邵静波; 吴伟; 李玲玲; 吕志葆

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.15.009

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• 血液/肿瘤疾病 •

13－顺式维甲酸体外诱导3种神经母细胞瘤细胞株分化研究

中华实用儿科临床杂志, 2015,30(15) : 1152-1156. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.15.009

摘要

目的

探讨13－顺式维甲酸(13－cis RA)体外对3种人神经母细胞瘤(NB)细胞株生长的影响及其作用机制。

方法

常规培养SH－SY5Y、SK－N－SH和SK－N－BE2细胞株，荧光原位杂交技术(FISH)检测3种细胞MYCN基因扩增情况。不同浓度13－cis RA作用后，采用相差显微镜观察细胞形态变化，酶联免疫吸附法测定细胞培养液神经元特异性烯醇化酶(NSE)，细胞增殖毒性检测法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

结果

13－cis RA作用后，3种细胞均伸出多个轴突树突状突起，呈极性化改变，出现细胞分化。FISH检测结果显示，SK－N－BE2细胞为MYCN扩增阳性，13－cis RA作用后MYCN仍扩增阳性，另2种细胞株未见扩增。3种细胞经不同浓度13－cis RA作用后NSE水平随药物作用时间延长而升高，其中SK－N－BE2细胞NSE水平显著升高，差异均有统计学意义(F＝27.00，P<0.000 1)。13－cis RA作用48 h内均促进细胞增殖，随后转为抑制细胞生长。SH－SY5Y细胞经10 μmol/L 13－cis RA作用96 h及120 h显著增加细胞凋亡(F＝16.21，P＝0.011；F＝16.04，P＝0.016)；SK－N－SH细胞经1 μmol/L及10 μmol/L 13－cis RA作用48 h，细胞凋亡均显著增加(F＝15.05，P＝0.012；F＝31.18，P＝0.005)；SK－N－BE2细胞经不同浓度13－cis RA(1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)作用120 h细胞凋亡均显著增加(F＝9.05，P＝0.030；F＝11.38，P＝0.028；F＝7.88，P＝0.041)。

结论

13－cis RA体外能显著诱导NB细胞分化，作用48 h内促进细胞增殖，随后表现为抑制细胞生长，促进细胞凋亡。13－cis RA对MYCN扩增阳性的细胞在DNA检测水平无改善，提示可能需要联合用药。

引用本文: 邵静波, 吴伟, 李玲玲, 等. 13－顺式维甲酸体外诱导3种神经母细胞瘤细胞株分化研究 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(15) : 1152-1156. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.15.009.

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诱导分化可使肿瘤细胞部分或全部恢复分化潜能，为当今肿瘤研究的热点问题。神经母细胞瘤(NB)存在自然退化现象，但具体机制尚未阐明。维甲酸(RA)是目前最常用的诱导分化剂，本研究通过观察13－顺式RA(13－cis RA)体外诱导3种NB细胞株分化的不同特点及其对细胞生长的影响，为13－cis RA更好应用临床提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　人NB细胞株

SK－N－SH细胞系购自中国科学院上海细胞研究所，SK－N－BE2、SH－SY5Y分别为上海交通大学附属新华医院及复旦大学附属儿科医院惠赠。

1.1.2　主要试剂

13－cis RA购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国MP公司，Dulbecco MEM(DMEM)培养基购自美国Gibco公司，细胞增殖毒性检测(CCK－8)试剂购自日本同仁化学研究所，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国B－D公司。

1.2　实验方法

1.2.1　细胞培养

细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、50 mL/L二氧化碳(CO₂)、100%湿度的培养箱中孵育培养，每2、3 d换液1次，当细胞覆盖瓶底面积80%以上传代。

1.2.2　实验分组

取对数生长期的细胞，接种培养24 h后分为5组，包括仅加培养液的对照组及1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L 13－cis RA处理组。

1.2.3　荧光原位杂交技术(FISH)

