探讨miRNA-101、ZESTE基因增强子同源物2 (EZH2)及转化生长因子(TGF)-β1在幼鼠单侧输尿管完全梗阻(CUUO)肾脏中的表达和意义。
选取30只SD雄性幼鼠，周龄(6±1)周，体质量(150±10) g，采用随机数字表法分为sham组、CUUO 7 d组、CUUO 14 d组，每组10只。分别于梗阻后7 d及14 d处死取其梗阻侧肾脏，横断面切开分为均等的上下段2部分，上段部分用于Western blot检测肾脏TGF-β1及EZH2的表达；下段部分再纵切为均等的2部分，一部分用于实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同梗阻时间段肾脏miRNA-101的表达，另一部分用于免疫组织化学及HE染色检测肾脏TGF-β1及EZH2的定性表达。
RT-PCR结果显示miRNA-101相对表达量：sham组是CUUO 14 d组的(12.69±1.60)倍，CUUO 7 d组是14 d组的(3.74±1.24)倍，3组间差异有统计学意义(P<0.05)；Western blot显示TGF-β1相对表达量在CUUO 14 d、7 d及sham组分别为1.14±0.12、1.04±0.14和0.76±0.18；EZH2相对表达量在CUUO 14 d、7 d及sham组分别为1.04±0.04、0.89±0.03和0.73±0.02；miRNA-101与EZH2表达呈负相关(r＝－0.92，P<0.05)，与TGF-β1表达呈负相关(r＝－0.63，P<0.05)，EZH2与TGF-β1表达呈正相关(r＝0.67，P<0.05)。不同梗阻时间肾脏miRNA-101、EZH2及TGF-β1的表达均具有明显相关性。
随着梗阻时间的延长，miRNA-101表达下降，EZH2及TGF-β1表达上升，提示miRNA-101可能通过调节幼鼠肾脏EZH2表达影响肾间质纤维化进展。
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先天性输尿管不全梗阻导致的患儿肾积水临床常见，且随着梗阻时间的延长，肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)程度逐渐加重。研究显示miRNA通过影响转化生长因子(TGF)-β1在器官及组织纤维化方面具有一定作用[1]，但具体通过何种途径影响RIF的进展，尚未见确切报道。本研究组前期研究结果显示，miRNA-101通过抑制SD雄性幼鼠肾脏肌动蛋白α(α-SMA)及钙黏附蛋白E(E-cadherin)等反映肾脏纤维化程度的指标表达，从而证实其影响RIF的进展过程[2]。果蝇ZESTE基因增强子同源物2(enhancer of ZESTE homolog 2，EZH2)是1996年首次被发现的基因。研究显示，在特发性肺纤维化疾病的发展过程中，EZH2通过沉默COX-2基因，从而影响前列腺素E2表达来降低纤维化的发展[3]，是否在RIF的发展过程中EZH2也有类似的作用，值得进一步研究。单侧输尿管完全梗阻(complete unilateral ureteral obstruction，CUUO)大鼠梗阻模型已为制作RIF的成熟模型，本实验选用CUUO幼鼠模型，探索EZH2在RIF进展中的作用。
无特定病原体(SPF)级健康雄性SD幼鼠30只，购自郑州大学动物实验中心，周龄(6±1)周，体质量(150±10) g，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为sham组、CUUO 7 d组、CUUO 14 d组，每组10只。
兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔抗体(康为世纪公司，北京)；兔抗TGF-β1抗体及链霉亲和素-生物素复合物法(SABC)免疫组织化学染色试剂盒(博士德生物，武汉)；浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥公司)。miRNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green Ⅰ荧光定量试剂盒(康为世纪公司，北京)；实时荧光定量PCR(RT-PCR)引物(捷瑞生物工程有限公司，上海)；兔抗TGF-β1抗体及兔抗EZH2抗体(abcam公司，英国)。
采用100 g/L水合氯醛0.4 mL/kg腹腔内注射麻醉，取其腹正中切口打开腹腔，暴露左侧输尿管，在肾静脉及腰静脉之间游离输尿管并完全结扎，逐层缝合基层皮肤，再次消毒包扎后放入恒温箱。
