探讨改良聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)－溴化乙啶(EB)显色法在基因型多态性检测中的应用特点。
采用病例－对照研究方法，选取颅内出血新生儿167例作为病例组，同期因住院观察的非颅内出血的新生儿163例作为对照组，分别使用PAGE－银染、琼脂糖凝胶电泳(AGE)－EB以及PAGE－EB 3种方法进行聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)分析技术检测所有研究对象μ－阿片受体A118G (OPRM1 A118G)基因型，比较3种方法的应用特点。
PAGE－银染法及改良PAGE－EB电泳法均能清晰检测OPRM1 A118G基因型：突变纯合子GG(169 bp)，突变杂合子AG(193 bp，169 bp)，野生纯合子AA(193 bp)，DNA片段分辨率比较差异无统计学意义(P＝0.884)，AGE－EB则只能检测出原始条带(193 bp)，而不能准确分辨OPRM1 A118G的具体基因型。PAGE－银染法共13个步骤，需4～5 h，12种化学试剂，相机采集图片，技术要求高，操作难度大，耗时；改良PAGE－EB法共6个试验步骤，历时2 h，使用8种试剂，自动凝胶成像仪采集图片。
在基因型多态性检测中，改良PAGE－EB法简便、快捷、分辨率高，值得推广。
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目前常用的基因分析方法有DNA杂交分析，聚合酶链式反应－酶联免疫吸附法(PCR－ELISA)，免疫分析技术，荧光定量(FQ)－PCR、DNA熔解曲线分析技术等，但因其需要特殊的仪器设备，价格昂贵，操作过程复杂等限制了其在试验中的应用[1]。PCR－限制性片段长度多态性(RFLP)技术是检测基因多态性的常用方法，得到酶切片段后可以通过电泳染色获取基因型，在实验中得到广泛应用[2]。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)－银染，该方法分辨率高[3]，但繁琐、耗时；琼脂糖凝胶电泳(AGE)－溴化乙啶(EB)显色法敏感、简单、快捷，但分辨率差[4]。本研究在这2种方法的基础上设计出改良凝胶电泳方法：PAGE－EB，期望在科学研究中寻找到一种既分辨率高、敏感、又简单、快捷的检测方法。并将此改良方法在μ－阿片受体A118G(OPRM1 A118G)基因多态性与新生儿颅内出血的相关性研究中进行验证。现报告如下。
选取2011年7月至2013年3月郑州大学第一附属医院新生儿重症监护室(NICU)收治的167例颅内出血新生儿为病例组，同期因早产要求住院观察的163例非颅内出血新生儿为对照组。颅内出血的诊断标准依据《实用新生儿学》第4版[5]。所做研究均征得患儿家属同意并签署知情同意书，研究方案经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准。
采用PCR－RFLP技术进行OPRM1 A118G多态性位点的检测。
所有患儿外周股静脉取血2 mL，置于抗凝管中，4 ℃冰箱保存，应用DNA试剂盒(北京康为试剂有限公司)提取外周血白细胞DNA。
引物设计根据文献和基因文库[6]，上游5'－GGTCAACTTGTCCCACTTAG－3'，下游5'－AATCACATACATGACCAGGAAGTTT－3'(上海生工生物工程公司)。PCR反应体系：10 nmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×PCR TaqMix 10 μL最后加超纯水至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共38个循环；然后72 ℃延伸10 min，4 ℃冰箱保存。
在长度为193 bp的PCR反应产物中，包含限制性内切酶BstUI的特异性作用位点，可以被酶切消化为2个长度分别为169 bp和24 bp的片段。基因型为AA型的不被切开，电泳仅表现为193 bp的单一条带：GG型的可以被切开为169 bp和24 bp的片段(24 bp条带因为太小，容易扩散，凝胶电泳上末能清楚显示，仅能观察到长度为169 bp的条带)，AG型的则含有193 bp和169 bp 2个条带。酶切反应体系：内切酶Bsh1236Ⅰ(MBI)2 μL，Buffer R 2 μL，PCR产物10 μL，加无菌去离子水18 μL，37 ℃水浴12 h，酶切完毕后－20 ℃冰箱保存酶切产物。
2 g琼脂糖、1×TAE缓冲液100 mL、EB(1 g/L) 14 μL依次加入锥形瓶中搅拌混匀，微波炉加热约1.5 min至沸腾，冷却到50 ℃左右，倒入制胶模中，凝胶完全凝固20 min后，放入电泳槽，加1×TAE缓冲液，10 μL酶切产物上样，100 ladder Marker做参照，115 V/100 mA电泳25 min后置于自动凝胶成像系统观察结果。整个过程需1～2 h。
