分析进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)临床表现、遗传学特点和基因突变特点。
应用聚合酶链反应-直接测序方法对2例临床疑似PFIC3的中国患儿ABCB4基因的27个外显子及其侧翼序列进行突变检测,并对其家庭主要成员进行相应突变基因检测,收集临床资料分析。健康对照组为无血缘关系的健康儿童50例,男27例,女23例,均为汉族。
2例患儿主要表现为胆汁淤积、黄疸伴瘙痒、肝大,血清γ-谷氨酰转肽酶、胆汁酸升高。例1为ABCB4基因c.2489ins A和c.3143_3145delGCAinsCC复合杂合突变,例2为c.966G>C(p.G319R)和c.3220G>A(p.G1074R)复合杂合突变,均为新发突变;2例患儿父母及例2弟弟均为突变基因携带者。
发现了4种尚未见报道的ABCB4基因新突变,c.2489ins A/c.3143_3145delGCAinsCC突变可能与严重临床表型相关。
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进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(progressive familial intrahepatic cholestasis type 3,PFIC3)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病。临床上可表现为突出的和特征性的瘙痒、反复发作性的高结合胆红素血症、白陶土样便、肝脾大,因肝硬化门脉高压可发生胃肠出血,常在成年前进展为肝硬化和肝衰竭[1]。PFIC3是PFIC的一种亚型,与PFIC 1型和2型的主要区别在于血清γ-谷氨酰转肽酶(GGT)升高及肝组织病理表现为明显的小胆管增生[2]。PFIC3发病多呈散发,各地发病率尚未有确切报道。有调查结果显示,该病平均发病率为1/500 000[3],但在一些具有近亲婚配文化习俗的人群中,其发病率会更高,而男女发病率则基本一致[4,5]。ABCB4基因,又称为多药耐药3(multi-drug resistance 3,MDR3)基因或MDR2基因,系ATP结合转运体(ATP-binding cassette,ABC)超基因家族中P糖蛋白基因家族的成员之一。该基因位于常染色体7q21.1区域,跨距74 kb。cDNA全长4.1 kb,包括28个外显子,27个外显子含编码序列。目前已报道40多种不同的ABCB4基因突变[4,5],突变类型包括错义突变、无义突变、缺失突变和小片段碱基的插入[6]。本研究对2011年1月至2014年3月在广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心收治的2例临床疑似PFIC3患儿进行了ABCB4基因突变分析,并探讨其临床表型和基因型之间的关系。
本病的诊断依据:(1)以黄疸和/或瘙痒为主要特征。(2)符合胆汁淤积症的诊断标准:血清总胆红素(TB)< 85.0 μmol/L时,结合胆红素(DB)>17.1 μmol/L;TB≥85.0 μmol/L时,DB占TB≥20%。(3)起病初期的GGT>57.0 U/L。(4)行腹部B超、同位素肝胆显像、遗传代谢病筛查等除外先天性胆道闭锁、胆管扩张及其他常见先天性异常。
2例PFIC3患儿(例1为男性,4岁8个月;例2为女性,2岁6个月)均来自广东省,汉族,根据临床症状、体征、实验室检查[血常规,血气分析,代谢生化,TORCH(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)+EB病毒抗体检测,戊肝抗体检测,巨细胞病毒DNA定量分析,自身免疫性肝病抗体,凝血功能,铜蓝蛋白,甲胎蛋白,新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)基因检测(第2例),甲状腺功能,血浆氨基酸分析,血酰基肉碱分析,尿气相色谱-质谱(GC/MS)有机酸检测等相关检查]和治疗观察结果符合以上诊断标准。健康对照组为无血缘关系的健康儿童50例,男27例,女23例,均为汉族。抽取其外周静脉血保存,待DNA分析。本研究通过医院伦理委员会批准,采集血标本前均获监护人签署知情同意书。
抽取所有患儿外周静脉血2 mL,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,混匀后置-80 ℃冰箱保存。