造模成功幼鼠分别于梗阻后7 d、14 d处死。取其梗阻侧肾脏，每个肾脏标本沿肾门水平横断切开分为均等的上下段2部分，上段部分用于Western blot检测肾脏TGF-β1及EZH2的表达；下段部分再纵切为均等的2部分，一部分用于RT-PCR检测不同梗阻时间段肾脏miRNA-101的表达，另一部分用于免疫组织化学及HE染色检测肾脏TGF-β1及EZH2的定性表达。
miRNA-101(目的)和U6(内参)的引物序列及扩增片段见表1。分别检测sham组、CUUO 7 d组及CUUO 14 d组miRNA-101的表达情况，肾脏组织miRNA提取按miRNA抽提试剂盒说明进行，用紫外分光光度法确定RNA浓度。cDNA合成以3 μg总RNA为模板，在miRNA 3'末端加多聚A尾的方法使miRNA具有Poly(A)尾，之后在使用Oligo(dT)-Universal tag，miRNA101特异性引物进行反转录反应，反应条件为37 ℃ 15 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。RT-PCR采用SYBR Green法，miRNA-101反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环，所有样品均做3个复孔。用2-△△Ct法计算相对定量。
miRNA-101和U6的聚合酶链反应引物序列
The polymerase chain reaction primer sequences of miRNA－101 and U6
miRNA-101和U6的聚合酶链反应引物序列
The polymerase chain reaction primer sequences of miRNA－101 and U6
| 指标 | 引物序列 | 扩增产物(bp) | |
|---|---|---|---|
| miRNA-101 | F | 5'-ACACTCCAGCTGGGTACAGTACTGTG－3' | 70 |
| R | 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3' | ||
| U6 | F | 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' | |
| R | 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' | 94 |
肾脏组织TGF-β1及EZH2表达用总蛋白裂解液提取肾脏总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度；每泳道上样40 μg蛋白，电泳、转膜后，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后再以HRP标记的二抗孵育；洗膜、加电化学发光(ECL)液，X线胶片暗室曝光。Image Pro Plus 6.0分析各条带的累积吸光度值，将各目的条带与同一泳道内参照GAPDH的累积吸光度值的比值作为该泳道中目的蛋白表达的半定量结果(相对表达量)。
多聚甲醛固定标本，常规石蜡包埋，4 μm切片，60 ℃烤片2 h，梯度乙醇脱蜡至水，过氧化氢孵育30 min消除内源性过氧化物酶，磷酸缓冲液(PBS)清洗后，微波抗原修复30 min，正常50 g/L牛血清清蛋白(BSA)封闭后滴加博士德生物公司兔抗TGF-β1多克隆抗体(1:300)及abcam公司兔抗EZH2多克隆抗体(1:300)4 ℃过夜，PBS清洗后，分别滴加生物素标记山羊抗兔二抗，37 ℃孵育15 min，HRP-DAB显色试剂盒显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。阴性对照采用sham组切片、PBS代替一抗，余步骤相同。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以
±s表示，各组间比较采用多组定量资料比较的单因素方差分析及Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
随着梗阻侧肾脏梗阻时间的延长，miRNA-101表达量降低，肾脏纤维化程度增加，可见其在维持肾小管纤维化方面具有一定作用。将其他组均与CUUO 14 d组比较，sham组相对表达量是CUUO 14 d组的(12.69±1.60)倍，CUUO 7 d组是14 d组的(3.74±1.24)倍，3组间比较差异有统计学意义(F＝570.74，P<0.05)，见表2。
