• 点赞 0
  • 分享 0
• 重症医学 •
持续输注异丙肾上腺素对早期脓毒症大鼠心肌线粒体的保护作用及其机制
中华实用儿科临床杂志, 2015,30(6) : 425-428. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.06.007
摘要
目的

探讨持续输注不同剂量异丙肾上腺素(ISO)对早期脓毒症大鼠心肌线粒体的保护作用及其机制。

方法

30只SD雄性大鼠按随机数字表法分为5组(每组各6只)：对照组，内毒素组和ISO低、中、高剂量组。内毒素组腹腔注射脂多糖(LPS)10 mg/kg同时持续输注9 g/L盐水1 mL/h；ISO低、中、高剂量组腹腔注射LPS 10 mg/kg同时分别持续输注ISO 0.06、0.30和0.60 μg/(kg·min)；对照组腹腔注射同时持续输注与其他组等体积的9 g/L盐水。腹腔注射9 g/L盐水或LPS后24 h检测血清肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK–MB)、心肌线粒体氧化氮化应激水平和线粒体肿胀度，并观察心肌组织病理改变(HE染色)和线粒体形态学改变。

结果

与对照组比较，内毒素组CK、CK–MB、一氧化氮(NO)含量、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力和丙二醛(MDA)含量均升高(P均<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活力降低[(11.543±1.080) U/mg prot比(9.892±0.815) U/mg prot，P<0.05]；HE染色示心肌组织呈炎症改变；线粒体超微结构异常(线粒体肿胀等)。ISO干预使CK和CK–MB水平及心肌线粒体肿胀度降低(P均<0.05)，SOD活力升高(P均<0.05)；低剂量组NO含量、iNOS活力和MDA含量降低[(10.823±2.240) μmol/g prot比(7.917±2.203) μmol/g prot，(0.045±0.008) U/mg prot比(0.033±0.003) U/mg prot，(1.663±0.618) mmol/mg prot比(0.768±0.312) mmol/mg prot，P均<0.05]，中、高剂量组iNOS活力和MDA含量升高(P均<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组肿胀度升高(1.160±0.186比1.393±0.128，P<0.05)。

结论

脓毒症早期大鼠心肌和心肌线粒体受损，持续低剂量ISO输注对心肌线粒体具有保护作用，其机制可能与氧化氮化应激水平降低有关。

引用本文: 谢美燕, 项丹, 吕娟娟, 等.  持续输注异丙肾上腺素对早期脓毒症大鼠心肌线粒体的保护作用及其机制 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(6) : 425-428. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.06.007.
参考文献导出:   Endnote    NoteExpress    RefWorks    NoteFirst    医学文献王
扫  描  看  全  文

正文
作者信息
基金 0  关键词  0
English Abstract
评论
阅读 0  评论  0
相关资源
引用 | 论文 | 视频

版权归中华医学会所有。

未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。

除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。

脓毒症是严重感染引起的过度炎症反应，其涉及多种病理生理机制[1,2,3,4]。心脏是脓毒症的重要靶器官，脓毒症时心肌线粒体损伤引起氧化氮化应激增加、心肌线粒体形态异常[5,6]。异丙肾上腺素(ISO)是一种典型的合成儿茶酚胺，在心血管功能调控中发挥关键作用[7]。然而，ISO对心肌组织的作用，目前研究较少。本研究通过观察持续静脉输注不同剂量ISO对脓毒症大鼠心脏生化指标、心肌病理改变及心肌线粒体肿胀度、超微结构和氧化氮化应激因子的影响，探讨ISO对脓毒症大鼠心肌线粒体的保护作用及其机制，为ISO在临床应用脓毒症的早期保护性治疗提供依据。

1　材料与方法
1.1　实验动物和模型建立

清洁级SD雄性大鼠30只(中山大学医学实验动物中心提供，动物批号：44008500003278)，体质量250～300 g，实验前禁食12 h，自由饮水。30只大鼠编号后采用随机数字表法分为5组，每组6只，称重；静脉置管24 h后腹腔注射脂多糖(LPS) 10 mg/kg建立脓毒症模型或腹腔注射等体积9 g/L盐水建立对照组。内毒素组腹腔注射LPS 10 mg/kg同时持续输注9 g/L盐水1 mL/h；ISO干预组腹腔注射LPS 10 mg/kg的同时，分别持续输注ISO 0.06(低剂量组)、0.30(中剂量组)和0.60(高剂量组) μg/(kg·min)；对照组腹腔注射同时持续输注与其他组等体积的9 g/L盐水。观察终点为腹腔注射9 g/L盐水或LPS后24 h。