将冷冻保存的全血置于室温下解冻,应用基因组提取试剂盒E.Z.N.A.® Blood DNA Kit(美国OMEGA公司生产)提取基因组DNA。
采用聚合酶链反应(PCR)扩增ABCB4基因外显子所在片段,对扩增片段进行正向或反向序列测定,检测突变位点。
根据基因数据库中的ABCB4基因外显子序列设计引物。引物应用专业引物设计软件Primer Primer 5.0设计。ABCB4基因引物由华大基因公司合成。合成好的引物根据各自的分子质量用去离子水溶解并稀释成100 mmol/L的贮存浓度,置于-20 ℃冰箱冻存,见表1。
产物 | 5'-3'正向引物 | 5'-3'反向引物 | 片段长度(bp) | 退火温度(℃) |
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Exon 2 | CCGGAGAGGGTGTACTTGGTTCTGAG | GATTGGCGTGTAACGGAAAAGCCAG | 303 | 60 |
Exon 3 | TATCTTTGTAGTACCTTCGACAGTTAC | TATCTTTGTAGTACCTTCGACAGTTAC | 363 | 56 |
Exon 4 | GAGGAGAAATTCCATTCCACAGC | CTTCTATGATATCTGGAGTCAACCAG | 337 | 61 |
Exon 5 | CAATAGCATCTTCTAGCTTTCATACA | TGAATCTGGGTAAAGAGTACACG | 280 | 55 |
Exon 6 | GGTATTTAATAGAGCCTTTCTC | CCTTGACATATTTTCACACAG | 290 | 53 |
Exon 7 | GGCTTGCAGTCAGTGAACAA | CCTGAACAGGTACAAGTACGAGA | 373 | 55 |
Exon 8 | GGTTAAAGGGTTGACCAGAGTG | GCCATCAGTAAAGGGTGCTT | 341 | 55 |
Exon 9 | GGTCTCACCATGGGTTCATT | TCATCTTTCAAAAAGGAGCGA | 398 | 53 |
Exon 10 | TAATGAATGCCAGAATGTGAC | TCAAAAATATGCAAACTAAAGCCA | 246 | 59 |
Exon 11 | CTTGTTTGTGCTATGATGGAATAGTC | GATTCAACAATCAACCTCAGTTAGG | 210 | 56 |
Exon 12 | TTCACTTTTCTTACCCTTCT | TTACCAAAACTGGATTCACA | 485 | 50 |
Exon 13 | GGATGTTTTTCATGAATGGTCC | TGGACAATCTTGCATCTCAAA | 392 | 55 |
Exon 14 | CAAAGCTCCATGTTGTCTTTATG | TGTTTCTCAGCCCAGACTCC | 354 | 55 |
Exon 15 | TTTGCCATAATCACGCAGAG | TGCTCAGTATAGCATTCACTGGA | 400 | 55 |
Exon 16 | CTTTAATGTCTTGATATTCTTTCAG | CCTGAAAAATATTTGCAAGGCT | 284 | 55 |
Exon 17 | CGAACAACCCATACTCAGCTTATG | GAGGTTGGGAGAAGCAGCAGC | 425 | 64 |
Exon 18 | AAACATGTGACACTCAAGCCA | TACCCTCCAGCAGAGCCTTA | 333 | 55 |
Exon 19 | TCCGTGGCAACTGTAAAACA | GGGAAAACATGCATATCGAC | 293 | 55 |
Exon 20 | AGAGATGCCCTCCCTGCTAC | CAGTGGGTCAATCAACCTTGA | 463 | 60 |
Exon 21 | AGCCAATGTAGCTCAGGCAT | AGTTGTAGTGGGCACAAACATT | 435 | 61 |
Exon 22 | TGGCAGGCTGGGAATAGAA | AGAATTGTTGAAAAAAGGCCACC | 529 | 58 |
Exon 23 | AAGCCGTGCTCTTTCCACTA | TTCCTACTCTAAACTTTTGCATAAACC | 293 | 55 |
Exon 24 | GTATGTCGGGGAGAAAGGG | TGAAACACATGTTGGTGTAATCA | 400 | 55 |
