探讨组胺受体4种亚型(H1、H2、H3、H4受体)在小儿尿道横纹肌中和小鼠成肌干细胞C2C12分化过程中的表达。
收集临床小儿尿道横纹肌标本,石蜡包埋,组织切片,免疫组织化学染色检测H1、H2、H3、H4受体。诱导小鼠成肌干细胞C2C12成肌分化,实时定量聚合酶链反应测量成肌分化早期标志物desmin,中期标志物myogenin,晚期标志物肌球蛋白重链和组胺4种亚型受体mRNA的表达。免疫荧光染色检测各分化标志物和组胺H3受体蛋白质的表达情况。
成肌分化过程中desmin mRNA在分化2、4、6 d后的表达量分别为未分化肌母细胞的12、68、60倍;myogenin mRNA在分化2、4、6 d后的表达量分别为肌母细胞的631、1 408、914倍;肌球蛋白重链mRNA的表达在分化2、4、6 d后,表达量分别为未分化的肌母细胞的7 718、9 448、286 288倍。H1受体mRNA在分化6 d后,表达量约为未分化肌母细胞的25%;H2受体mRNA在未分化肌母细胞与分化各阶段的细胞中的表达均无明显变化(F=1.47,P>0.05);H3受体mRNA在分化2、4、6 d后的表达量是未分化肌母细胞的28、103、198倍;未检测到组胺受体H4受体mRNA的表达。免疫荧光染色发现H3受体蛋白染色随着分化荧光染色强度增加。小儿尿道横纹肌的免疫组织化学染色发现H1、H2、H3受体染色阳性,其中H1受体阳性程度最强,H3受体中度阳性,H2受体弱阳性。
小儿尿道横纹肌中和小鼠成肌干细胞分化过程中发现组胺亚型H1、H2、H3受体的表达,H3受体的表达量随着成肌分化过程而增加,预示着其可能在成熟横纹肌细胞中发挥功能。
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组胺是生物体合成的活性氨,主要参与机体免疫、生化等功能。到目前为止已经发现有4种组胺受体亚型:H1、H2、H3、H4受体,对组胺的亲和指数值分别为4.2、4.3、8.0、8.2[1];现在对组胺受体功能的研究早已远远超过免疫学范畴,如在支气管平滑肌细胞中发现了组胺H1、H2、H3受体,肠道平滑肌和膀胱逼尿肌细胞中H1、H2、H3、H4受体存在。然而在尿道横纹肌细胞和横纹肌干细胞分化过程中,还未见有组胺受体表达的报道。因此,本研究尝试寻找组胺受体各亚型是否在小儿尿道周围横纹肌组织及小鼠成肌干细胞C2C12分化过程中表达。
细胞来源:小鼠成肌细胞C2C12 (CRL-1772™,ATCC,美国)在37 ℃、50 mL/L二氧化碳湿润空气的培养箱中培养。培养液:(1)生长液:500 mL DMEM内添加50 mL纯的胎牛血清,10 000个单位的青霉素和链霉素,左旋谷氨酸。(2)分化液:500 mL DMEM液内添加5 mL纯的胎牛血清,10 000个单位的青霉素和链霉素,左旋谷氨酸。传代:2.5 g/L胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液消化贴壁细胞。
于郑州大学第一附属医院病理科收集2例行小儿骑跨伤尿道会师术的小儿[年龄(5.6±1.3)岁]尿道中段标本。选定取材部位的标准:尿道膜部上方前列腺下方中段尿道括约肌处,留取约5 mm×5 mm×3 mm的横纹肌组织1块,质量约为100 mg。病理证实该段尿道括约肌未见明显异常。新鲜标本即时取材,所有标本组织经多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续3~5 μm厚切片,HE染色后经同一病理医师验证。标本经医院医学伦理委员会批准,患儿家长签署知情同意书。
细胞培养液及其配方购于美国Lonza公司;各引物购于芬兰Oligomer Oy公司;各分化标志物desmin、myogenin、肌球蛋白重链(MHC)和组胺受体4种亚型的兔抗人多克隆IgG抗体购于美国Cell Signaling公司;无免疫性兔IgG和ABC kit试剂盒购于美国R&D Systems公司;Alexa Fluor® 488-偶联驴抗兔免疫球蛋白购于美国Life Technologies公司:驴血浆购于美国Jackson Immunoresearch公司;4,6-二脒-2-苯基吲哚(DABI)显色试剂盒购于美国Invitrogen公司;LSAB(labelled streptavidim biotln)法免疫组织化学染色试剂盒购于美国R&D Systems公司;二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于美国R&D Systems公司。
