脉供血区，均出现边界清晰、范围恒定的苍白梗死灶，并且在第2－4天各组大鼠脑梗死范围无显著差异。自第8天开始，各组大鼠的脑梗死范围均呈现出逐渐缩小的趋势，移植组脑梗死范围缩小更为明显，差异具有统计学意义，见表2。

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表2

对照组、模型组及移植组脑梗死范围的比较(%，±s)

表2

对照组、模型组及移植组脑梗死范围的比较(%，±s)

组别	2 d	3 d	4 d	8 d	15 d	22 d
对照组	25.83±3.11	25.21±2.12	23.73±2.13	18.85±1.39	14.31±0.69	12.5±0.78
模型组	25.13±2.01	25.42±3.39	17.41±2.03	24.27±1.32	13.59±0.49	11.5±0.91
移植组	26.37±2.79	25.33±3.19	22.92±1.69	14.71±2.41^a	7.69±1.13^a	6.55±0.87^a
F值	1.29	0.03	73.95	174.52	476.56	333.21
P值	>0.05	>0.05	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与模型组、对照组比较，^aP<0.05

2.5　MSC移植对脑组织Nestin表达的影响

假手术组大鼠脑组织内可见少量的Nestin阳性细胞，而在缺血再灌注脑损伤模型构建后的各组大鼠脑组织受损部位Nestin阳性细胞的数量均显著增多，且于第8天达到高峰。单纯模型组及对照组Nestin阳性细胞的数量于第8天后明显下降，而移植组Nestin阳性细胞数在第3天时便明显高于单纯模型组及对照组(P<0.05)，自第8天之后虽同样有所下降，但仍处于较高水平，并且与单纯模型组及对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表3、图3A。

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表3

对照组、假手术组、模型组及移植组大鼠脑组织Nestin阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

表3

对照组、假手术组、模型组及移植组大鼠脑组织Nestin阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

组别	2 d	3 d	4 d	8 d	15 d	22 d
对照组	19.17±3.39	39.98±5.19	45.37±6.25	54.19±4.73	33.49±6.38	19.21±4.42
假手术组	6.89±2.37	7.15±2.08	8.87±3.15	7.57±2.59	6.68±3.18	7.95±1.41
模型组	23.05±4.54	37.54±2.44	49.03±5.63	52.47±4.89	29.94±6.69	16.15±5.93
移植组	22.48±4.71	47.53±3.52^a	64.33±5.92^a	89.79±7.43^b	84.17±8.91^b	67.74±5.78^b
F值	90.99	620.47	458.17	1006.50	584.65	780.92
P值	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与模型组、对照组相比，^aP<0.05；^bP<0.01

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图3

大鼠脑组织免疫组织化学染色结果

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A：Nestin染色阳性细胞(×400); B：NSE染色阳性细胞(×400)；C：GFAP染色阳性细胞（×400)

图3

大鼠脑组织免疫组织化学染色结果

2.6　MSC移植对脑组织NSE表达的影响

假手术组在各时间点其脑组织内NSE阳性细胞数均处于相对稳定的较高水平，而在缺血再灌注脑损伤模型构建后的各组大鼠脑组织受损部位于实验第2天NSE阳性细胞数量便出现显著下降。随时间延长，至第4天时其NSE阳性细胞数量均呈逐渐回升趋势，移植组NSE阳性细胞数量明显多于模型组与对照组(P<0.05)，见表4、图3B。

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表4

对照组、假手术组、模型组及移植组大鼠脑组织NSE阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

表4

对照组、假手术组、模型组及移植组大鼠脑组织NSE阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

组别	2 d	3 d	4 d	8 d	15 d	22 d
对照组	13.37±3.02	15.93±2.41	19.24±2.68	17.33±3.75	24.52±2.21	33.97±3.57
假手术组	59.65±3.16	58.73±2.18	57.82±0.98	61.28±1.13	62.26±1.08	59.29±2.74
模型组	14.46±3.31	13.21±2.29	17.73±1.95	20.14±2.27	22.62±3.15	34.81±2.48
移植组	12.21±2.27	14.35±3.42	25.82±4.12^a	40.40±3.19^a	39.57±4.08^a	35.01±3.02
F值	1463.50	1708.70	1451.65	1307.60	987.85	412.51
P值	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与模型组、对照组相比，^aP<0.05

2.7　MSC移植对脑组织GFAP表达的影响

各时间点假手术组大鼠脑组织内GFAP阳性细胞数处于相对稳定的较低水平。缺血再灌注脑损伤模型构建后，各组大鼠脑组织受损部位于实验第2天GFAP阳性细胞数量显著增多。第3、4天时移植组GFAP阳性细胞数量明显多于模型组与对照组(P均<0.05)，其后模型组与对照组GFAP阳性细胞数量显著减少，与移植组间的差异性更为明显(P均<0.01)，见表5、图3C。

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表5

对照组、模型组、假手术组及移植组大鼠脑组织GFAP阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

表5

对照组、模型组、假手术组及移植组大鼠脑组织GFAP阳性细胞计数的比较(个/×200视野，±s)

组别	2 d	3 d	4 d	8 d	15 d	22 d
对照组	27.07±4.42	32.45±3.17	49.84±6.38	33.06±4.85	23.42±3.39	22.16±2.47
假手术组	15.25±3.17	13.53±3.46	17.43±2.63	13.93±3.57	16.18±4.15	12.19±2.77
模型组	25.06±3.89	37.41±4.38	54.18±5.93	35.19±5.72	24.51±4.33	20.49±3.29
移植组	27.18±4.33	48.84±5.82^a	63.06±5.72^a	76.39±6.83^b	54.32±7.37^b	49.08±5.19
F值	48.76	276.93	329.37	547.13	268.90	477.20
P值	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与模型组、对照组相比，^aP<0.05；^bP<0.01