Exon 25 | CAGTCTTTGGTAAAGTTTCCTTGAA | TTCCATTATGACAATATTGGTTGG | 360 | 53 |
Exon 26 | AACGATCCTCCAAATGGACA | GTTTGGGGGATAAAAAGTAGTCTC | 349 | 58 |
Exon 27 | AAACACTCTGTTAAGTTGAAACAACG | TTTTTCATGGTTGACAGCAAA | 350 | 55 |
Exon 28 | CACATGCATAAAGTTCAAAGATTC | TGCCGTAATAAACCCCAAAT | 500 | 53 |
25 μL PCR反应体系中,基因组DNA 2 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,正反引物各5 pmol,EX Taq DNA聚合酶0.125 μL(日本TaKaRa公司)。PCR(德国Biometre公司)热循环条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,50~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,循环35次,最后72 ℃延伸8 min。采用20 g/L琼脂糖凝胶电泳(北京六一仪器厂)鉴定目的基因PCR产物。
外显子扩增片段送至华大基因公司进行纯化,正向或反向序列测定(3730测序仪),结果采用DNAMAN,Chromas软件分析,并与美国国立生物技术信息中心(NCBI)中的正常序列进行BLAST比对。
对患儿父母及主要亲属相应突变外显子进行PCR测序,以明确突变来源;在人类基因突变数据库(HGMD)(http://www.hgmd.org)、单核苷酸多态性(SNP)数据库(http://www.ncbi.nih.gov/SNP)及文献进行突变位点查找;与50例健康对照的测序结果进行对比分析,排除多态性可能;检测新突变所对应编码的氨基酸序列是否具有进化上的保守性。
(1)每次随访肝功能生化指标均提示血清丙氨酸转氨酶(ALT)、GGT、胆汁酸(TBA)持续升高,均高于正常值2~6倍,前清蛋白(PA)持续低于正常下限,血清GGT与ALT、TB、TBA及PA的变化基本一致。(2)影像辅助检查:例1患儿腹部超声提示肝脾大,例2患儿腹部超声提示肝大。(3)例1患儿肝组织活检镜下见肝细胞轻度疏松变性,排列结构尚存,汇管区纤维组织轻度增生,小胆管轻度增生,见大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润,提示肝组织呈非特异性炎改变,轻度纤维化。例2患儿未行肝组织穿刺活检。
(1)例1患儿存在c.2489insA (p.T830NfsX43)/c.3143_3145delGCAinsCC(p.A1047 delinsPT)复合杂合突变。ABCB4基因外显子第2489位点A的插入导致其下游131 bp处产生了终止密码子,43个氨基酸序列发生改变,该突变来自父亲,测序峰图见图1A;第3143_3145位点缺失GCA的同时插入了CC,导致其下游23 bp处产生了终止密码子,7个氨基酸序列发生改变,该突变来自母亲,测序峰图见图1B。(2)例2患儿存在c.966G>C(p.G319R)/c.3220G>A(p.G1074R)复合杂合突变。ABCB4基因外显子第966位点G>C,该突变来自母亲,测序峰图见图1C;第3220位点G>A,该突变来自父亲,弟弟携带该突变,测序峰图见图1D;2个错义突变均是由非极性疏水性甘氨酸变为极性碱性精氨酸。(3)50个健康对照(100个等位基因位点)中,用直接测序法检测c.966G>C(p.G319R)和c.3220G>A(p.G1074R)突变,未发现这2个突变。这2个新发突变均发生在脊椎动物的氨基酸高度保守区域。