C2C12肌肉干细胞加入12孔培养板中,每孔50 000细胞,加入生长液增殖,每24 h换1次生长液。48 h后将生长液换成分化液进行分化,每24 h换1次分化液。分别测量分化0、2、4、6 d的细胞中各分化标志物和4种组胺受体亚型mRNA的表达。提取组织总RNA并合成cDNA,然后进行目的片段的扩增,即RT-PCR。
将C2C12成肌细胞培养在直径13 mm圆形盖玻片上进行增殖、分化。分别取分化0、2、4、6 d的细胞进行免疫荧光染色,细胞核染色为天蓝色,C2C12细胞胞质或胞膜出现翠绿色荧光染色为阳性。
取新鲜小儿尿道中段横纹肌标本进行固定、包埋、切片、脱蜡、水合、抗原修复,使用LSAB法免疫组织化学试剂盒进行染色,细胞核染色为天蓝色,横纹肌细胞胞质或胞膜出现棕黄色染色为阳性。
应用SPSS 17.0软件进行分析,多组样本均数间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
RT-PCR检测显示早期标志物desmin mRNA随着成肌分化,表达量增高,在分化2、4、6 d后表达量分别为未分化肌母细胞的12、68、60倍(图1);中期分化标志物myogenin mRNA在分化2、4、6 d后的表达量分别为肌母细胞的631、1 408、914倍(图1);晚期分化标志物MHC mRNA的表达在分化过程中一直处于增长状态,分化2、4、6 d后表达量分别为未分化肌母细胞的7 718、9 448、286 288倍(图1)。
注:MHC:肌球蛋白重链;D0:未分化肌母细胞;D2:分化2 d的成肌细胞;D4:分化4 d的成肌细胞;D6:分化6 d的成肌细胞;D0表达量设定为1,其他显示值为D0的倍数 MHC:myosin heavy chain;D0:the undifferentiated cells;D2:the cells differentiated for 2 days;D4:the cells differentiated for 4 days;D6:the cells differentiated for 6 days;the expression of D0 was set to 1,and other values were the folds of D0
desmin的免疫荧光染色在肌母细胞和分化任何阶段细胞均为翠绿色阳性(未显示)。在未分化的肌母细胞中,中期标志物myogenin、晚期标志物MHC的染色均为阴性,与阴性对照组无差异。分化2 d后,myogenin染色转为弱阳性,MHC染色仍然为阴性。分化4 d后,myogenin染色为强阳性,MHC染色为阳性。分化6 d后,中、晚期标志物均为强阳性。组胺H3受体蛋白的免疫荧光染色在未分化肌母细胞中为阴性;分化2 d后,染色显示弱阳性;分化4、6 d后,染色显示H3受体为强阳性。结果见图2。
注:A1~D1:H3受体;A2~D2:中期标志物myogenin;A3~D3:晚期标志物肌球蛋白重链;A4~D4:阴性对照;A1~A4:未分化细胞;B1~B4:分化2 d的细胞;C1~C4:分化4 d的细胞;D1~D4:分化6 d后的细胞;图中细胞核染色为蓝色,标尺为50 μm A1-D1:H3 receptor;A2-D2:the middle marker myogenin;A3-D3:late marker myosin heavy chain;A4-D4:negative control;A1-A4:undifferentiated cells;B1-B4:cells differentiated 2 days;C1-C4:cells differentiated 4 days;D1-D4:cells differentiated 6 days;nuclear staining was blue,scale bar was 50 μm