实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-101在sham组、CUUO 7 d组和CUUO 14 d组梗阻肾脏中的相对表达水平(
±s)
The relative expression levels of miRNA－101 in sham group，CUUO 7 d group and CUUO 14 d group of obstruction renal by real time－polymerase chain reaction(
±s)
实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-101在sham组、CUUO 7 d组和CUUO 14 d组梗阻肾脏中的相对表达水平(±s)
The relative expression levels of miRNA－101 in sham group，CUUO 7 d group and CUUO 14 d group of obstruction renal by real time－polymerase chain reaction(±s)
| 组别 | 只数 | miRNA-101 | U6 | △Ct | △△Ct | 2－△△Ct |
|---|---|---|---|---|---|---|
| sham组 | 10 | 27.50±0.49 | 17.92±0.19 | 9.58±0.30 | －3.66±0.19 | 12.69±1.60 |
| CUUO 7 d组 | 10 | 27.31±0.95 | 15.91±0.14 | 11.40±0.81 | －1.82±0.51 | 3.74±1.24 |
| CUUO 14 d组 | 10 | 27.86±0.75 | 14.62±0.26 | 13.24±0.49 | －0.03±0.03 | 1.02±0.02 |
注：CUUO：单侧输尿管完全梗阻 CUUO：complet uniateral ureteral obstruction
TGF-β1及EZH2阳性表达呈棕黄色，TGF-β1主要集中在肾间质，EZH2主要集中在细胞核。TGF-β1及EZH2阳性表达显示：CUUO 14 d组染色强度最明显，CUUO 7 d组次之，sham组稍见黄染。HE染色可见CUUO 7 d组及14 d组肾间质逐渐增宽，纤维化程度逐渐加重，明显不同于sham组，见图1。
注：A、B、C分别为sham组、CUUO 7 d组及CUUO 14 d组HE染色情况；D、E、F分别为sham组、CUUO 7 d组及CUUO 14 d组TGF-β1表达情况；G、H、I分别为sham组、CUUO 7 d组及CUUO 14 d组EZH2表达情况;CUUO:单侧输尿管完全梗阻;TGF-β1:转化生长因子-β1;EZH2:果蝇ZESTE基因增强子同源物2 A, B, C were sham group, CUUO 7 d group and CUUO 14 d group HE staining, respectively；D, E, F were sham group, CUUO 7 d group and CUUO 14 d group TGF-β1 expression, respectively；G, H, I were sham group, CUUO 7 d group and CUUO 14 d group EZH2 expression；CUUO：complete unilateral ureteral obstruction;TGF-β1:transforming growth factor-β1；EZH2:enhancer of ZESTE homolog 2
随着梗阻侧肾脏梗阻时间延长，TGF-β1及EZH2表达增加。sham组、CUUO 7 d组、CUUO 14 d组梗阻侧肾脏TGF-β1相对表达量分别为0.76±0.18、1.04±0.14、1.14±0.12，3组比较差异有统计学意义(F＝16.25，P<0.05)；sham组、CUUO 7 d组、CUUO 14 d组梗阻侧肾脏EZH2相对表达量分别为0.73±0.02、0.89±0.03、1.04±0.04，3组比较差异有统计学意义(F＝253.51，P<0.05)，见图2。
不同组别梗阻肾脏miRNA-101表达水平与TGF-β1及EZH2表达均呈负相关(r＝－0.64，P<0.05；r＝－0.92，P<0.05)，随着梗阻侧梗阻时间延长，TGF-β1及EZH2表达增加，RIF程度越重。TGF-β1与EZH2表达呈正相关(r＝0.67，P<0.05)，提示EZH2可能影响RIF的发生发展。
