探讨脓毒症相关性脑病(SAE)远期脑线粒体损伤与氧化应激的关系。
通过腹腔注射革兰阴性菌脂多糖(LPS)建立脓毒症模型。出现SAE症状的大鼠(SAE组)及对照组大鼠分别在相应时间点进行神经反射评估后处死，取脑组织提取线粒体。通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)及活性氧(ROS)，通过酶标仪检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平。
神经反射评估在12 h已经开始下降，并缓慢恢复。MMP在腹腔注射LPS后明显下降，48 h降至最低，差异有统计学意义(F＝75.785，P<0.05)，72 h部分恢复；ROS 48 h明显升高伴随SOD的明显下降，差异均有统计学意义(F＝111.274，21.808，P均<0.05)，72 h部分恢复；MDA、iNOS和NO 48 h增加达到峰值，差异均有统计学意义(F＝21.955、61.076、21.184，P均<0.05)，72 h部分恢复。脓毒症大鼠脑组织线粒体SOD活性与MMP呈强正相关关系(r＝0.856，P<0.05)；脓毒症大鼠脑组织线粒体ROS水平、MDA水平、iNOS活性和NO水平与MMP呈强负相关关系(r＝–0.852、–0.890、–0.940、–0.794，P均<0.05)。
在SAE模型中，脑线粒体损伤的高峰可能发生在48 h左右，氧化应激的明显增强可能是导致远期线粒体功能障碍的原因之一。
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脓毒症定义为感染引起的全身炎性反应综合征，证实有细菌存在或有高度可疑的感染灶[1]。儿童脓毒症是儿科常见的危急重症，其高发病率及病死率，已成为当今社会严重的社会卫生问题。美国儿童流行病学资料显示，2005年有75 255例儿童患严重脓毒症，且患病率呈逐年增长趋势[2]。脓毒症相关性脑病(SAE)指的是缺乏中枢神经系统感染的临床或实验室证据，由全身炎性反应引起的弥散性脑功能障碍[3]。SAE越严重，病死率越高。脓毒症尤其是SAE的存活者值得特殊关注，因为很多患者并未完全康复，常有认知功能下降。另外一项研究也发现，44%的SAE儿童认知评分低于健康儿童25个百分点，而14%的SAE儿童需要进入特殊学校进行学习[4]。因此需要深入探讨SAE的发病机制。研究表明，氧化应激、能量代谢及线粒体功能障碍在SAE中起重要作用[5]。脓毒症时线粒体内活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)以及过氧亚硝酸盐明显增多，引起氧化应激，导致线粒体功能损害，而线粒体功能障碍会进一步加剧氧化应激[6]，最终导致器官障碍。氧化应激与SAE进展相关，但是与远期脑线粒体功能障碍关系尚不明确。本研究探讨SAE远期线粒体功能障碍与氧化应激的关系，为了解SAE的远期功能损伤的机制，提高SAE患儿的脑功能恢复及降低病死率提供理论依据。
SPF级雄性Wistar大鼠(南方医科大学实验动物中心提供)，体质量250～300 g，通过随机数字表法分为脓毒症组(100只)和对照组(8只)。通过腹腔注射革兰阴性菌脂多糖(LPS) 10 mg/kg建立脓毒症大鼠模型[7]。产生全身炎性反应并影响脑功能，表现为精神反应差、嗜睡、烦躁不安等精神状态改变的大鼠作为SAE组，分别在12 h、24 h、48 h和72 h处死(每个时间点8只)，取脑组织备用。对照组8只给予9 g/L盐水10 mg/kg腹腔注射后(0 h)处死，取脑组织作为对照组标本备用。大鼠处死前进行神经反射评估。神经反射评估参照文献[8]的研究，评价大鼠耳廓反射、角膜反射、翻正反射、尾部反射和逃避反射改变。
革兰阴性菌LPS(Escherichia coli 0111：B4)购于美国Sigma公司；线粒体分离使用线粒体/胞浆(胞质)制备试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；ROS检测试剂盒购于美国Genmed Scientifics公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和NO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；荧光染料四乙基苯并咪唑基羰化青碘(5，5'，6，6'–tetrachloro–1，1'，3，3'–tetraethylbenzimi–dazolcarbocyanine iodide，JC–1)购于海门碧云天生物技术研究所。FACSAria流式细胞仪(美国BD公司)检测荧光，使用ND1000酶标仪(美国NanoDrop公司)。
