Gene mutations in 32 family with phenylketonuria

Chen Yafen; Jiang Xinye; Chen Zhonghai; Jia Haitao; Pei Jingjing; Qiu Yali; Wu Zhijun; Wang Jing

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.20.010

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• 遗传代谢内分泌疾病 •

苯丙酮尿症患者32例家系基因突变研究

中华实用儿科临床杂志, 2015,30(20) : 1554-1556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.20.010

摘要

目的

检测苯丙酮尿症(PKU)患儿及其父母苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变谱，并探讨PAH基因突变与临床严重程度的相关性，为本地区PKU患儿的早期诊断及遗传咨询提供基础数据。

方法

使用高通量测序技术对来自江苏省无锡和宿迁的32例PKU患儿及其父母的PAH基因13个外显子及其附近内含子区域进行测序分析。

结果

32例PKU共检测出61个突变位点，33种突变基因，突变检出率为95.31%(61/64个)。本地区PKU患儿常见致病突变位点为c.721C>T、c.1068C>A、c.611A>G、c.1197A>T、c.728G>A、c.331C>T和c.442-1G>A，其突变频率均在5%以上。首次报道1个新的突变基因位点c.699C>G和3个汉族人口中新的突变基因位点c.265C>T、c.722G>A和c．1194A>G。Guldberg AV系统分析显示38.0%(8/21例)的PKU患者基因型与实际生化表型相一致，其中预测表型为中重度的与实际生化表型的一致率为92.3%(12/13例)，轻度的与实际生化表型的一致率为50.0%(4/8例)。

结论

江苏地区PKU患儿的PAH基因突变集中在外显子7上，其中频率最高的基因位点是c.721C>T，并首次发现1个新的基因突变位点c.699C>G；PKU患者基因型与生化表型之间有一定的相关性。

引用本文: 陈雅芬, 蒋新液, 陈忠海, 等. 苯丙酮尿症患者32例家系基因突变研究 [J] . 中华实用儿科临床杂志,2015,30 (20): 1554-1556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.20.010

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苯丙酮尿症(PKU)是一种常见的常染色体隐性遗传代谢病，中国人群中发病率为1/14 000^[1]，由编码肝苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的缺陷引起，最主要的临床表现是高苯丙氨酸血症(HPA)和不可逆的进行性的智力障碍，部分患者还合并癫。本研究检测了PKU患儿及其父母PAH基因突变谱，分析了本地区PKU患者基因突变类型及高频突变位点，并探讨了PAH基因突变率与临床严重度的相关性，为本地区PKU的早期诊断及遗传咨询提供了依据。

1　资料与方法

1.1　一般资料

选择来自无锡市妇幼保健院及宿迁妇幼保健院确诊的PKU患儿及其父母，共32个家系。男18例，女14例；年龄2～10岁。采集受检者外周血5～10 mL，对其PAH基因突变位点进行测序。患儿诊治符合卫生部《PKU和先天性甲状腺功能减低症诊治技术规范》^[2]及"HPA的诊治共识"^[3]标准。患儿监护人均签署知情同意书，所做研究获医院医学伦理委员会批准。

1.2　临床分型

根据其治疗前血苯丙氨酸水平分为临床表型，经典型PKU：血苯丙氨酸(PHE)水平≥1 200 μmol/L，中度PKU：血PHE>600～1 200 μmol/L，轻度PKU：血PHE>360～600 μmol/L，轻度HPA：血PHE>120～360 μmol/L^[4,5]。

1.3　实验方法

1.3.1　基因组DNA提取

利用全基因组提取试剂盒(QIAGEN，USA)提取患儿及其父母外周血的全基因组DNA。对PAH基因13个外显子及其附近内含子区域进行测序，对应的特异性引物根据文献^[6]报道合成。

1.3.2　PCR反应

采用ABI GeneAmp 9700型扩增仪进行PCR反应。将PCR扩增产物制备成多样本混合池(DNA Pooling)，给产物添加不同接头(Adapter)，定量浓度达到文库制备要求后，上机检测。

1.3.3　基因测序

研究中将采用2种检测方法寻找导致PKU发病的PAH基因单核甘酸多态性(SNP)位点：一种为基于MassArray芯片技术的质谱检测，另外一种为采用高通量测序技术的测序检测。对测序结果进行图像识别(Base calling)，通过与参考基因组序列比对，结合国际PAH基因数据库(PAHdb)信息，寻找目标区域的SNPs并注释，汇总得到需要的PAH致病SNP位点、序列长度(Reads)、Reads数量和测序深度等。采用美国Illumina公司的HiSeq2000测序仪进行样本测序。样品纯化及序列分析由深圳华大基因研究院技术人员完成。