(1)装板：先将玻璃板和1 mm垫条彻底洗净、晾干，把长玻璃和短玻璃及垫条对齐，用透明胶带密封两侧及底边。(2)配胶：聚丙烯酰胺(Acr):甲叉双丙烯酰胺(Bic)＝29:1(2.55 mL)，5×TBE缓冲液1.5 mL，100 g/L过硫酰胺(AP)75 μL，四甲基乙二胺(TEMED) 3 μL，加去离子水(ddH2O)至5 mL混匀，加入垂直玻璃槽中至凝胶凝固，约30 min。(3)加样、电泳：凝胶置于电泳槽中，加入1×TBE电泳缓冲液，酶切产物2 μL加样，100 ladder Marker做参照，105 V/100 mA电泳50 min。(4)银染：倒胶、漂洗、固定(100 mL/L乙醇、10 g/L冰醋酸，4 ℃冰箱放置)、漂洗(去离子水，2～3遍)；染色(2 g/L AgNO3，370 g/L甲醛500 μL/L)、漂洗、显色(15 g/L NaOH，10 g/L硫代硫酸钠，370 g/L甲醛2 500 μL/L)至样品条带呈褐色、凝胶背景呈透明淡黄色、漂洗、透明膜固定凝胶，拍照，固定液放置。全程共计4～5 h。
前3个步骤同100 g/L PAGE，电泳完毕后，倒胶，漂洗，将凝胶置于EB液(1×10－6 g/L)中浸泡约20 min，自动凝胶成像系统观察结果、拍照。整个过程历时约2 h。
采用病例－对照研究策略，分别使用PAGE－银染法和改良PAGE－EB法，进行OPRM1 A118G基因多态性检测。应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，分别计算各组基因型和等位基因的频率，结果使用χ2检验，检验水准α＝0.05。
OPRM1 A118G共有3种基因型：突变纯合子GG(169 bp)，突变杂合子AG(193 bp、169 bp)，野生纯合子AA(193 bp)。PAGE－银染及改良PAGE－EB法均能清晰分辨OPRM1 A118G 3种基因型：AA、AG、GG，见图1、图2；AGE－EB则只能检测出原始条带(193 bp)，而不能准确分辨OPRM1 A118G的具体基因型，见图3。
分别使用PAGE－银染及改良PAGE－EB电泳检测病例组患儿基因型，结果显示差异无统计学意义(χ2＝0.217，P＝0.897)，2种凝胶电泳方法检测对照组患儿基因型，结果显示差异无统计学意义(χ2＝0.107，P＝0.948)，所有研究对象2种凝胶电泳检测基因型结果，差异无统计学意义(χ2＝0.247，P＝0.884)，见表1，表2，表3。综上可得，PAGE－银染和改良PAGE－EB均能清晰检测OPRM1 A118G基因型，且结果差异无统计学意义。
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测病例组OPRM1 A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1 A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in case group[n(%)]
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测病例组OPRM1 A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1 A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in case group[n(%)]
| 方法 | 基因型 | 等位基因 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| AA | AG | GG | A | G | |
| PAGE－银染 | 74(44.3) | 79(47.3) | 14(8.4) | 227(67.9) | 107(32.1) |
| PAGE－EB | 73(43.7) | 82(49.1) | 12(7.2) | 228(68.3) | 106(31.7) |
注：PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳；EB：溴化乙啶 PAEG：polyacry－lamide gel electrophoresis；EB：ethidium bromide
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测对照组OPRM1 A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1 A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in control group[n(%)]
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测对照组OPRM1 A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1 A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in control group[n(%)]