将200 mg脑组织剪碎后加入1.5 mL预冷的Mito solution，上下研磨组织20次，匀浆液800×g至12 000×g 4 ℃离心5 min差速离心后，线粒体沉淀在管底。使用RIPA裂解缓冲液裂解线粒体，BCA法测定蛋白浓度后备用。
JC–1是一种广泛用于检测MMP的理想荧光探针。将0.9 mL 5倍稀释的JC–1染色工作液中加入0.1 mL总蛋白量为50 μg纯化的线粒体中，室温反应10 min后放入流式细胞仪。采用常规绿色荧光(FITC–H)和红色荧光(PI–H)进行检测，以红色荧光强度/绿色荧光强度计算膜电位[9]。
在氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM–H2DCFDA)反应液中加入50 μL总蛋白量为50 μg纯化的线粒体，37 ℃避光反应10 min后放入流式细胞仪进行检测。以平均荧光强度表示ROS水平。
按照SOD、MDA、NO和一氧化氮合成酶(NOS)检测试剂盒说明书进行。将线粒体蛋白加入反应液进行反应，酶标仪上设置不同的检测波长读出OD值，根据公式计算出酶活性或浓度。
应用SPSS 20.0软件分析，结果以
±s表示。多样本间均数比较采用单因素方差分析(One–Way ANOVA)，并用Tukey法进行两两比较，2组数据相关性采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
对照组大鼠神经反射评分基本正常。SAE组大鼠神经反射评分均明显低于对照组。造模成功后12 h，神经反射评估已经明显下降，随后开始缓慢恢复，72 h仍未完全恢复至正常，见表1。
大鼠神经反射评估和线粒体膜电位结果(
±s)
Results of rat neurologic reflex scores and mitochondrial membrane potential in rat with sepsis(
±s)
大鼠神经反射评估和线粒体膜电位结果(±s)
Results of rat neurologic reflex scores and mitochondrial membrane potential in rat with sepsis(±s)
| 时间点 | 只数 | 神经反射评估(分) | 线粒体膜电位 |
|---|---|---|---|
| 0 h | 8 | 10.00±0.00 | 1.48±0.08 |
| 12 h | 8 | 6.50±0.19a | 1.19±0.03a |
| 24 h | 8 | 6.75±0.37a | 0.71±0.06a |
| 48 h | 8 | 7.13±0.30a | 0.34±0.04a |
| 72 h | 8 | 7.75±0.16a | 0.86±0.11ab |
| F值 | 35.000 | 75.785 | |
| P值 | 0.000 | 0.000 |
注：a与0 h比较，P<0.05；b与48 h比较，P<0.05 a Compared with 0 h，P<0.05；b compared with 48 h，P<0.05
大鼠脑组织MMP从12 h开始下降，48 h降至最低，与对照组0 h相比，差异有统计学意义(F＝75.785，P＝0.000)，72 h MMP恢复，与48 h相比差异有统计学意义(P＝0.037)，但仍然低于对照组0 h，差异有统计学意义，见表1。
大鼠脑组织线粒体ROS、MDA、iNOS和NO从12 h开始升高，48 h升至最高，与对照组0 h相比，差异有统计学意义(P<0.05)，72 h线粒体ROS、MDA、iNOS和NO部分恢复，与48 h组相比差异有统计学意义(P<0.05)，但仍然高于对照组0 h，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
大鼠脑组织线粒体氧化应激因子ROS、SOD、MDA、iNOS和NO检测结果(
±s)
Detection results of mitochondrial ROS，SOD，MDA，iNOS and NO in rat brain(
±s)
大鼠脑组织线粒体氧化应激因子ROS、SOD、MDA、iNOS和NO检测结果(±s)
Detection results of mitochondrial ROS，SOD，MDA，iNOS and NO in rat brain(±s)
| 时间点 | 只数 | ROS(RFU) | SOD(U/mg prot) | MDA(nmol/mg prot) | iNOS(U/mg prot) | NO(μmol/mg prot) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 h | 8 | 148.00±10.97 | 108.54±4.09 | 5.56±0.92 | 0.95±0.15 | 9.81±0.50 |