RIF是各种慢性肾脏疾病进展到终末期衰竭的共同归路，是衡量慢性肾脏疾病病程进展的重要指标之一[4]。miRNA作为一种小分子RNA片段，广泛参与生物体中转录后水平基因表达的调控，对细胞的增殖与分化、胚胎的发育、信号传导及调控有重要作用。miRNA-101作为microRNA家族中的一员，国内外文献显示其主要在肿瘤的生长抑制方面具有一定的效果[5]，研究显示其在心肌间质及RIF过程中具有一定的保护作用[2,6]。TGF-β1是组织纤维化的重要介质，其表达升高直接反映器官及组织纤维化的加重，抗纤维化药物的开发一直将TGF-β1及其信号通路作为研究的治疗靶点[7]。EZH2是果蝇ZESTE基因增强子的人类同源物，是PcG蛋白复合体家族中多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)的重要成员之一，其主要维持同源异型基因的沉默状态。EZH2在多种上皮来源的恶性肿瘤中呈高表达，促进癌细胞的增殖、运动、侵袭和转移[8,9,10]，在这些过程中，上皮间质转化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)途径发挥了重要作用[11]。另有研究显示EMT和RIF是慢性肾脏病的一种病理过程[12]。说明EZH2也可能影响EMT途径参与了RIF的进展。
RIF是一个缓慢的、复杂的、逐渐变化的过程，尽管国内外已有不少关于其发病机制的研究，但至今尚未完全清楚。王芳等[13]研究显示Janus激酶-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)通路可能在肾小管间质疾病的发病和进展中起重要作用，利用α-氰基-(3，4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG490)阻断JAK-STAT通路的激活，单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型肾间质损害和纤维化程度明显减轻。Wei等[14]研究发现TGF-β/Smad信号的激活在肾小管间质纤维化的发病机制中起核心作用，其中黏着斑蛋白(Kindlin-2)的介导具有一定意义。近年来，新的RIF发生机制不断出现，Carvalho等[15]在胃肠癌组织中研究显示，miRNA-101表达下降导致EZH2表达的上升，从而引起了E-cadherin表达及功能的下降。Qazi等[16]在胰腺导管腺癌组织中研究显示，利用染色质免疫沉淀法不仅显示EZH2作用于E-cadherin启动子，而且显示癌细胞在转染pre-miRNA-101后，它们之间的相互作用明显减弱。E-cadherin除了在肿瘤细胞转移方面具有重要作用外，同时也是反映纤维化的一项特殊指标[2]，可见，上述指标可能同时也参与了器官或组织的纤维化过程。Greussing等[17]研究发现EZH2是miRNA101的靶基因，在人成纤维细胞中，其直接受miRNA 101的调节。Rao等[18]在卵巢癌的研究发现敲除EZH2基因后，卵巢癌中TGF-β1表达降低，推测miRNA-101可能通过抑制EZH2表达来间接影响TGF-β1在器官组织中的表达，是否在RIF中也存在相同的机制，值得研究。
UUO大鼠模型已为制作RIF的成熟模型，但由于不全梗阻模型在梗阻程度方面难以控制，本实验选用CUUO幼鼠模型，能确保梗阻程度的一致性，为探索EZH2在RIF进展的作用提供了可靠的模型。本实验选择时间段上处于RIF的早中期的7 d及14 d幼鼠CUUO模型作为研究对象，符合临床大多数患儿梗阻RIF的发病阶段，具有一定的研究意义。前期研究结果显示miRNA-101影响RIF的发生发展[2]，本结果显示随着CUUO时间的延长，RIF程度越严重，miRNA-101表达降低，EZH2表达升高，TGF-β1表达升高。相关性分析显示，miRNA-101表达与EZH2、TGF-β1表达呈负相关，EZH2与TGF-β1表达呈正相关，三者间彼此具有一定的关联性，不仅表明miRNA-101可能影响RIF的发生发展，而且可能是通过影响EZH2的表达调节TGF-β1的变化，进而影响RIF的发生发展。符合上述指标在癌症细胞中的表达变化，因此，这些指标不仅参与了肿瘤的发展变化，同时也影响着间质纤维化的不断进展。但此过程中间涉及到哪些生化信号转导通路，它们之间依靠什么途径相互影响，还有待进一步进行研究。