采用FISH检测3种细胞MYCN基因扩增情况以及SK－N－BE2细胞经13－cis RA 1 μmol/L作用168 h(7 d)后MYCN基因扩增情况。

1.2.4　相差显微镜观察细胞形态

将细胞接种于12孔板，分别于13－cis RA处理后24～168 h(1～7 d)每24 h用相差显微镜下观察细胞形态改变。

1.2.5　细胞培养上清液神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平的测定

将细胞接种于6孔板，分别于13－cis RA处理24、48、72 h后提取上清液，酶联免疫吸附法(ELISA)测定NSE水平，期间不换培养液。

1.2.6　CCK－8检测细胞增殖与活力

将细胞接种于96孔板，每组设3个复孔。设置实验孔As(含有细胞的培养基、13－cis RA、CCK－8)、对照孔Ac(含有细胞的培养基、CCK－8，无13－cis RA)、空白孔Ab(培养基、CCK－8，无细胞及13－cis RA)，分别处理24～72 h后酶标仪下测各孔吸光度值(A值)。按以下公式计算细胞存活：细胞存活率＝A(As－Ab)/A(Ac－Ab)×100%^[1]。

1.2.7　流式细胞仪检测细胞凋亡

将细胞接种于12孔板，分别处理24～120 h，每24 h收集细胞，在流式细胞仪用Annexin V/碘化丙啶(PI)染色法检测细胞凋亡。

1.3　统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析(One－way ANOVA)，2组均数间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　3种NB细胞MYCN基因扩增情况

采用FISH检测MYCN基因扩增：SH－SY5Y及SK－N－SH细胞MYCN基因未见扩增，SK－N－BE2细胞为MYCN扩增阳性。SK－N－BE2细胞采用13－cis RA 1 μmol/L作用168 h后FISH检测MYCN扩增仍为阳性，阳性细胞数量未见减少。扩增情况见图1。

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图1

SH－SY5Y、SK－N－SH　和SK－N－BE2细胞采用荧光原位杂交技术检测MYCN基因扩增情况

Figure 1

The status of MYCN gene amplification was detected by fluorescence in situ hybridization in SH－SY5Y，SK－N－SH and SK－N－BE2 cells

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注：A：SH－SY5Y细胞MYCN扩增阴性；B：SK－N－SH细胞MYCN扩增阴性；C：SK－N－BE2细胞MYCN扩增阳性；D：SK－N－BE2细胞13－顺式维甲酸作用后MYCN扩增阳性　A，B：MYCN amplification－null in SH－SY5Y and SK－N－SH cells；C：MYCN amplification in SK－N－BE2 cell；D：MYCN still amplification in SK－N－BE2 cell after 13－cis retinoic acid treatment

图1

SH－SY5Y、SK－N－SH　和SK－N－BE2细胞采用荧光原位杂交技术检测MYCN基因扩增情况

Figure 1

The status of MYCN gene amplification was detected by fluorescence in situ hybridization in SH－SY5Y，SK－N－SH and SK－N－BE2 cells

2.2　相差显微镜观察细胞生长形态

13－cis RA作用后细胞形态均发生变化，见图2。SH－SY5Y细胞呈梭形，胞体较小，边缘清晰，生长速度在3种细胞中最快。经13－cis RA作用后从胞体生长出多个神经突起，类似神经元轴突。SK－N－BE2细胞形态多样，往往聚集，形成团块样。经13－cis RA作用后细胞逐渐散开生长，呈极性状，伸出多个轴突突起，在3种细胞中变化最大。SK－N－SH细胞呈梭形、圆形、多角形等不规则形态，经药物处理后细胞呈极性状，伸出多个轴突状突起，胞体逐渐变小变圆。3种细胞随着药物浓度增大及作用时间延长，生长减缓。

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图2

SH－SY5Y、SK－N－BE2　和SK－N－SH细胞经13－cis RA作用后相差显微镜观察细胞形态变化(×200)

Figure 2

Morphological changes after 13－cis RA treatment in SH－SY5Y，SK－N－BE2 and SK－N－SH cells (×200)

