探讨平喘固本合剂对支气管哮喘(哮喘)小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-17及呼吸道重塑的影响。
健康雌性昆明系小鼠40只,随机分为4组:正常对照组、哮喘组、平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组,每组各10只。采用卵清清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型,正常对照组腹腔注射PBS,其余3组腹腔注射OVA混悬液,期间平喘固本合剂干预组每日胃饲平喘固本合剂。在激发阶段,正常对照组雾化吸入PBS,其余3组雾化吸入OVA。布地奈德雾化干预组于激发前雾化吸入布地奈德混悬液。采用ELISA法测定BALF中IL-17水平。免疫组织化学法测定肺组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)水平。
1.平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组BALF中IL-17水平明显低于哮喘组(P均<0.05);与正常对照组比较,平喘固本合剂干预组BALF中IL-17水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。2.平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组呼吸道MMP-9、TIMP-1表达水平和MMP-9/TIMP-1比值明显低于哮喘组,差异均有统计学意义(P均<0.01);与正常对照组比较,呼吸道MMP-9表达水平和MMP-9/TIMP-1比值明显增高,差异均有统计学意义(P均<0.01),2个治疗组间比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。
平喘固本合剂对哮喘小鼠具有抑制呼吸道炎症和重塑的作用,在一定程度上可替代布地奈德吸入治疗。
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支气管哮喘(哮喘)是儿童常见的慢性呼吸系统疾病,其发病机制目前仍未完全清楚。中医治疗哮喘已有2000余年历史,本研究在人参五味子汤和小青龙汤研究基础上制成平喘固本合剂,探讨其对哮喘小鼠呼吸道炎症及重塑的影响。
卵清清蛋白(OVA) (美国Sigma公司);氢氧化铝[Al(OH)3]干粉(天津市天河化学试剂厂);基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (TIMP-1)(北京中杉金桥生物技术有限公司);布地奈德(瑞典阿斯利康公司);IL-17 ELISA试剂盒(美国R&D公司)。
平喘固本合剂:人参8 g、白术6 g、茯苓10 g、炙甘草3 g、五味子6 g、防风9 g、细辛3 g、半夏6 g、麻黄9 g,所有药物冷水浸泡1 h,陶器砂锅武火煮沸后,文火煎15 min,过滤,留取药汁,药渣加冷水煮沸后,再熬10 min,留取药汁,2次药汁约100 mL,含生药4 g/L,装入已消毒容器,4 ℃冰箱保存备用。中药使用时间不超过4 d。
40只健康雌性SPF级昆明系小鼠,购自青岛市动物实验中心,4~6周龄,体质量15~19 g,非OVA饲料喂养。采用随机数字表法分组,将小鼠分为4组:正常对照组(A组)、哮喘组(B组)、平喘固本合剂干预组(C组)、布地奈德雾化干预组(D组)。每组各10只。
参照文献[1],B组、C组、D组小鼠分别于0、7、14 d行腹腔注射OVA混悬液0.2 mL[含OVA 100 μg、Al(OH)3 2 mg]。A组分别于0、7、14 d腹腔注射PBS 0.2 mL。期间C组每日予平喘固本合剂0.6 mL胃饲,A组予以9 g/L盐水0.6 mL胃饲。最后1次腹腔注射结束后1周,进入激发阶段,将B组、C组、D组小鼠分别置于30 cm×40 cm×30 cm自制雾化箱内,空气压缩雾化驱动10 g/L OVA,隔日雾化1次,每次30 min,连续8周。D组于激发前20 min予布地奈德混悬液1 mg/L雾化治疗,1次/d,每次30 min,连续8周;A组则雾化吸入PBS。
各组小鼠于末次激发24 h内腹腔注射100 g/L的水合氯醛0.5 g/kg麻醉,摘眼球取血,用5号注射针头插入小鼠主气管,1 mL注射针管抽取PBS 0.5 mL进行肺泡灌洗,反复3次,每次灌注后立即回吸,回收的支气管肺泡灌洗液(BALF)存放在1.5 mL EP管中,取0.1 mL BALF于血细胞计数板中测定细胞总数,余BALF离心(1500 r/min,10 min,4 ℃),取上清液置-80 ℃冰箱中待测。剪下左肺,经40 g/L多聚甲醛固定,待病理学检查。
结果判断[2]:每张切片随机选取4个视野,分别测定MMP-9、TIMP-1阳性染色面积及其占所选视野面积的百分比(即相对染色面积),以此代表相对水平。采用多功能彩色病理图像分析系统对MMP-9、TIMP-1棕色阳性部位进行检测,每张玻片随机选用5个视野(×400倍),自动选取阳性部位并计算相对积分光密度值,计算MMP-9/TIMP-1比值。