| 12 h | 8 | 361.00±16.37a | 80.60±3.45a | 9.39±0.63a | 1.85±0.11a | 13.62±0.74a |
| 24 h | 8 | 434.00±22.81a | 63.96±5.68a | 12.28±0.73a | 3.21±0.21 | 15.74±1.01a |
| 48 h | 8 | 533.00±24.64a | 36.31±8.10a | 15.65±0.87a | 4.06±0.18a | 18.84±0.64a |
| 72 h | 8 | 354.00±21.55ab | 74.86±15.00ab | 10.00±0.78ab | 3.12±0.11ab | 13.36±0.61ab |
| F值 | 111.274 | 21.808 | 21.955 | 61.076 | 21.184 | |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
注：ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；iNOS：诱导型一氧化氮合成酶；NO：一氧化氮；a与0 h比较，P<0.05；b与48 h比较，P<0.05 ROS：reactive oxygen species；SOD：supe–roxide dismutase；MDA：malondialdehyde；iNOS：inducible nitric oxide synthase；NO：nitric oxide；a compared with 0 h，P<0.05；b compared with 48 h，P<0.05
大鼠脑组织线粒体SOD从12 h开始下降，48 h降至最低，与对照组0 h相比，差异有统计学意义(P<0.05)，72 h线粒体SOD部分恢复，与48 h组相比差异有统计学意义(P<0.05)，但仍然低于对照组0 h，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
脓毒症大鼠脑组织线粒体SOD活性与MMP呈强正相关关系(r＝0.856，P<0.05)；脓毒症大鼠脑组织线粒体ROS水平、MDA水平、iNOS活性和NO水平与MMP呈强负相关关系(r＝–0.852、–0.890、–0.940、–0.794，P均<0.05)。
脓毒症可以明显抑制线粒体功能，氧化磷酸化系统的失调会导致能量代谢受损，包括过度产生的ROS以及MMP水平的下降[10]，而明显增多的ROS可以加速MMP去极化[11]，最终诱导细胞死亡。本研究建立SAE模型，并进行神经反射评估，发现SAE组评分较对照组明显降低，且恢复缓慢，与临床中患儿出院后认知评分降低，仍残留部分认知损害一致[3]。本研究还通过检测MMP的变化，反映线粒体功能受损情况。结果提示SAE组大鼠脑组织线粒体损伤进展迅速，24 h膜电位即降至正常的一半，同时存在一个低谷期，48 h膜电位降至最低值，72 h膜电位已经部分恢复，但是仍然较对照组低，提示线粒体功能损伤存在折点，恢复需要一个过程。最近的一项研究发现，脓毒症通过磷酸化激活UCP3，可以增加质子漏。质子漏的明显增多，降低线粒体在膜间隙形成的H＋梯度，也会导致MMP的下降。
不同的脓毒症模型以及脓毒症患者均可见氧化性损伤，且与ROS和活性氮生成增加及抗氧化系统水平下降密切相关[5]。SAE一个重要的特征是iNOS的产生。这些酶的活性可维持好几天，导致NO介导的细胞死亡和组织损伤[12]。虽然氧化应激在脓毒症的发展过程中起重要作用，但是脓毒症中枢神经系统功能障碍与氧化应激的关系仍不明了。Abd El–Gawad和Khalifa[13]发现，注射LPS 2 h后，大鼠脑组织就出现自由基生成增加，但未深入研究LPS注射后更长时间氧化应激的变化。因此，通过本研究发现SAE大鼠脑线粒体ROS明显增多，48 h达到高峰，随后出现下降，而SOD的变化过程与之相反，提示鼠脑线粒体氧化应激增强，伴随脂质过氧化反应增强，MDA生成增多。反映活性氮族的指标iNOS及NO也出现随时间变化的趋势，48 h达到最高，随后逐渐恢复。Zhou等[14]研究也证实盲肠结扎穿孔术后氧化应激持续48 h，但是没有发现氧化应激的高峰期。
近年来的研究指出，氧化应激可能是脓毒症多器官障碍的重要原因之一，而线粒体又是脓毒症病程中最易遭受氧化应激损伤的细胞器[15]，因而氧化应激可能与脓毒症大鼠脑组织线粒体损伤密切相关。本研究发现，MMP与ROS、SOD、MDA、NO和iNOS均呈强相关，其中MMP与iNOS的负相关系数最高(r＝–0.940，P<0.05)，与SOD则呈正相关(r＝0.856，P<0.05)。
总之，本研究通过建立SAE模型，发现SAE大鼠脑线粒体损伤的高峰可能发生在48 h左右，氧化应激的明显增强可能是导致远期线粒体功能障碍的原因之一。因此推测在脓毒症早期进行干预，清除氧自由基，抑制氧化应激反应，可能是未来脓毒症治疗的方向之一。