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注：13－cis RA：13－顺式维甲酸；A：SH－SY5Y细胞13－cis RA 5 μmol/L作用后细胞形态(A1、A2、A3、A4分别为对照组及13－cis RA处理24 h、72 h、144 h)；B：SK－N－BE2细胞经13－cis RA作用144 h后细胞形态(B1、B2、B3、B4分别为对照组及RA 1 μmol/L、RA 5 μmol/L、RA 10 μmol/L)；C：SK－N－SH细胞经13－cis RA 10 μmol/L作用后细胞形态(C1、C2、C3、C4分别为对照组及13－cis RA处理24 h、72 h、144 h)　13－cis RA：13－cis retinoic acid；A：SH－SY5Y cell after 5 μmol/L 13－cis RA treatment (A1，A2，A3，A4 refer to control group，13－cis RA treatment 24 h，72 h，144 h); B：SK－N－BE2 cell after 13－cis RA treatment for 144 h (B1，B2，B3，B4 refer to control group，RA 1 μmol/L，RA 5 μmol/L，RA 10 μmol/L)；C：SK－N－SH cell after 10 μmol/L 13－cis RA treatment (C1，C2，C3，C4 refer to control group，13－cis RA treatment 24 h，72 h，144 h)

图2

SH－SY5Y、SK－N－BE2　和SK－N－SH细胞经13－cis RA作用后相差显微镜观察细胞形态变化(×200)

Figure 2

Morphological changes after 13－cis RA treatment in SH－SY5Y，SK－N－BE2 and SK－N－SH cells (×200)

2.3　细胞培养上清液中NSE水平测定

SK－N－BE2经不同浓度13－cis RA作用72 h后NSE显著升高，与对照组比较差异有统计学意义(F＝27.00，P<0.000 1)。SH－SY5Y及SK－N－SH细胞随着13－cis RA浓度增加，作用时间延长，NSE水平有所增加，但差异无统计学意义(F＝5.24，P＝0.23；F＝14.89，P＝0.78)，见图3。

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图3

SK－N－BE2、SH－SY5Y　和SK－N－SH细胞采用13－cis RA作用后酶联免疫吸附法测定NSE水平

Figure 3

NSE concentrations were determined by enzyme linked immunosorbent assay after 13－cis RA treatment in SK－N－BE2，SH－SY5Y and SK－N－SH cells

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注：NSE：神经元特异性烯醇化酶；13－cis RA：13－顺式维甲酸；与对照组比较，^aP<0.05　NSE：neuron－specific enolase；13－cis RA：13－cis retinoic acid；compared with control group，^aP<0.05

图3

SK－N－BE2、SH－SY5Y　和SK－N－SH细胞采用13－cis RA作用后酶联免疫吸附法测定NSE水平

Figure 3

NSE concentrations were determined by enzyme linked immunosorbent assay after 13－cis RA treatment in SK－N－BE2，SH－SY5Y and SK－N－SH cells

2.4　CCK－8检测细胞增殖变化

SH－SY5Y细胞经13－cis RA作用72 h后，相对于对照组，细胞存活率均超过100%，细胞增殖在药物作用48 h达到最高值，不同药物浓度促进细胞增殖差异有统计学意义(F＝7.864，P＝0.001)，见表1。SK－N－SH细胞经13－cis RA作用72 h低药物浓度组(1、5 μmol/L)出现轻度抑制细胞生长，与高药物浓度组(10、20 μmol/L)比较差异有统计学意义(F＝44.103，P＝0.000 1)，见表2。SK－N－BE2细胞经13－cis RA作用72 h后明显抑制细胞增殖，不同药物浓度之间比较差异有统计学意义(F＝59.646, P＝0.000 1)，见表3。

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表1

13－cis RA作用后SH－SY5Y细胞存活率(%，±s)

Table 1

The cell viability of SH－SY5Y after 13－cis RA treatment(%，±s)

表1

13－cis RA作用后SH－SY5Y细胞存活率(%，±s)

Table 1

The cell viability of SH－SY5Y after 13－cis RA treatment(%，±s)