1.2　药品与试剂

盐酸ISO注射液(上海禾丰制药有限公司)；大肠埃希菌脂多糖(美国Sigma公司)；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)检测试剂盒(南京建成生物有限公司)；线粒体提取液(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.3　方法

[8]　行右颈外静脉置管，于观察终点(腹腔注射9 g/L盐水或LPS后24 h)采血1 mL。血标本室温静置1～2 h，3000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min分离血清，全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK–MB)水平。按文献[8]提取线粒体，将分离的线粒体重悬于线粒体提取液成为混悬液A并调节混悬液A的颗粒数至1×109/L[9]。取混悬液A 500 μL，与荧光染料JC–1 1.5 μL混匀后37 ℃避光孵育15 min，取上清液进行流式细胞仪分析，结果采用前向角和侧向角平均荧光强度的比值(FSC/SSC)表示线粒体肿胀度[10]。迅速取一小块心肌组织(1 cm3)切成1 mm3大小，制作电镜图片观察心脏线粒体超微结构。另取一小块心肌组织制作病理图片观察心肌病理改变。提取心肌线粒体(方法同前)，按照SOD、MDA、NO和NOS检测试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书进行检测，最后在酶标仪上直接读出各标本的A值并计算其浓度。

1.4　统计学处理

数据用SPSS 20.0统计软件分析，以±s表示。多样本间均数的比较采用One–Way ANOVA分析；均数两两比较时，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　血清CK和CK–MB水平变化

与对照组比较，内毒素组CK和CK–MB水平均升高(P均<0.05)；ISO干预使CK和CK–MB水平均降低(P均<0.05)，见表1。

点击查看表格
表1

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠血清CK、CK–MB水平比较(U/L，±s)

Table 1

Comparison of the serum CK and CK–MB content among control group，endotoxin group and ISO intervene group(U/L，±s)

表1

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠血清CK、CK–MB水平比较(U/L，±s)

Table 1

Comparison of the serum CK and CK–MB content among control group，endotoxin group and ISO intervene group(U/L，±s)

组别例数CKCK–MB
对照组6209.330±66.331429.000±90.069
内毒素组6485.000±137.885a723.000±88.778a
ISO低剂量组6241.330±100.023b362.000±70.011b
ISO中剂量组6318.670±135.054b400.000±149.241b
ISO高剂量组6252.000±63.937b372.330±148.372b
F值 1.5790.710
P值 0.2110.593

注：ISO：异丙肾上腺素；CK：肌酸激酶；CK–MB：肌酸激酶同工酶；与对照组比较，aP<0.05；与内毒素组比较，bP<0.05　ISO：Isoproterenol；CK：creatine kinase；CK–MB：creatine kinase isoenzyme；compared with control group，aP<0.05; compared with endotoxin goup，bP<0.05

2.2　线粒体氧化应激因子水平变化
2.2.1　NO含量变化

与对照组比较，内毒素组NO含量升高(P<0.05)；与内毒素组比较，ISO干预使NO含量降低(P均<0.05)，见表2。

点击查看表格
表2

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠心脏线粒体NO含量、iNOS活力比较(±s)

Table 2

Comparison of the heart mitochondrion NO content and iNOS activity among control group，endotoxin group and ISO intervene group(±s)

表2

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠心脏线粒体NO含量、iNOS活力比较(±s)

Table 2

Comparison of the heart mitochondrion NO content and iNOS activity among control group，endotoxin group and ISO intervene group(±s)

组别例数NO含量(μmol/g prot)iNOS活力(U/mg prot)
对照组68.300±0.7400.031±0.008
内毒素组610.823±2.240a0.045±0.008a
ISO低剂量组67.917±2.203b0.033±0.003b
ISO中剂量组66.117±0.972b0.077±0.010bc
ISO高剂量组67.205±1.412b0.089±0.010bc
F值 0.9251.034
P值 0.4650.410

注：ISO：异丙肾上腺素；NO：一氧化氮；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；与对照组比较，aP<0.05；与内毒素组比较，bP<0.05；与ISO低剂量组比较，cP<0.05　ISO：Isoproterenol；NO：nitric oxide；iNOS：inducible nitric oxide synthase；compared with control group，aP<0.05; compared with endoto–xin goup，bP<0.05; compared with ISO small–dose group，cP<0.05