1.4　基因型与表型关系分析

参考Guldberg任意值(AV)分析法预测患儿病情轻重程度^[7]，将各种突变类型分组，每组突变设定一个AV：设经典型PKU AV＝1，中度PKU AV＝2，轻度PKU AV＝4，轻度HPA AV＝8。再通过2个基因突变的AV总和值，对生化表型进行PKU预测：AV为2时为经典型，AV为3和4时为中间型，AV为5、6和8时为轻型，AV为9、10、12和16时为轻度高苯丙氨酸血症(MHP)。

2　结果

2.1　患儿PAH基因突变位点检测结果

32例PKU患儿共检测出61个突变位点，33种突变基因，突变检出率为95.31%(61/64个)，其中30个缺失突变(49.2%)，16个剪接突变(26.2%)，14个无义突变(23.0%)，1个缺失突变(1.6%)。本研究发现4个新的突变基因位点，分别为c.699C>G，c.265C>T，c.722G>A和c．1194A>G。结果见表1。

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表1

无锡地区苯丙酮尿症人群苯丙氨酸羟化酶基因突变类型

Table 1

Mutation of phenylalanine hydroxylase gene identified with phenylketonuria public in Wuxi region

表1

无锡地区苯丙酮尿症人群苯丙氨酸羟化酶基因突变类型

Table 1

Mutation of phenylalanine hydroxylase gene identified with phenylketonuria public in Wuxi region

基因突变	蛋白改变	定位	突变类型	相对频率[%(例)]
c.721C>T	p.R241C	E7	Missense	11.0(7/64)
c.1068C>A	p.Y356X	E11	Nonsense	9.0(6/64)
c.611A>G	EX6-96A>G	E6	Splicing	6.0(4/64)
c.1197A>T	p.V399V	E11	Splicing	6.0(4/64)
c.728G>A	p.R243Q	E7	Missense	5.0(3/64)
c.331C>T	p.R111X	E3	Nonsense	5.0(3/64)
c.442-1G>A	IVS4-1G>A	Intron4	Splicing	5.0(3/64)
c.1223G>A	p.R408Q	E12	Missense	3.0(2/64)
c.781C>T	p.R261X	E7	Nonsense	3.0(2/64)
c.770G>T	p.G257V	E7	Missense	3.0(2/64)
c.1238G>C	p.R413P	E12	Missense	3.0(2/64)
c.265C>T^a	p.P89S	E3	Missense	1.6(1/64)
c.929C>T	p.S310F	E9	Missense	1.6(1/64)
c.977G>A	p.W326X	E10	Nonsense	1.6(1/64)
c.827T>A	p.M276K	E7	Missense	1.6(1/64)
c.472C>T	p.R158W	E5	Missense	1.6(1/64)
c.1301C>A	p.A434D	E12	Missense	1.6(1/64)
c.740G>T	p.G247V	E7	Missense	1.6(1/64)
c.466G>C	p.A156P	E5	Missense	1.6(1/64)
c.526C>T	p.R176X	E6	Nonsense	1.6(1/64)
c.833C>T	p.T278I	E7	Missense	1.6(1/64)
c.722G>A^a	p.R241H	E7	Missense	1.6(1/64)
c.194T>C	p.I65T	E3	Missense	1.6(1/64)
c.1194A>G^a	p.K398K	E11	Splicing	1.6(1/64)
c.913-7A>G	IVS8-7A>G	E9	Splicing	1.6(1/64)
c.842＋2T>A	IVS7＋2T>A	Intron7	Splicing	1.6(1/64)
c.441＋3G>C	IVS4＋3G>C	Intron4	Splicing	1.6(1/64)
c.168＋5G>C	IVS2＋5G>C	Intron2	Splicing	1.6(1/64)
c.498C>G	p.Y166X	E5	Nonsense	1.6(1/64)
c.699C>G^a	p.F233L	E6	Missense	1.6(1/64)
c.992T>C	p.F331S	E10	Missense	3.0(2/64)
c.1172G>C	p.S391T	E11	Missense	1.6(1/64)
c.279_281delCAT	p.N93_I94delinsN	E3	Deletion	1.6(1/64)

注：^a：新发现的突变位点　^a：newly discovered mutation

2.2　32例家系样本验证情况

对32例PKU患儿及其父母的血液PAH基因检测结果显示，27例患儿的2个致病突变位点皆遗传自父母。1例家系样本由于缺少父亲血液样本，故只检测到患儿和母亲的突变位点(其中患儿的2个致病突变位点中，有1个致病突变位点遗传自母亲)。4例家系样本中只检测到患儿和父亲或母亲一方的部分突变位点。