13－cis RA(μmol/L)	24 h	48 h	72 h
1	123.00±14.67	199.14±88.75	104.33±55.43
5	119.20±17.55	153.56±15.89	111.51±54.14
10	112.10±28.76	127.29±6.39	113.52±14.76
20	105.10±1.15	121.49±35.81	106.20±25.20
F值	1.279	7.864	0.084
P值	0.302	0.001	0.968

注：13－cis RA：13－顺式维甲酸　13－cis RA：13－cis retinoic acid

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表2

13－cis RA作用后SK－N－SH细胞存活率(%，±s)

Table 2

The cell viability of SK－N－SH after 13－cis RA treatment(%，±s)

表2

13－cis RA作用后SK－N－SH细胞存活率(%，±s)

Table 2

The cell viability of SK－N－SH after 13－cis RA treatment(%，±s)

13－cis RA(μmol/L)	24 h	48 h	72 h
1	133.33±27.42	99.01±20.71	95.93±6.26
5	121.19±13.23	104.70±38.49	93.94±8.56
10	141.50±29.06	125.10±14.99	113.54±5.99
20	125.17±18.29	122.30±47.30	119.60±2.60
F值	1.712	1.904	44.103
P值	0.189 0	0.154 0	0.000 1

注：13－cis RA：13－顺式维甲酸　13－cis RA：13－cis retinoic acid

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表3

13－cis RA作用后SK－N－BE2细胞存活率(%，±s)

Table 3

The cell viability of SK－N－BE2 after 13－cis RA treatment(%，±s)

表3

13－cis RA作用后SK－N－BE2细胞存活率(%，±s)

Table 3

The cell viability of SK－N－BE2 after 13－cis RA treatment(%，±s)

13－cis RA(μmol/L)	24 h	48 h	72 h
1	137.12±66.07	135.56±39.90	70.50±3.83
5	105.50±35.19	122.33±11.01	72.10±2.89
10	149.10±41.88	141.21±13.66	93.57±4.83
20	126.80±81.26	130.50±10.33	84.67±3.87
F值	0.818	2.126	59.646
P值	0.496 0	0.121 0	0.000 1

注：13－cis RA：13－顺式维甲酸　13－cis RA：13－cis retinoic acid

2.5　流式细胞仪检测细胞凋亡

SH－SY5Y细胞经13－cis RA作用96 h及120 h，10 μmol/L浓度较对照组细胞凋亡明显增加，差异有统计学意义(F＝16.21，P＝0.011；F＝16.04，P＝0.016)。SK－N－SH细胞经13－cis RA作用48 h，1 μmol/L及10 μmol/L浓度较对照组细胞凋亡明显增加，差异均有统计学意义(F＝15.05，P＝0.012；F＝31.18，P＝0.005)。SK－N－BE2细胞经13－cis RA作用120 h，不同浓度(1、5、10 μmol/L)引起细胞凋亡与对照组比较差异均有统计学意义(F＝9.05，P＝0.030；F＝11.38，P＝0.028；F＝7.88，P＝0.041)。具体凋亡情况见图4。

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图4

SH－SY5Y、SK－N－SH　和SK－N－BE2细胞采用13－cis RA作用后流式细胞仪检测细胞凋亡

Figure 4

Cell apoptosis was assayed with flow cytometry after 13－cis RA treatment in SH－SY5Y，SK－N－SH and SK－N－BE2 cells

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注：13－cis RA：13－顺式维甲酸；与对照组比较，^aP<0.05　13－cis RA：13－cis retinoic acid；compared with control group，^aP<0.05

图4

SH－SY5Y、SK－N－SH　和SK－N－BE2细胞采用13－cis RA作用后流式细胞仪检测细胞凋亡

Figure 4

Cell apoptosis was assayed with flow cytometry after 13－cis RA treatment in SH－SY5Y，SK－N－SH and SK－N－BE2 cells