| 方法 | 基因型 | 等位基因 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| AA | AG | GG | A | G | |
| PAGE－银染 | 87(53.4) | 69(42.3) | 7(4.3) | 243(74.5) | 83(25.5) |
| PAGE－EB | 89(54.6) | 68(41.7) | 6(3.7) | 246(75.5) | 80(24.5) |
注：PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳；EB：溴化乙啶 PAEG：polyacry－lamide gel electrophoresis；EB：ethidium bromide
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测所有研究对象OPRMI A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in all samples[n(%)]
PAGE－银染及改良PAGE－EB检测所有研究对象OPRMI A118G基因型结果[例(%)]
Comparisons of genotypes frequencies of the OPRM1A118G with methods of PAGE－silver staining and improved PAGE－EB staining in all samples[n(%)]
| 方法 | 基因型 | 等位基因 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| AA | AG | GG | A | G | |
| PAGE－银染 | 161(48.8) | 148(44.8) | 21(6.4) | 470(71.2) | 190(28.8) |
| PAGE－EB | 162(49.0) | 150(45.5) | 18(5.5) | 474(71.8) | 186(28.2) |
注：PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳；EB：溴化乙啶 PAEG：polyacry－lamide gel electrophoresis；EB：ethidium bromide
目前电泳技术已成为临床检验、实验诊断和分子生物学等领域必不可少的研究手段[9]。PAGE和AGE都是最常用的分离、鉴定及纯化DNA片段的标准方法[8]。AGE－EB电泳是以琼脂糖凝胶为电泳介质，试验方法简单、快捷，高浓度凝胶分离小片段DNA分子，低浓度的凝胶分离大片段DNA分子，常用的琼脂糖凝胶浓度为5 ～20 g/L，适合100～50 000 bp的片段分离[7,10]。本研究预实验中采用20 g/L的凝胶，不能将小于50 bp的DNA片段分开，不能用于本研究基因型的检测。PAGE－银染是以聚丙烯酰胺凝胶为电泳介质，分辨率高，能将5～300 bp小片段核酸分离，用于测序的聚丙烯酰胺凝胶可分离相差1 bp的DNA片段[10]。通过改变聚丙烯酰胺凝胶质量浓度，可以控制其孔径，低质量浓度凝胶具有较大的孔径，高质量浓度的凝胶具有较小的孔径，丙烯酰胺的质量浓度可以在30～300 g/L，预实验选择300 g/L的凝胶，能分辨本研究基因型，但整个实验步骤繁琐，共计13个步骤，使用12种化学试剂，且干扰因素大、技术难度高、耗时、费力，任一步骤不规范，都可能影响图像质量及结果判定，图片直接用相机采集，易反光且带有水印，结果不易编辑。改良PAGE－EB结合聚丙烯酰胺的高分辨性及EB的敏感性，简化了试验，DNA片段分辨率与PAGE－银染法相比，差异无统计学意义(P＝0.884)，能够检测出OPRM1 A118G全部基因型，整个实验简便、快捷、耗材少，自动凝胶成像仪采集图片，图片清晰易编辑。
OPRM1 A118G基因多态性与新生儿颅内出血的关联性研究属基因遗传学范畴。基因遗传性分析是一项浩大的工程，需要做大量的调查研究，搜集大样本数据。本研究选取167例颅内出血新生儿为病例组，同期非颅内出血新生儿163例为对照组，OPRM1 A118G基因型：GG (169 bp)，AG(193 bp、169 bp)，AA(193 bp)，突变片段与野生片段相差24 bp。针对这种目标片段相差小于50 bp，而又需要大样本数据的研究，改良PAGE－EB法值得考虑。
综上所述，针对一定的DNA片段(尤其是DNA片段小于50 bp)，改良PAGE－EB法更加简便、快捷、经济，值得在科学研究及临床检验中大量推广。由于未对3种方法的敏感度进行定量分析，使得结果不能更加客观、准确，有待进一步完善。其次，实验中使用荧光染料EB，EB具有强诱变性和致癌性[11]。目前已有替代EB的核酸染料，分辨率与PAGE－银染无明显差异且无毒[12]，但因价格较高而限制了在试验中的应用，相信其价值最终会被认可，用于实验研究中。