2.3　基因型与表型的关系

部分突变类型无AV评分，32例中仅21例采用AV评分法行基因型预测生化表型。21例通过AV预测的表型与实际生化表型的一致率为38.0%(8/21例)，其中预测表型为中重度的与实际生化表型的一致率为92.3%(12/13例)，轻度的与实际生化表型的一致率为50.0%(4/8例)。结果见表2。

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表2

无锡地区苯丙酮尿症人群基因型与表型的关系

Table 2

Correlation of genotype－phenotype in phenylketonuria public in Wuxi region

表2

无锡地区苯丙酮尿症人群基因型与表型的关系

Table 2

Correlation of genotype－phenotype in phenylketonuria public in Wuxi region

序号	患者基因型	实际生化表型	预测生化表型
1	p.S310F/p.R241C	中度PKU	轻度HPA
2	p.Y356/p.W326	中度PKU	经典型PKU
3	p.Y356*/p.R158W	中度PKU	经典型PKU
4	p.R261/p.R111	中度PKU	经典型PKU
5	p.R243Q/p.A434D	中度PKU	中度PKU
6	p.V399V/IVS4-1G>A	中度PKU	经典型PKU
7	p.V399V/p.R241C	轻度HPA	轻度HPA
8	p.Y356*/p.G257V	经典型PKU	经典型PKU
9	p.G247V/p.R111*	中度PKU	经典型PKU
10	p.A156P/p.R408Q	中度PKU	中度PKU
11	IVS4-1G>A/p.R176*	经典型PKU	经典型PKU
12	p.T278I/EX6-96A>G	经典型PKU	经典型PKU
13	p.R241H/p.I65T	中度PKU	轻度HPA
14	p.K398K/p.R241C	中度PKU	轻度HPA
15	IVS8-7A>G/IVS7＋2T>A	经典型PKU	经典型PKU
16	p.Y356*/p.G257V	经典型PKU	经典型PKU
17	IVS4＋3G>C/p.R241C	轻度PKU	轻度HPA
18	p.R241C/p.R243Q	中度PKU	轻度HPA
19	p.R241C/EX6-96A>G	轻度PKU	轻度HPA
20	p.Y356*/IVS4-1G>A	轻度PKU	经典型PKU
21	p.R241C/EX6-96A>G	轻度PKU	轻度HPA

注：PKU：苯丙酮尿症；HPA：高苯丙氨酸血症　PKU：phenylketonuria；HPA：hyperphenylalaninemia

3　讨论

PKU的致病基因PAH由编码区的13个外显子和非编码区的12个内含子组成，当编码区及其两侧内含子有基因突变发生时，会引起PAH的功能减低或缺失，从而导致相应的临床表现。中国人PAH基因突变集中在外显子3、6、7、11与12，其中以外显子6和7发生突变最为多见^{[8,9,10,11,12]}，本地区PKU患儿常见致病突变位点为：c.721C>T，c.1068C>A，c.611A>G，c.1197A>T，c．728G>A，c.331C>T和c．442-1G>A，较常见突变位点为：c.1223G>A，c.781C>T，c.770G>T和c．1238G>C，与文献报道的中国汉族人、北方人PKU突变图谱结果相符合^[6,13]。这些突变位点主要分布在外显子3(6例)、6(6例)、7(18例)、11(12例)、12(5例)上，其中以外显子7上基因突变最为集中，突变频率最高的基因是c.721C>T(11%)，第2位的是c.728G>A(5%)。本研究还发现4个新的突变基因位点，分别为c.699C>G、c.265C>T、c.722G>A和c.1194A>G。其中c.699C>G位点为首次报道，经过相关查询在PAHdb及人类基因突变数据库(HGMD)均未有相关记载，该突变发生在编码区，改变了氨基酸的构成，作者认为其可能与疾病严重程度相关，具体该新突变对PAH蛋白功能的影响，需要将其在体外表达系统中表达，以定性定量地判断突变对酶活性的影响，这将是下一步的工作计划。而c.265C>T、c.722G>A和c．1194A>G位点为汉族人口中首次发现报道，丰富了我国PAH基因突变数据库。

PKU患儿遗传基因来源于父母双方各自携带的致病基因，通过家系样本验证的方法，对可能的致病突变位点进行研究，有助于尽早发现患儿的致病位点，为尽早确诊和治疗提供条件，尤其在罕见突变位点和新致病位点发现中起很大作用。本研究采用家系验证的方法提示PKU患儿PAH基因突变绝大多数分别来自父母双方，但也有例外，患者只与父亲或母亲一方有相同的突变位点，而父母另一方未找到突变位点，且患者表现为中重度PKU，而父亲或母亲为健康表型，认为除PAH基因型是决定PKU生化代谢表型的重要因素外，还存在一些其他修饰因子的作用，需进一步研究证实。