3　讨论

NB是儿童期最常见的起源于交感神经系统的颅外恶性实体肿瘤，采用综合性治疗，使低危、中危及无MYCN扩增患者预后大幅提高^[2,3,4]，但晚期NB的预后仍很差。研究报道Ⅳ期NB预计5年生存率为30%～50%^[5,6,7]。

NB具有自行消退逆转的独特生物学特性，因此为诱导分化疗法提供了理论依据。RA及其受体具有控制细胞分化、增殖和凋亡的能力^[8]，能够使NB细胞向正常神经细胞方向分化^[9]。然而RA的作用机制并不清楚，研究报道RA在NB细胞系中能下调MYCN基因的表达^[10]，提示RA诱导NB细胞分化可能与降低MYCN的表达有关。Matthay和Reynolds^[11]研究表明小剂量13－cis RA对治疗NB的微小残留病灶无效果，大量、间歇应用较小量、长期应用更有效。如何更好地应用RA、RA针对哪些类型NB有效是值得探讨的问题。

根据细胞形态及生长特性，NB细胞可分为3类，各自具有显著特征^[12]^: N型原始神经母细胞型，细胞胞体小而圆，胞质较少，有神经元样突起；S型细胞胞体大而扁平，胞质丰富，表现为表皮样或胶质细胞样形态；I型，即中间型，胞体小而扁平。I型细胞特异性地表达CD₁₃₃等干细胞标志蛋白，恶性程度最高，被认为是NB干细胞(NBSC)^[13]，SK－N－BE2细胞中含I型细胞比例最高，常被作为NBSC细胞系进行相关研究。SK－N－SH及SH－SY5Y细胞均属于S型细胞。有研究发现抗肿瘤药物8－氯腺苷作用于SH－SY5Y细胞48 h后细胞发生明显凋亡，而SK－N－SH细胞却未见凋亡^[14]。同种药物作用于同种类型NB细胞，但作用机制并不相同。因此，研究RA对不同NB细胞株的作用及机制，将为不同类型的NB患者应用RA疗效预测提供理论依据。

SK－N－BE2细胞株来源于多次化疗及放疗的扩散性NB患儿骨髓穿刺物，SK－N－SH细胞是从1例有3年NB病史的前列腺癌患者脑部转移灶中建立的，SH－SY5Y细胞来源于1970年建立的NB患者转移瘤灶细胞SK－N－SH经3次克隆后的亚系。本研究发现这3种细胞株经13－cis RA作用7 d，细胞出现多个轴突树突状突起、细胞呈极性、细胞器增多等现象，提示向正常神经细胞方向分化。ELISA检测显示随着13－cis RA作用时间延长NSE水平升高，证实13－cis RA对不同的NB细胞体外能产生明显的诱导分化作用，与文献^[9]报道一致。

FISH检测发现具有NBSC特征的SK－N－BE2细胞MYCN扩增阳性。MYCN扩增在NB中已被确认为预后不良指标^[15]，MYCN的表达下调与恶性表型的转良相一致，但目前尚无直接针对MYCN的拮抗剂，主要通过各种途径抑制MYC的转录及干扰其蛋白的稳定而降低MYCN的表达^[16]。SK－N－BE2细胞经13－cisRA作用后细胞从成团样聚集生长到细胞极性化改变，形态发生变化最明显，NSE水平明显增高，提示其对RA诱导分化效果比SH－SY5Y和SK－N－SH明显。但FISH检测MYCN仍然呈阳性扩增，提示13－cis RA虽然能在数量上抑制肿瘤细胞，形态上诱导肿瘤细胞分化，但对NB细胞恶性生物学特征之一MYCN扩增，在DNA水平上无明显改善。MYCN持续扩增阳性代表预后不良，也提示13－cis RA临床应用具有一定局限。

本研究中CCK－8检测提示13－cis RA作用48 h内，对细胞抑制作用并不明显。研究报道NB细胞单独采用RA作用24 h后相对于未用药对照组未能减少细胞凋亡，而和蛋白酶体抑制剂MG132联合作用3 d后，细胞凋亡比例可达到40%，因此联合用药能够抵消RA对细胞存活的作用，证实RA短时间内作用有促进细胞增殖的作用^[17]。不同浓度13－cis RA导致NB细胞凋亡的程度与肿瘤细胞种类、药物浓度及作用时间有关。