3　讨论

MSC是一类源自中胚层的多能干细胞，在成体包括骨髓、脐带血、脂肪组织在内^[2]的诸多部位均有发现。由于MSC强大的自我更新及多向分化潜能，在许多器官组织损伤性疾病的治疗中均备受关注^[3,4,5,6,7]。同时，其具有良好的免疫耐受性，在进行异体移植时可避免产生明显的免疫应答，目前已有在人体应用的成功实例并且通过长期的随访证实其具有很好的安全性^[8,9,10]，因此MSC极具临床应用前景。

有研究显示，在体外特定的培养状态下MSC能被诱导分化为血管内皮细胞^[11]，神经元和神经胶质细胞^[12,13]，因此作者推测当机体发生缺血再灌注脑损伤时，外源性MSC移植进入受损部位后一方面可以通过分化为神经元和神经胶质细胞，从而恢复受损脑组织的结构和功能；另一方面将通过促进血管新生改善受损区域的血液供应，加速损伤修复。最新的研究显示，骨髓MSC能够被诱导分化为神经干细胞样细胞，通过对脑性瘫痪患者进行自体移植，可以使其运动和语言功能得到一定程度的改善^[14]。表明，MSC具有潜在的神经修复能力，使其在缺血再灌注损伤的应用成为可能。

本研究通过建立缺血再灌注脑损伤大鼠模型，应用体外培养的骨髓MSC对其进行移植治疗。结果显示，MSC经静脉移植后能顺利通过血脑屏障并到达脑组织的受损部位，与对照组相比，经MSC移植后，大鼠脑组织梗死病灶的修复更为迅速，行为学异常也得到更好的改善。说明MSC移植治疗对于缺血再灌注脑损伤，能有效促进受损区域脑组织结构的重建，并对神经功能的恢复具有一定的促进作用。有研究显示，外源性MSC的植入可以有效刺激内源性神经干细胞的增生，并抑制神经细胞的凋亡^[15]，以减少缺血再灌注损伤的范围及促进损伤部位的修复。此外，IL－10等抗炎因子及凋亡抑制因子表达上调在这一过程中也发挥重要作用^[16]。

近年来的研究显示，在成体的侧脑室壁的室管膜下区以及海马齿状回的颗粒下区仍然存在着具有强大增殖分化潜能的神经干细胞。正常状态下，这些神经干细胞处于相对静止或缓慢生长的状态，而在特定的条件刺激下可被激活，并增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，替代受损的神经细胞，以实现受损脑组织的修复^[17]。Nestin作为神经干细胞的特异性标志物，能较好地反映缺血再灌注损伤局部神经干细胞的增殖情况，因此，本研究采用免疫组织化学法对各组大鼠脑组织不同时间点Nestin的表达情况进行检测。结果显示，缺血再灌注脑损伤模型构建后，各组大鼠脑组织受损部位Nestin阳性细胞的数量均显著增多，这表明在缺血再灌注导致脑组织损伤后，机体自身的调节机制即启动，通过刺激局部神经干细胞的增殖分化以修复受损的脑组织。相比之下，在不同的时间点MSC移植组Nestin阳性细胞的数量均远高于单纯模型组及对照组，同时GFAP阳性细胞数量的增高及NSE阳性细胞数量减少的恢复也同样较模型组及对照组明显。由于神经干细胞可分化为神经细胞及星形胶质细胞，而NSE和GFAP分别可以作为神经元和星形胶质细胞的特异性标志物。推测，在缺血再灌注损伤发生时，神经元大量的凋亡，加之局部微环境的作用，使得原本处于静止状态的神经干细胞大量增殖并分化为神经元及星形胶质细胞，一方面通过星形胶质细胞来修复并重建受损部位的正常组织结构，另一方面大量新生的神经元替代凋亡的神经元并重新建立正常的神经连接以最大限度地恢复中枢神经系统的功能，而MSC的植入则在这一过程中起促进作用。其可能机制：(1)MSC植入后通过与神经细胞的相互作用促进其自身或周围神经细胞分泌多种神经营养因子，有助于损伤神经的恢复^[18]。(2)MSC可直接分化为神经元，修复坏死的神经组织，使神经功能得到改善^[19,20]。(3)MSC通过分泌某些细胞因子加速神经干细胞的活化并发挥其自身的修复作用^[21]。

尽管本研究尚无法确定MSC移植后，缺血再灌注脑损伤局部增多的神经干细胞是由MSC植入后在特定的微环境下直接分化而来，还是MSC分泌的细胞因子促进了原位神经干细胞的内源性激活。然而可初步证实，在机体发生缺血再灌注损伤时，通过外源性MSC移植能有效地促进病变局部神经干细胞的增殖、分化，增加局部神经元及星形胶质细胞的数量，从而起到加速受损部位组织结构及功能恢复的作用，这对于临床中缺血再灌注损伤的治疗以及后期康复有很大的帮助，因此本研究结果对于缺血再灌注损伤的MSC临床治疗提供了实验依据，但值得注意的是，该疗法的长期疗效及可能存在的潜在风险尚需进一步的观察与评估。

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贡献者信息

何志旭