目前主要通过新生儿遗传代谢病筛查早期确诊PKU患者，早期开始低PHE饮食治疗，将血PHE水平维持在理想范围，但是由于存在个体差异，每个患儿从确诊到获得最佳治疗方案通常要经过一段时间的摸索，这期间常会出现血PHE水平异常波动，对患儿产生不利影响。本研究显示通过AV预测中重度PKU基因型和表型有较好的一致性，可为临床制定PKU患者个体化治疗方案提供重要的理论依据，与天津的一项研究相似^[14]。本研究也发现部分患者基因型和临床严重度不相符，特别是轻度PKU患者，可能与PKU临床严重度不仅与突变位点有关，同时还受其他一些因素的影响^[15]。

本研究采用下一代测序技术，并结合家系验证的方式，为后期PKU患者的基因确诊和治疗提供了很好的技术方法和思路，也为本地区PKU的分子流行病学研究和预防提供了理论依据。

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贡献者信息

陈雅芬

214002　无锡市妇幼保健院儿保科

蒋新液

214002　无锡市妇幼保健院儿保科

陈忠海

华大基因浙江生物信息重点实验室

贾海涛

华大基因浙江生物信息重点实验室

裴晶晶

214002　无锡市妇幼保健院儿保科

仇亚丽

宿迁妇幼保健院儿保科

吴志君

214002　无锡市妇幼保健院检验科

王静

宿迁妇幼保健院儿保科

通信作者

蒋新液

214002　无锡市妇幼保健院儿保科

Email：fyjxy2110@163.com

关键词

苯丙酮尿症; 苯丙氨酸羟化酶; 基因突变;

基金项目

江苏省卫生厅科研项目（H201245）

历史

出版日期：2015-10-20

收稿日期：2015-04-01

本文编辑

李常艳

Genetic/Metabolic/Endocrine Disease

Gene mutations in 32 family with phenylketonuria

Chen Yafen, Jiang Xinye, Chen Zhonghai, Jia Haitao, Pei Jingjing, Qiu Yali, Wu Zhijun, Wang Jing

Published 2015-10-20

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2015,30(20): 1554-1556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.20.010

Abstract

Objective

By detecting the mutations spectrum of phenylalanine hydroxylase(PAH) gene in phe-nylketonuria(PKU) patients and their parents.The researchers analyzed the gene mutation features and high-frequency mutations and determined the relationship between the genotype and the phenotype, which would provide a theoretical basis for the early diagnosis and genetic consultation of PKU children in the region.

Methods

In this study, 13 exons and their flanking introns of the PAH gene in 32 PKU patients and their parents from Wuxi and Suqian in Jiangsu province were sequenced by using the next-generation sequencing(NGS) technology.

Results

Sixty-one mutant sites and 32 mutant genes were detected in 32 PKU patients, and the mutation detection rate was 95.31%(61/64 cases). The variants at c. 721C>T, c.1068C>A, c.611A>G, c.1197A>T, c.728G>A, c.331C>T and c. 442-1G>A were common mutations in the region with mutation frequency over 5%.What's more, 4 novel variants of c. 699C>G, c.265C>T, c.722G>A and c. 1194A>G were found.Of those, c.699C>G was not recorded in the PAH variant database and HGMD database and.c.265C>T, c.722G>A, and c. 1194A>G were first reported in the Chinese population.Genotype-accurate biochemical phenotype correlation by using the Guldberg AV system revealed consistency rate of 38.0%(8/21 cases), which the consistency rate between accurate biochemical phenotype and predictive phenotype of moderate to severe genotype was 92.3%(12/13 cases), and mild genotype was 50.0% (4/8 cases).

Conclusions

The PAH gene variants of PKU patients in Jiangsu province are distributed mainly in exons 7, of which the highest frequency gene mutation is c. 721 c>T.Moreover, one novel variant c. 699C>G was reported for the first time.The PKU children inherit the PAH mutation gene mainly from both parents.There are definite correlation between the genotypes and phenotypes.

Key words:

Phenylketonuria; Phenylalanine hydroxylase; Mutations

Contributor Information

Chen Yafen

Department of Children Health Care, Wuxi Maternal and Child Health Hospital, Wuxi 214002, Jiangsu Province, China

Jiang Xinye

Chen Zhonghai

Jia Haitao

Pei Jingjing

Qiu Yali

Wu Zhijun

Wang Jing

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