2.2.2　诱导型NOS(iNOS)活力变化

与对照组比较，内毒素组iNOS活力升高(P<0.05)；与内毒素组比较，ISO低剂量组iNOS活力降低(P<0.05)；与内毒素组和ISO低剂量组比较，ISO中、高剂量组iNOS活力升高(P均<0.05)，见表2。

2.2.3　SOD活力变化

与对照组比较，内毒素组SOD活力降低(P<0.05)；与内毒素组比较，ISO干预使SOD活力升高(P均<0.05)；与ISO低剂量组比较，ISO中、高剂量组SOD活力升高(P均<0.05)，见表3。

点击查看表格
表3

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠心脏线粒体SOD活力和MDA含量比较(±s)

Table 3

Comparison of the heart mitochondrion SOD activity and MDA content among control group，endotoxin group and ISO intervene group(±s)

表3

对照组和内毒素组及各ISO干预组大鼠心脏线粒体SOD活力和MDA含量比较(±s)

Table 3

Comparison of the heart mitochondrion SOD activity and MDA content among control group，endotoxin group and ISO intervene group(±s)

组别例数总SOD活力(U/mg prot)MDA含量(nmol/mg prot)
对照组611.543±1.0800.950±0.195
内毒素组69.892±0.815a1.663±0.618a
ISO低剂量组611.822±0.460b0.768±0.312b
ISO中剂量组619.802±1.309bc1.203±0.167bc
ISO高剂量组619.737±1.215bc1.728±0.250acd
F值 1.4981.792
P值 0.2330.162

注：ISO：异丙肾上腺素；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；与对照组比较，aP<0.05；与内毒素组比较，bP<0.05；与ISO低剂量组比较，cP<0.05；与ISO中剂量组比较，dP<0.05　ISO：Isoproterenol；SOD：superoxide dismutase；MDA：malondialdehyde；compared with control group，aP<0.05; compared with endotoxin goup，bP<0.05; compared with ISO small–dose group，cP<0.05; compared with ISO medium–dose group，dP<0.05

2.2.4　MDA含量变化

与对照组比较，内毒素组MDA含量升高(P<0.05)；与内毒素组比较，ISO低、中剂量组MDA含量降低(P均<0.05)；与ISO低剂量比较，ISO中剂量组MDA含量升高(P<0.05)；与对照组和ISO低、中剂量组比较，ISO高剂量组MDA含量升高(P均<0.05)，见表3。

2.3　线粒体肿胀度和超微结构变化
2.3.1　肿胀度变化

内毒素组，ISO低剂量组，ISO中剂量组，ISO高剂量组和对照组之间肿胀度比较差异无统计学意义(F＝0.466，P＝0.761)；与内毒素组(1.690±0.148)比较，ISO干预使线粒体肿胀度降低(P均<0.05)；与对照组(1.537±0.109)和ISO低剂量组(1.506±0.116)比较，ISO中剂量组肿胀度降低(1.160±0.186)(P均<0.05)；与ISO中剂量组比较，ISO高剂量组肿胀度升高(1.393±0.128)(P<0.05)。

2.3.2　线粒体超微结构变化

对照组线粒体大小正常，排列整齐。内毒素组线粒体异常，表现为肿胀、大小不一，线粒体嵴断裂，出现空泡、融合等现象。ISO低、中剂量组线粒体结构相比内毒素组明显改善，高剂量组线粒体出现肿胀、嵴断裂等异常，见图1。

点击查看大图
图1
各组大鼠24 h心肌线粒体超微结构变化(×30 000)
Figure 1
The morphologic changes of the heart mitochondrion in each group(×30 000)
点击查看大图

注：ISO：异丙肾上腺素；A：对照组；B：内毒素组：线粒体肿胀，嵴断裂(白色箭头)，膜融合(黑色箭头)；C：内毒素组，出现空泡(黑色箭头)；D：ISO低剂量组；E：ISO中剂量组；F：ISO高剂量组：线粒体异常(黑色箭头)　ISO：Isoproterenol；A：control group; B：endotoxin group：crista fragmentation (white arrow)and membrane fusion (black arrow)were seen in the mitochondrion，the mitochondria were swollen; C：endotoxin group：vacuolus in mitochondrion were observed (black arrow); D：ISO small–dose group; E：ISO medium–dose group; F：ISO large–dose group：abnormal mitochondrion were observed (black arrow)

图1
各组大鼠24 h心肌线粒体超微结构变化(×30 000)
Figure 1
The morphologic changes of the heart mitochondrion in each group(×30 000)
2.4　心肌病理改变