注:A:例1患儿第21号外显子上的c.2489ins A(p.T830NfsX11)杂合突变;B:例1患儿第25号外显子上的c.3143_3145delGCAinsCC(p.A1047PfsX8)杂合突变;C:例2患儿第9号外显子上的c.966G>C(p.G319R)杂合突变;D:例2患儿第25号外显子上的c.3220G>A(p.G1074R)杂合突变 A:a heterozygous mutation of c.2489ins A(p.T830NfsX11) at exon 21 was found in the case 1;B:a heterozygous mutation of c.3143_3145delGCAinsCC(p.A1047PfsX8)at exon 25 was found in the case 1;C:a heterozygous mutation of c.966G>C(p.G319R)at exon 9 was found in the case 2;D:a heterozygous mutation of c.3220G>A(p.G1074R)at exon 25 was found in the case 2
PFIC3是由于编码MDR3的ABCB4基因所致突变,ABCB4基因位于常染色体7q21区域[9],跨距74 kb。cDNA全长4.1 kb,包括28个外显子,编码的MDR3蛋白主要在肝脏、B淋巴细胞、心脏和肌肉等组织中,尤其肝毛细胆管膜上表达[10,11,12,13,14,15]。MDR3蛋白位于细胞膜上,分为4个区:2个同源的核苷酸结合区(nucleotide binding domain,NBD)朝向胞质,能够结合和水解ATP,其序列在整个ABC家族中高度保守;2个同源的跨膜区(transmembrane domain,TMD)均由6个疏水性片段构成,多次跨膜并形成底物排出道[16,17,18,19,20]。其中NBD分别由3个外显子编码(外显子12、13、14和外显子25、26、27)。12个跨膜的片段中有8个各由1个单独的外显子编码,其余4个跨膜片段由2个外显子编码[21]。有研究显示ABCB4基因突变热点涉及外显子6、9、12、14、18、23、26,均位于编码蛋白主体区,突变类型与胆汁淤积严重性相关。纯合无义突变与PFIC3连锁,杂合无义突变、杂合错义突变、纯合错义突变与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)[22,23]及胆石症连锁[24]。目前已报道大约有40多种与PFIC3相关的ABCB4基因突变[25,26,27,28]。报道的病例主要分布在北非、土耳其、意大利等欧洲白人中,在中国台湾曾有过报道[5,29]。目前我国内地尚无PFIC3相关基因突变报道。
MDR3糖蛋白是胆汁磷脂分泌过程中小管磷脂转运器,ABCB4基因的突变导致小管磷脂输出泵的缺乏和胆汁中磷脂水平下降[30,31,32,33,34,35]。健康成人肝细胞、胆管每日分泌胆汁800~1 200 mL,其中约3/4由肝细胞分泌。胆汁中97%为水,其他成分包括TBA、胆盐、胆固醇、磷脂酰胆碱、胆色素、脂肪酸、酶类、无机盐和刺激因子。胆汁中的磷脂主要是磷脂酰胆碱,正常由毛细胆管上皮细胞分泌,其与肝细胞分泌的胆酸盐、胆固醇等在胆管内形成混合胶粒,磷脂酰胆碱可以乳化胆盐和胆固醇,防止胆固醇析出,保护胆管上皮免受胆盐损伤,所以缺乏磷脂的胆汁可能导致胆管受损,胆石沉积,诱发炎症导致肝脏病变[36]。
在本文检测到的c.2489insA、c.3143_3145delGCAinsCC、c.966G>C(p.G319R)、c.3220G>A(p.G1074R)4种突变未见文献、HGMD及SNP数据库中报道,4种突变均发生在脊椎动物氨基酸高度保守区内,c.966G>C(p.G319R)与c.3220G>A(p.G1074R)这2个错义突变在50例无亲缘关系正常对照组中均未检出。外显子9、25位于编码蛋白的主体区[4,37,38],外显子21位于跨膜区段的紧邻胞质区,由于MDR3糖蛋白是胆汁磷脂分泌过程中小管的磷脂转运器,所以蛋白的胞质区段和毗邻胞质侧的细胞膜段功能将更为重要,因此推测上述4种突变对蛋白功能影响可能性更大。推测c.2489insA和c.3143_3145delGCAinsCC突变导致翻译中mRNA终止密码提前出现,c.966G>C(p.G319R)和c.3220G>A(p.G1074R)突变使多肽链氨基酸种类发生改变,导致多肽链丧失原有功能,从而不能形成功能性MDR3糖蛋白。结合临床表现及实验室检查,高度提示上述4种新突变均可能为致病性突变。
本文2例患儿生化参数动态观察结果,提示血清GGT与ALT、TB、TBA及PA的变化基本一致,该特点能否作为区别其他类型淤胆型婴儿肝病综合征的生化标志物,有待今后病例数增加后明确。结合例1临床表现,腹部超声提示肝脾同时肿大,肝组织活检病理提示轻度纤维化,而例2腹部超声仅提示肝大,推测c.2489insA/c.3143_3145delGCAins CC突变可能与导致严重临床表型相关,但由于本文例数少,无法十分明确基因型与临床表型相关性。