通过检测再生障碍性贫血(AA)患儿T淋巴细胞内mTOR信号途径分子的表达水平，研究该信号途径在儿童AA中的改变。从T淋巴细胞的胞内信号转导途径上探讨儿童AA的免疫学发病机制。
用流式细胞仪(FCM)方法检测16例初治重型AA(SAA)(初治SAA组)及8例免疫抑制剂治疗有效的SAA患儿(SAA治疗有效组)外周血CD3＋T淋巴细胞内mTOR信号途径分子磷酸化Akt(p－Akt)、磷酸化TSC2(p－TSC2)、磷酸化mTORC1(p－mTORC1)、磷酸化4EBP1(p－4EBP1)及磷酸化p70S6K(p－p70S6K)的表达水平，与17例健康儿童(健康对照组)及CEM细胞株(CEM组)的表达水平进行比较及分析。
1.初治SAA组外周血CD3＋T淋巴细胞内p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1及p－p70S6K表达水平均明显高于健康对照组(P<0.05)，而低于CEM组(P<0.05)，初治SAA组、健康对照组及CEM组p－Akt的平均荧光强度分别为8.04±3.78、2.59±1.01、20.23±8.98，p－TSC2分别为49.73±19.49、16.10±8.04、101.05±29.78，p－mTORC1分别为13.90±9.32、2.92±1.09、34.30±19.03，p－4EBP1分别为142.69±53.36、26.91±13.70、256.01±53.79，p－p70S6K分别为17.67±10.48、3.69±2.22、31.73±12.85。2.SAA治疗有效组外周血CD3＋T淋巴细胞内p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1及p－p70S6K的表达水平均低于初治SAA组(P均<0.05)；SAA治疗有效组p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p70S6K的表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)，但p－4EBP1的表达水平高于健康对照组(P<0.05)，治疗有效组信号途径分子的表达量依次为3.28±1.27、16.50±10.91、3.54±1.66、74.89±49.69、4.21±1.69。
1.初治SAA患儿外周血T淋巴细胞中p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1、p－p70S6K表达升高，表明mTOR信号途径在SAA患儿中呈活化状态。2.SAA治疗有效患儿外周血T淋巴细胞中p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1、p－p70S6K表达低于初治SAA患儿，mTOR信号途径的活化程度与疾病状态相关，说明该信号途径可能参与AA患儿T淋巴细胞的免疫异常。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节细胞生长、分化及增殖中处于核心地位[1]。最近，mTOR信号途径在调控T淋巴细胞分化和功能上的作用与地位也越来越受到重视，其中最主要的一条信号转导途径PI3K/Akt/mTOR与T淋巴细胞的活化密切相关，这对自身免疫性疾病具有非常重要的意义。已有报道证实系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、移植物抗宿主病的发病与mTOR信号途径异常活化有关[2,3]。再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓造血功能衰竭性疾病，是儿童期较为常见且严重的血液病之一，越来越多的学者认为大多数AA是T淋巴细胞介导的以造血组织为靶器官的自身免疫性疾病。本研究旨在通过检测AA患儿外血T淋巴细胞中mTOR信号途径上游分子Akt、TSC2、mTOR及下游分子4EBP1、p70S6K的磷酸化水平，研究该信号途径在儿童AA中的改变，探讨mTOR信号途径与AA免疫学发病机制的关系。
24例AA患儿为2012年3月至2013年1月苏州大学附属儿童医院及苏州大学附属第一医院门诊或住院治疗的重型AA(SAA)患儿，诊断标准及疗效评定根据《血液病诊断及疗效标准》[4]，治疗有效疗效评定时间点为使用抗淋巴细胞球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白(ATG/ALG)后≥6个月，其中初治SAA组16例，男9例，女7例，中位年龄8岁(3～16岁)；SAA治疗有效组8例，男4例，女4例，中位年龄6岁(2～15岁)。同期选取苏州大学附属儿童医院17名儿童保健科体检者为健康对照组，其中男6例，女11例，中位年龄6岁(3～10岁)；选用CEM细胞株作为阳性对照(CEM组)[5]。
CD3－PC5小鼠抗人单克隆抗体、IgG－异硫氰酸荧光素(FITC)羊抗兔单克隆抗体(美国Beckman Coulter公司)；兔抗人磷酸化Akt(p－Akt)单克隆抗体(Ser473)、p－TSC2(Thr1426)、p－mTORC1(Ser2448)、p－4EBP1(Ser65)、p－p70S6K(Thr389)(美国Cell Signaling公司)；Lyse/Fix Buffer(5×)、Perm Buffer Ⅲ破膜剂(美国BD公司)；PRMI 1640培养液(美国GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；CEM细胞株由苏州大学附属第一医院血液研究所惠赠。