对照组心肌排列整齐，未见异常。内毒素组心肌组织疏松水肿，内见淋巴细胞浸润和红细胞渗出，提示炎性反应；ISO低、中剂量组心肌炎性反应减轻；ISO高剂量组见炎性渗出，见图2。

点击查看大图
图2
各组大鼠心肌病理改变(HE染色)
Figure 2
The pathological changes of the heart mitochondrion in each group(HE staining)
点击查看大图

注：ISO：异丙肾上腺素；A：对照组(×100)；B：内毒素组：组织疏松水肿，淋巴细胞浸润，红细胞渗出，提示炎症反应(×400)；C：ISO低剂量组：轻微水肿(×400)；D：ISO中剂量组：轻微水肿，细胞规则，未见红细胞(×400)；E：ISO高剂量组：轻微水肿，炎症反应(×400)　ISO：Isoproterenol；A：control group(×100); B：endotoxin group：tissue were loose structured and edema with lymphocytes infiltration and erythrocyte diapedesis，indicating inflammatory responses(×400); C：ISO small–dose group：mild edema were seen(×400); D：ISO medium–dose group：mild edema and regularly arrayed cells were seen，while no erythrocytes were seen(×400); E：ISO large–dose group：mild edema were seen，indicating inflammatory responses(×400)

图2
各组大鼠心肌病理改变(HE染色)
Figure 2
The pathological changes of the heart mitochondrion in each group(HE staining)
3　讨论

心肌线粒体损伤是脓毒症相关性心脏损伤的重要环节，其机制包括氧化氮化应激、炎症应答、钙超载、线粒体DNA(mtDNA)损伤和凋亡等诸多方面[11,12]。内毒素刺激使心肌线粒体肿胀度和心肌损伤标志物水平升高，心肌HE染色见炎症改变，电镜观察见线粒体肿胀、大小不一、嵴断裂等损伤表现，提示心肌和心肌线粒体受损，心肌线粒体处于氧化氮化应激状态，氧化氮化应激可能是脓毒症心肌和心肌线粒体损伤的重要原因之一[13]。ISO低、中剂量组CK、CK–MB水平降低，心肌病理和线粒体超微结构改变明显改善，表明低、中剂量ISO干预可能减轻心肌和心肌线粒体损伤。

研究表明，ISO反复应用(ISO 100 mg/kg，5 d, 1次/d)可引起小鼠心肌损伤和纤维化，出现左心室(LV)顺应性降低、LV充盈压显著升高、存活心肌细胞肥大[14]。研究证明ISO持续干预可引起心肌细胞氧化氮化应激和促炎细胞因子合成[15]。研究表明NO、肾上腺素受体和氧化应激之间存在"交互谈话"，活性氧(ROS)生成过度或抗氧化能力减弱可导致ROS诱导性NO生物利用度降低[16,17]。此外，Davel等[18]利用β2–基因敲除大鼠研究氧化应激与NO的关系，发现β2–基因敲除可降低ROS诱导性NO损害。ISO结构上类似于内源性儿茶酚胺，其是一种强烈的非选择性β受体激动剂。一项体内研究通过观察ISO(10 mg/kg腹腔注射)对LPS诱导性促炎性介质和抗炎性介质生成的影响，发现ISO除了具有血流动力学作用，还可通过调节LPS诱导性炎性反应发挥功效，具有抗感染、抗休克功能[19]。本研究持续静脉输注不同剂量ISO干预大鼠，使用剂量比上述研究所使用的ISO剂量低得多，持续时间也更短，结果显示ISO中、高剂量组氧化氮化应激水平显著升高；ISO高剂量组心肌线粒体肿胀度显著升高，心肌HE染色示炎性反应，电镜下心肌线粒体肿胀、嵴断裂等异常改变。表明持续输注ISO 0.30和0.60 μg/(kg·min)1 d即可引起心肌和心肌线粒体损伤，而持续静脉输注ISO 0.06 μg/(kg·min)可改善LPS诱导性心肌和心肌线粒体损伤。综上所述，低剂量ISO对心肌和心肌线粒体有保护作用，中、高剂量ISO则引起损伤。

总之，早期脓毒症时心肌/心肌线粒体损伤与心肌损伤指标(CK和CK–MB)、氧化氮化应激水平(NO含量、iNOS活力和MDA含量)升高及抗氧化水平(SOD活力)降低有关。持续输注低剂量ISO可能通过抑制LPS诱导性氧化氮化应激水平、升高抗氧化应激水平减轻炎性反应发挥显著抗氧化氮化应激作用，从而减轻心肌和心肌线粒体损伤。