小儿尿失禁一直是儿科医师遇到比较常见的问题。但是目前治疗方法尚不能完全解决这个难题。小儿尿失禁常见因素为逼尿肌收缩异常和/或尿道异常。Neuhaus等[2,3]首次在人逼尿肌中发现了组胺各受体的表达及其参与逼尿肌细胞内钙离子的调节,推测组胺受体可能参与膀胱的收缩。基于此研究首先尝试了在小儿中段尿道周围横纹肌中检测了组胺受体,发现H1、H2、H3受体染色阳性,H4受体阴性。同时,本研究首次尝试了在小鼠成肌细胞C2C12分化为横纹肌细胞过程中检测组胺受体各亚型的表达,发现在mRMA层面上检测出了组胺H1、H2、H3受体,但是没有H4受体。这可能是由于H4受体一般在骨髓、胸腺、脾等免疫相关器官和肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞等骨髓来源细胞存在,从而在其他细胞和组织中少见表达[4,5,6,7]。
H1、H2受体是发现早、研究广泛深入的传统组胺受体,与组胺的结合力较低。H1受体是过敏反应主要的治疗靶位[8]。H1受体对胎盘绒毛静脉和脑动脉血管的平滑肌细胞具有较强的收缩作用[2]。H1受体激动剂能使多种动物的支气管、胃肠道平滑肌和逼尿肌产生收缩效应。本研究显示,在小儿横纹肌括约肌中有H1受体表达,H1受体可能会辅助参与其收缩功能;另外,在小鼠横纹肌母细胞中,H1受体表达量高,随着成肌分化,稍有减少。这与Ferreira-Martins等[9]发现的H1受体在心肌母细胞中可以调节细胞内钙离子流动和细胞分裂周期,参与早期阶段细胞增殖与分化相关,H1受体在横纹肌母细胞中很可能参与细胞的增殖和启动分化。Cheng等[10]的研究结果证实了这个可能性,他们观察到在胎龄第17-20天时胎鼠体内可以大量释放组胺的肥大细胞前体,从骨髓迁移到骨骼肌肉组织,刺激骨骼肌细胞的增殖和分化。H2受体主要表达于胃黏膜、血管平滑肌等,是消化性溃疡主要的治疗靶位[11]。刺激骨骼肌组织中的H2受体具有用箭毒般骨骼肌松弛的效果。在骨骼肌组织中,H2受体拮抗剂具有抗胆碱酯酶活性。其他研究显示组胺可以通过H2受体直接作用于胃肠道平滑肌,可以对迷走神经递质的调节而影响胃肠道、输尿管及膀胱的舒缩状态[12]。本研究H2受体在成肌分化中表达比较稳定,小儿尿道周围横纹肌染色弱阳性证实表达量不高,说明其可能会参与横纹肌舒缩功能。H3受体主要在神经系统表达,对组胺具有很高的亲和性,比H1受体和H2受体的亲和力高100~1 000[1,13]。在神经肌接头突出前膜上,H3受体可以通过抑制cAMP,降低PKA活性,进而降低细胞中钙离子浓度,抑制去甲肾上腺素的胞吐作用[14],在某些细胞中,H3受体与H1受体呈现相反的功能[15],如在大脑中,H1受体可以促进细胞释放组胺,但是H3受体可反馈性地抑制组胺的合成和释放,调节胆碱能神经传递[16]。本结果显示,在分化成熟的横纹肌细胞和小儿横纹肌括约肌中仍有H1受体表达,H1受体可能参与成熟细胞的收缩功能,正如高浓度的组胺活化支气管平滑肌中的H1受体,与Gαq/11蛋白偶联,裂解磷脂酰肌醇4,5二磷酸为甘油二酯和三磷酸肌醇1,4,5,活化磷脂酶C,增加胞质中的钙离子,从而引起平滑肌收缩;而低浓度的组胺活化H3受体,激活Gi蛋白,抑制Camp合成,降低胞质中钙离子浓度,维持呼吸道舒张。本研究发现H3受体在横纹肌成肌分化过程中,mRNA表达量呈倍数增加,受体蛋白染色阳性强度也随着分化增强,在小儿尿道中段横纹肌染色中H3受体也呈明显阳性,提示H3受体可能在分化成熟细胞发挥重要功能和生理意义,很可能参与横纹肌细胞的松弛、抗疲劳、抗过度收缩等功能。
本研究通过实验室检测到组胺受体在尿道周围横纹肌组织及成肌细胞分化过程中的表达,将继续探讨组胺受体,尤其是H3受体在成熟横纹肌细胞的功能和信号通路,进而验证组胺受体在下尿路功能障碍疾病中的作用,为以后临床治疗下尿路障碍提供细胞内药物靶位点或者组织工程学治疗方法。