抽取患儿及健康对照组外周血3 mL(非空腹)，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。
每次分别设定(1)同型对照管、(2)p－Akt测定管、(3)p－TSC2测定管、(4)p－mTORC1测定管、(5)p－4EBP1测定管及(6)p－p70S6K测定管。加入待测标本，病例组每管150～200 μL，健康对照组每管100 μL；再加入CD3－PC5 2 μL，室温避光孵育15 min。
将Lyse/Fix Buffer(5×)用双蒸水稀释成Lyse/Fix(1×)，放入水浴锅内预热至37 ℃备用(注意：需新鲜配制)。每管分别加入血样的20倍体积的Lyse/Fix Buffer(1×)(如100 μL血样加2 mL Buffer)，混匀后37 ℃水浴10 min，离心(2 240×g，10 min)弃上清后PBS洗涤；分别加入1 mL Perm Buffer Ⅲ(使用前置于－20 ℃冰箱中预冷)，轻轻混匀后，冰上孵育30 min后PBS洗涤2次。
各管中加入相应的抗体，(1)为空白对照，不加抗体，(2)～(6)测定管中依次加入p－Akt抗体、p－TSC2抗体、p－mTORC1抗体、p－4EBP1抗体、p－p70S6K抗体各1 μL，室温下避光孵育60 min后PBS洗涤；各管中加入1 μL IgG－FITC，室温下避光孵育30 min，PBS洗涤，离心(2 240×g，10 min)弃上清后，各管加入500 μL PBS重悬细胞，4 ℃避光保存，24 h内上流式细胞仪(FCM)分析。
采用对数生长期CEM细胞，将细胞密度调制1×1010/L各管中加入细胞悬液100 μL (CEM本身即为T淋巴细胞，无需CD3－PC5抗体标记)，再加入40 g/L的甲醛500 μL固定细胞，室温孵育15 min后用PBS洗涤；细胞破膜及细胞内磷酸化蛋白的荧光标记步骤同病例组。
采用Beckman Coulter FCM检测标本，CXP2.2软件获取和分析细胞。以侧向散射光强度(SSC)和前向散射强度(FSC)设门，圈出淋巴细胞群。再获取CD3阳性的淋巴细胞，分析p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1、p－p70S6K，以平均荧光强度(MFI)代表表达水平。
所有数据用SPSS 19.0统计软件处理分析。各计量资料采用
±s表示，2组数值符合正态分布及方差齐者采用独立样本t检验，方差不齐则采用t'检验，P<0.05为差异有统计学意义，所有P值均为双侧检验。
初治SAA组p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1及p－p70S6K表达水平均明显高于对照组(t'＝5.577、6.407、4.681、8.421、5.224，P均<0.05)；而显著低于CEM组(t'＝2.952、4.542、2.315，P<0.05；t＝4.138、2.489，P<0.05)，见表1。
初治SAA组及SAA治疗有效组mTOR信号途径分子的表达水平(平均荧光强度，
±s)
Expression levels of the molecules of mTOR signaling pathway in each group(mean fluorescence intensity，
±s)
初治SAA组及SAA治疗有效组mTOR信号途径分子的表达水平(平均荧光强度，±s)
Expression levels of the molecules of mTOR signaling pathway in each group(mean fluorescence intensity，±s)
| 名称 | 健康对照组 | 初治SAA组 | CEM组 | SAA治疗有效组 |
|---|---|---|---|---|
| p－Akt | 2.59±1.01 | 8.04±3.78 | 20.23±8.98 | 3.28±1.27 |
| p－TSC2 | 16.10±8.04 | 49.73±19.49 | 101.05±29.78 | 16.50±10.91 |
| p－mTORC1 | 2.92±1.09 | 13.90±9.32 | 34.30±19.03 | 3.54±1.66 |
| p－4EBP1 | 26.91±13.70 | 142.69±53.36 | 256.01±53.79 | 74.89±49.69 |
| p－p70S6K | 3.69±2.22 | 17.67±10.48 | 31.73±12.85 | 4.21±1.69 |
注：SAA：重型再生障碍性贫血 SAA：severe aplastic anemia
SAA治疗有效组p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1、p－4EBP1及p－p70S6K表达水平均明显低于初治SAA组(t＝3.436、4.454，P<0.05；t'＝4.313、2.998、5.009，P<0.05)；SAA治疗有效组p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1及p－p70S6K的表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(t＝1.451，P＝0.160；t＝0.103，P＝0.919；t'＝0.957，P＝0.361；t＝0.632，P＝0.535)，但p－4EBP1的表达水平显著高于健康对照组(t'＝2.683，P<0.05)，见表1。