应用SPSS 17.0软件进行分析,计量资料以±s表示。凡符合正态分布和方差齐性的数据,采用单因素方差分析,对于非正态分布计量资料,进行秩和检验,多组间比较有差异后采用Mann-Whiteney U法行多组间两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
结果见表1。
组别 | 例数 | IL-17(ng/L) | MMP-9(%) | TIMP-1(%) | MMP-9/TIMP-1 |
---|---|---|---|---|---|
A组 | 10 | 15.41±3.07 | 0.720±0.054 | 0.710±0.063 | 1.010±0.037 |
B组 | 10 | 23.32±4.39a | 1.900±0.260a | 1.880±0.200a | 0.830±0.036a |
C组 | 10 | 20.16±1.72b | 1.460±0.130 | 1.380±0.180 | 0.920±0.038 |
D组 | 10 | 17.67±2.50 | 1.290±0.180 | 1.230±0.210 | 0.980±0.092 |
F值 | 8.07 | 55.47 | 56.18 | 11.65 | |
P值 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
注:A组:正常对照组;B组:哮喘组;C组:平喘固本合剂干预组;D组:布地奈德雾化干预组。a与其他3组比较,P<0.01;b与正常对照组比较,P<0.01
结果见表1。
A组小鼠肺组织中仅表达少量MMP-9、TIMP-1,阳性细胞数量少。B组小鼠肺组织切片镜下可见大量浓染棕黄色免疫阳性反应,其浓染棕黄色免疫阳性反应较A组及C组MMP-9、TIMP-1和D组MMP-9、TIMP-1明显增强。见图1。
注:A:A组TIMP-1;B:B组TIMP-1;C:C组TIMP-1;D:D组TIMP-1;E:A组MMP-9;F:B组MMP-9;G:C组MMP-9;H:D组MMP-9。A组:正常对照组;B组:哮喘组;C组:平喘固本合剂干预组;D组:布地奈德雾化干预组
小鼠激发吸入10 g/L OVA后出现抓耳、烦躁不安或俯伏不动、大小便增多,部分出现呼吸加深加快,B组较其他各治疗组症状均明显。A组未见上述表现。B组小鼠雾化3 d后出现皮毛无光泽现象,A组未出现,其他治疗组不明显。
哮喘是多种炎性细胞及细胞组织成分参与的变应性疾病,以慢性呼吸道炎症和呼吸道重塑为其主要特征。其发病机制尚未完全清楚,有研究发现,IL-17作为新型T淋巴细胞亚群参与呼吸道重塑的过程[3]。吸入性糖皮质激素为控制呼吸道炎症最常用的药物,可抑制哮喘小鼠呼吸道炎症与重塑[4],但停药后易反弹或复发。
哮喘小鼠的呼吸道重塑发生过程中,TIMP-1作为MMP-9的抑制因子,可促进呼吸道重塑的进程。有研究显示哮喘患者诱导痰及血清中MMP-9及TIMP-1均增高[5],布地奈德改善呼吸道重塑是通过降低MMP-9的水平及升高TIMP-1的水平进而调整MMP-9/TIMP-1比值而起作用[6]。推测MMP-9、TIMP-1在哮喘呼吸道重塑中起关键性作用。有研究报道IL-17作为一种促炎因子,在哮喘小鼠BALF中明显升高[7]。吴素玲等[8]研究发现,IL-17参与儿童哮喘的发生,其升高水平与病情的严重程度有关,IL-17还可以促进MMP-9在哮喘炎症中的表达,故IL-17在哮喘呼吸道炎症和呼吸道重塑中有重要作用。
人参五味子汤及小青龙汤治疗哮喘作为经典组方被广泛应用。平喘固本合剂是在人参五味子汤及小青龙汤2个方剂的研究基础上辨证加减而成,由人参、白术、茯苓、炙甘草、五味子、防风、细辛、半夏、麻黄等九味中药组成。现代药理学研究证实人参五味子汤不仅可增强单核吞噬细胞的吞噬功能,增强免疫力,还可增加INF-γ的生成,调节机体的免疫平衡,有止咳、平喘、祛痰等对症治疗作用[9]。研究发现小青龙汤具有降低IL-5、嗜酸性粒细胞的肺部浸润[10],上调肺组织糖皮质激素受体及β-肾上腺素受体,上调肺组织神经生长因子的表达,抑制Ⅰ型变态反应,降低内皮素和一氧化氮,调节Th1/Th2失衡的作用,改善肺功能[11]。
本实验发现哮喘组BALF中IL-17水平明显高于正常对照组,表明IL-17在哮喘小鼠呼吸道重塑中起重要作用。同时哮喘组MMP-9、TIMP-1明显高于正常对照组及其他干预组,MMP-9/TIMP-1比值明显低于其他组;BALF中IL-17水平与肺组织中MMP-9的表达呈正相关,提示IL-17可通过提高肺组织中MMP-9的表达促进哮喘呼吸道重塑的进程。有研究提示人参五味子汤及小青龙汤可通过调节哮喘小鼠Th1/Th2失衡,有效地改善呼吸道炎性反应,改善呼吸道重塑,治疗效果与吸入布地奈德相似[12]。本研究发现,平喘固本合剂可下调IL-17表达水平,下调MMP-9在肺组织中的表达,调节MMP-9/TIMP-1的平衡,达到改善哮喘呼吸道重塑的进程,与雾化吸入布地奈德的作用基本相似,为哮喘治疗提供了新的试验依据。