总之，3种NB细胞株对13－cis RA敏感程度不一，可能与MYCN扩增情况及细胞本身分化程度相关。13－cis RA能够抑制NB细胞增殖，诱导其分化，但对于MYCN扩增阳性的患者可能需要13－cis RA协同其他药物联合治疗才能改变其恶性生物学特征。

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贡献者信息

邵静波

200040　上海交通大学附属儿童医院　上海市儿童医院血液科

吴伟

上海市儿童医院普外科

李玲玲

上海市儿童医院中心实验室

吕志葆

上海市儿童医院普外科

通信作者

吕志葆

上海市儿童医院普外科

Email：lvzhibao@sohu.com

关键词

神经母细胞瘤; 诱导分化; 13－顺式维甲酸; MYCN基因;

基金项目

上海市科学技术委员会科研计划课题（12411952405）

上海市科学技术委员会样本库建设平台（12DZ2295006）

历史

出版日期：2015-08-05

收稿日期：2015-01-08

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申玉美

Hematology/Oncology Disease

Study on 13-cis retinoic acid inducing differentiation of three types of human neuroblastoma cell lines in vitro

Jingbo Shao, Wei Wu, Lingling Li, Zhibao Lyu

Published 2015-08-05

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(15): 1152-1156. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.15.009

Abstract

Objective

To investigate the effects of 13-cis retinoic acid (13-cis RA) in inducing differen-tiation of 3 types of human neuroblastoma (NB) cells in vitro.

Methods

The status of MYCN gene amplification of cultured SH-SY5Y, SK-N-SH and SK-N-BE2 cells was detected by fluorescence in situ hybridization.After treatment with different concentrations of 13-cis RA, morphological changes were observed by phase-contrast microscope, and neuron-specific enolase (NSE) concentrations were determined by enzyme linked immunosorbent assay.The cell viability was measured through cell counting kit-8 assay, and the cell apoptosis was assayed with flow cytometry (FCM).

Results

The morphological changes in differentiation were observed in all 3 types of NB cells after 13-cis RA treatment.MYCN amplification was detected in SK-N-BE2 cells even after 13-cis RA treatment, while the other 2 cell lines were amplification-null.After different concentrations of 13-cis RA treatment, NSE concentration increased with prolonged time, especially for SK-N-BE2 cell(F=27.00, P<0.000 1).13-cis RA stimulated cell proliferation within 48 hours of treatment, and then inhibited cell growth.FCM indicated that the degree of apoptosis in SH-SY5Y cell was significantly higher after 13-cis RA treatment of 10 μmol/L concentration for continuous 96 h and 120 h as compared to the control group (F=16.21, P=0.011; F=16.04, P=0.016). Cell apoptosis of SK-N-SH cell after 13-cis RA treatment of 1 μmol/L and 10 μmol/L concentration for 48 h, were significantly higher than those of the control group(F=15.05, P=0.012; F=31.18, P=0.005); while SK-N-BE2 cell with different concentrations of 13-cis RA(1 μmol/L, 5 μmol/L, 10 μmol/L) for 120 h were significantly higher than those of the control group(F=9.05, P=0.030; F=11.38, P=0.028; F=7.88, P=0.041).

Conclusions

The present study showed that 13-cis RA could induce differentiation of human NB cells in vitro.It induces cell proliferation within 48 hours of 13-cis RA, and thereafter suppresses cell growth.No improvement was found in MYCN amplification cells with the detection of DNA level after 13-cis RA treatment, which suggests that combined treatment is possibly needed.

Key words:

Neuroblastoma; Differentiation; 13-cis retinoic acid; MYCN gene

Contributor Information

Jingbo Shao

Department of Blood, Shanghai Children's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200040, China

Wei Wu

Lingling Li

Zhibao Lyu

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