mTOR信号途径在调控T淋巴细胞分化和功能上的地位越来越明显，已有研究表明予雷帕霉素抑制啮齿目动物mTOR的活化可致胸腺退化和T淋巴细胞输出减少，进一步延长雷帕霉素的作用时间，则会阻止胸腺细胞从双阴性CD4－CD8－向双阳性CD4＋CD8＋转化[6]。Delgoffe等[7]报道，敲除编码mTOR基因的小鼠体内初始CD4＋T淋巴细胞不能分化为Th1、Th2或Th17，而是分化为Treg细胞。Haxhinasto等[8]则发现持续活化的mTOR信号途径可损害胸腺中产生的自然调节性T细胞(nTreg)。mTOR信号途径活化后还可以通过上调转录因子T－bet及下调转录因子Eomes的表达而调控CD8＋T淋巴细胞向毒性T淋巴细胞(CTL)分化[9]。以上可见mTOR信号途径参与T淋巴细胞的活化及影响T淋巴细胞亚群的分化，对T淋巴细胞免疫平衡具有十分重要的作用。
AA中T淋巴细胞的异常活化是否与mTOR信号途径有关？本试验结果显示初治SAA患儿外周血CD3＋T淋巴细胞内mTOR信号途径上游信号分子p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1的表达水平均较健康对照组明显升高，说明mTOR信号途径上游在初治SAA患儿的T淋巴细胞中呈活化状态。提示该途径可能参与了SAA患儿的T淋巴细胞的异常活化，SAA患儿的T淋巴细胞接受TCR和CD28的双重刺激后，胞内Akt磷酸化水平增高，活化的Akt将TSC2磷酸化，进而解除TSC1/TSC2对mTORC1的抑制作用，使mTORC1磷酸化水平增高。mTOR信号途径的活化能促进初始CD4＋T淋巴细胞向效应性Th1细胞分化，初始CD8＋T淋巴细胞分化为CTL细胞，Treg细胞减少，从而打破T淋巴细胞免疫平衡。研究证实SAA患者存在Th1细胞功能亢进、Th1/Th2细胞比例失衡，CTL细胞数量异常增多及Treg细胞减少[10,11]。现已有mTOR信号途径与其他自身免疫性疾病的相关报道。Tang等[12]对SLE患者外周血T淋巴细胞的研究中发现p－Akt表达上调。Barber等[13]对狼疮模型MRL－lpr小鼠CD4＋T淋巴细胞的研究中发现p－Akt的表达高于正常野生型小鼠。糖尿病小鼠模型的研究中也发现胖Zucker鼠与瘦Zucker鼠相比肾的p－Akt、p－mTOR的表达上调，说明1型糖尿病中存在mTOR信号途径的过度激活[14]。本结果表明作为自身免疫性疾病的SAA中也存在mTOR信号途径的活化，但初治SAA组p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1的表达明显低于阳性对照组，说明SAA患儿T淋巴细胞内mTOR信号途径的活化程度低于CEM细胞，其活化状态具有相对性。CEM细胞是人T淋巴细胞白血病细胞，为无限增殖的肿瘤性细胞，与SAA患儿T淋巴细胞的生物学特点不同，这可能是二者mTOR信号途径活化程度不同的一个原因。本研究还对8例ATG/ALG联合环孢素治疗有效的SAA患儿进行研究，结果显示SAA治疗有效组外周血CD3＋T淋巴细胞中p－Akt、p－TSC2、p－mTORC1明显低于初治SAA组，而与健康对照组表达水平相当，提示病情缓解后，mTOR信号途径处于相对静息状态，也反向说明该信号途径可能与SAA的免疫学发病机制相关。
本试验结果还显示初治SAA组外周血CD3＋T淋巴细胞中mTOR信号途径的2个主要下游分子p－4EBP1、p－p70S6K的表达明显高于健康对照组，但低于阳性对照组，说明SAA患儿外周血T淋巴细胞中mTOR下游信号途径也呈相对活化状态。提示SAA患儿T淋巴细胞内mTOR信号途径的上游活化后进一步p－4EBP1使其失活和p－p70S6K使其激活。Wu等[15]对B6.Sle.Sle3狼疮鼠的研究中也发现，其脾脏分选的异常活化的淋巴细胞中磷酸化的p70S6K及4EBP1表达较正常的C57BL/6小鼠比健康对照组显著增加。治疗有效SAA组外周T淋巴细胞内p－4EBP1及p－p70S6K的表达情况与该组mTOR信号途径上游分子一样明显低于初治SAA组，提示mTOR信号途径活化的程度与疾病的状态相关，SAA患儿T淋巴细胞内mTOR信号途径经治疗后活化程度下降，处于一种相对静息状态。在SLE动物模型的实验也发现，病情重的C57BL/B小鼠的淋巴细胞中p70S6K及4EBP1表达高于病情相对较轻的B6.Sel小鼠[14]。但与健康对照组相比，治疗有效组p－4EBP1的表达略高，差异有统计学意义，p－p70S6K则与健康对照组的表达无统计学差异，这可能是因为治疗有效SAA组的患儿虽然造血功能呈恢复状态，但并未达到完全治愈有关，也可能是因为样本量较小导致的实验误差。
综上所述，通过对初治SAA及SAA治疗有效患儿T淋巴细胞内mTOR信号途径相关分子的检测，发现mTOR信号途径在SAA患儿的T淋巴细胞中处于异常活化状态，初步证明了AA中T淋巴细胞内mTOR信号途径存在异常活化，但由于标本收集困难，未能进行SAA治疗前后的配对分析以及对难治/复发性AA中T淋巴细胞内mTOR信号途径进行研究，影响了实验的完整性。本课题组将进一步完善研究，这有利于进一步理解AA的免疫发病机制。