参考文献
[1]
DellingerRP，LevyMM，RhodesA，et al.Surviving sepsis campaign：international guidelines for management of severe sepsis and septic shock：2012[J]．Crit Care Med，2013，41(2)：580–637.
[2]
武宇辉，李成荣，李秋．微小RNA在脓毒症中免疫调控的研究进展[J]．国际儿科学杂志，2012，39(1)：49–53.
[3]
于丹，杨宇平，钟强，等．阿托伐他汀对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用[J]．新乡医学院学报，2013，30(4)：262–265.
[4]
杜娟，白云升，高伟良，等．血清甲状腺激素水平对脓毒症休克患者的预后评估[J]．新乡医学院学报，2012，29(1)：55–56.
[5]
ZangQS，WolfSE，MineiJP.Sepsis–induced cardiac mitochondrial damage and potential therapeutic interventions in the elderly[J]．Aging Dis，2014，5(2)：137–149.
[6]
PulidoJN，AfessaB，MasakiM，et al.Clinical spectrum，frequency，and significance of myocardial dysfunction in severe sepsis and septic shock[J]．Mayo Clin Proc，2012，87(7)：620–628.
[7]
FrazierWJ，XueJ，LuceWA，et al.MAPK signaling drives inflammation in LPS–Stimulated cardiomyocytes：the route of crosstalk to G–protein–coupled receptors[J]．PLoS One，2012，7(11)：e50071.
[8]
吴丹，曾其毅．持续去甲肾上腺素输注对早期脓毒症大鼠的保护作用[J]．中国小儿急救医学，2013，20(1)：73–77.
[9]
GroeningP，HuangZ，La GammaEF.Glutamine restores myocardial cytochrome coxidase activity and improves cardiac function during experimental sepsis[J]．JPEN J Parenter Enteral Nutr，2011，35(2)：249–254.
[10]
DingF，ShaoZW，YangSH，et al.Role of mitochondrial pathway in compression–induced apoptosis of nucleus pulposus cells[J]．Apoptosis，2012，17(6)：579–590.
[11]
车頔，宋远斌，王阳，等．microRNA在脓毒症患儿线粒体功能障碍的研究进展[J]．中华实用儿科临床杂志，2013，28(6)：459–461.
[12]
商明霞，韩笑，尹晓娟．严重脓毒症心脏结构改变的研究进展[J]．中国小儿急救医学，2014，21(7)：455–457.
[13]
SingerM．The role of mitochondrial dysfunction in sepsis–induced mul–tiorgan failure[J]．Virulence，2014，5(1)：66–72.
[14]
BrooksWW，ConradCH.Isoproterenol–induced myocardial injury and diastolic dysfunction in mice：structural and functional correlates[J]．Comp Med，2009，59(4)：339–343.
[15]
DavelAP，BrumPC，RossoniLV.Isoproterenol induces vascular oxidative stress and endothelial dysfunction via a Giα–coupled β2–adrenoceptor signaling pathway[J]．PLoS One，2014，9(3)：e91877.
[16]
ContiV，RussomannoG，CorbiG，et al.Adrenoreceptors and nitric oxide in the cardiovascular system[J]．Front Physiol，2013，4(4)：321.
[17]
PuriR，LiewGY，NichollsSJ，et al.Coronary (2)–adrenoreceptors mediate endothelium–dependent vasoreactivity in humans：novel insights from an in vivo intravascular ultrasound study[J]．Eur Heart J，2012，33(4)：495–504.
[18]
DavelAP，CeravoloGS，WenceslauCF，et al.Increased vascular contractility and oxidative stress in beta(2)–Adrenoceptor knockout mice：the role of NADPH oxidase[J]．J Vasc Res，2012，49(4)：342–352.
[19]
SzabóC，HaskóG，ZingarelliB，et al.Isoproterenol regulates tumour necrosis factor，interleukin–10，interleukin–6 and nitric oxide production and protects against the development of vascular hyporeactivity in endotoxaemia[J]．Immunology，1997，90(1)：95–100.
　
　
展开/关闭提纲
查看图表详情
回到顶部
放大字体
缩小字体
标签
关键词
异丙肾上腺素
脂多糖
脓毒症
氧化应激
线粒体
线粒体肿胀
大鼠
氧化氮
心肌线粒体
保护作用