了解GATA-4，-5，-6基因突变与先天性心脏病(CHD)的关系，为CHD患儿的早期预防及遗传咨询提供支持。
收集室间隔缺损患儿66例、房间隔缺损患儿84例及单纯性心脏圆锥动脉干畸形患儿48例的临床资料和外周静脉血样本，共198例CHD患儿；并以300例健康者为健康对照。应用聚合酶链反应(PCR)扩增GATA-4，-5，-6基因的全部外显子和两侧部分内含子，PCR产物纯化后以自动测序仪正反向测序。应用BLAST程序将所测GATA-4，-5，-6基因序列与GenBank中已知的序列进行比对，检测基因突变。
在1例室间隔缺损患儿和1例单纯性心脏圆锥动脉干畸形即永存动脉干畸形患儿中发现转录因子GATA-4相同的杂合子突变，第4外显子区c.799G>A，突变使转录因子蛋白第267位的缬氨酸被蛋氨酸取代即p.V267M，多物种氨基酸序列比对结果显示该突变氨基酸在进化上高度保守。转录因子GATA-5，-6在本组CHD患儿中筛查未发现突变。
CHD发生机制复杂，转录因子GATA-4突变与人类CHD的发生相关，转录因子GATA-4可能是人类CHD的易感基因。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是胚胎时期心血管发育异常导致的心脏形态、结构和功能异常的疾病。CHD危害婴幼儿生命健康，导致婴幼儿先天畸形，占婴幼儿出生缺陷的首位，其发病率呈逐年递增趋势，已由过去的6‰～8‰上升至10‰～12‰，病死率在新生儿非感染性死亡中占首位，约10‰[1,2]。CHD的病因目前尚不完全清楚。研究表明，遗传因素在CHD的发生机制中起重要作用，但其遗传方式、外显率均不清楚，易感基因也尚不确定[3,4]。在心脏发育过程中有众多基因参与，其中转录因子GATA-4，-5，-6对胚胎心脏发育至关重要[5]。因此，本研究在CHD患儿中进行转录因子GATA-4，-5，-6的突变筛查，为CHD的早期诊治和遗传咨询提供思路。
选择2010年5月至2013年5月在贵州省人民医院儿科就诊的198例CHD患儿。年龄0.5～16.0岁(中位数4.5岁)。其中男108例，女90例；汉族96例，少数民族102例。患儿均根据病史、体征、超声心动图和/或外科手术确诊。198例CHD患儿中室间隔缺损66例，房间隔缺损84例，法洛四联症29例，肺动脉闭锁/室间隔缺损、右心室双出口各6例，永存动脉干3例，主动脉弓中断、完全性大动脉转位各2例。健康对照组为在贵州省人民医院进行体检的300例健康儿童，既往无CHD史。年龄1～14岁(中位数5.5岁)；男162例，女138例。本研究经患儿监护人同意并签署知情同意书，并获得贵州省人民医院医学伦理委员会的批准。
抽取CHD患儿和对照组儿童外周血样本3 mL，置枸橼酸钠凝管中，－80 ℃ 冰箱冻存备用。采用血基因组DNA试剂盒(Qiagen公司，德国)抽提外周血基因组DNA，将DNA样本置－80 ℃冰箱保存备用。
根据GenBank数据库中GATA-4，-5，-6基因组DNA序列(登录号分别为：NC_000008，NC_000020，NC_000018)，应用Primer 3.0软件在线设计引物，合成由上海生工生物工程公司完成。基因引物序列及扩增片段大小见表1。
GATA-4，-5，-6基因引物序列及扩增片段大小
GATA－4，－5，－6 gene amplification primer sequence and fragment size
GATA-4，-5，-6基因引物序列及扩增片段大小
GATA－4，－5，－6 gene amplification primer sequence and fragment size
| 基因 | 外显子 | 正向引物序列(5'→3') | 反向引物序列(5'→3') | 片段大小(bp) |
|---|---|---|---|---|
| GATA-4 | 1 | GATCTTCGCGACAGTTCCTC | GTCTTCTGGGGCTGTGATGT | 920 |
| 2 | AAAGGGCATTGTTTCTGTGC | TGGTGGCTCCAGCTAACTCTA | 441 | |
| 3 | GAGATCTCATGCAGGGTCGT | GTTGAAAGCCCCTTCCAAAT | 397 | |
| 4 | CTTCTCGCAGCAGGTGTGT | GCTTGAGTTGAGCCTGCTTC | 393 | |
| 5 | GCCATCCCTGTGAGAACTGTA | TAGCTCACTGCTTGCACCTG | 439 | |
| 6 | CAGCCTAGACCTCCCAAGC | TTCCCAGTTGTTGTTCTGGA | 377 | |
| GATA-5 | 1 | CTCCACACCTGTCCCTCTTC | ACCCAGGTTTACTCGTCTCG | 729 |
| 2 | CCATGAGCTGGGGAGGAT | GCGCTCTCAAAGAAGACCTG | 419 | |
| 3 | GAGCTCACGACCTTCTCACC | GTGCCGTGAGTGTAACAGGA | 450 | |
| 4 | AATGGGAATCCAGCTCCAC | GGACTTCCAGAGGACTGTGC | 387 | |
| 5 | GGTGTGACCGTGAGGAGTCT | AGAGCCAGCTCTAGGGGAAG | 413 | |
| 6 | TGGGAGCTCCTGACCTAAGA | CTCACCAGCCTTCTTGCTCT | 447 | |
| GATA-6 | 1 | CCGTCCCCTCCCCACCCTCTTT | GAGATCGCGCGCGAGGAGGAAGCA | 361 |
| 2-1 | TGGAGGCGAGGTAGCGTGCAG | CTCGGGTGCGAAGGGGCTCAG | 544 | |
| 2-2 | CCCGCTCGCTGCTGCTCAGTT | CCATGGGCGGGCTGGGAGAGT | 591 | |
| 2-3 | CACCTGCAGGGGTCGGGCAGT | AAACAGGGCCCGAGTGGAGCA | 616 | |
| 3 | CTACTGGGGCGCTCCGGGTGT | AGCGGGTGGGCGTTGGAACAG | 583 | |
| 4 | TGGAGAAGAAACCAGGGATGA | TGCATTCAAATTTTTCACTTGAG | 590 | |
| 5-6 | CGGCGGCCAAATTCTTTTA | AACCATAAAAAAATGATACCGATCT | 619 | |
| 7 | TGGCCAGGGTCAGGTCAGTGG | GAGTGGCCCAAGCGCCCAGTT | 610 |
以基因组DNA为模板，对GATA-4，-5，-6基因的全部外显子和部分内含子进行PCR扩增。GATA-4 PCR的反应体系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，TaKaRa Taq 0.25 μL，上、下游引物各1 μL，基因组DNA 2 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL。反应参数：94 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，终末72 ℃延伸5 min，39个循环。GATA-5 PCR的反应体系25 μL：2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，TaKaRa Taq 0.25 μL，基因组DNA 1 μL，灭菌蒸馏水5.25 μL。反应参数：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，终末72 ℃延伸5 min，30个循环。GATA-6 P1、P2-1、P2-2、P2-3、P3和P7片段PCR反应体系10 μL：2×GC Buffer I 5 μL，dNTP 0.2 μL，Primer(s) 1 μL，HotTaq 0.06 μL，灭菌蒸馏水2.74 μL，DNA模板1 μL。反应参数：95 ℃预变性2 min，96 ℃变性10 s，72 ℃ 退火、延伸4 min，35个循环，反应终止后置4 ℃保存。GATA-6 P4、P5-6片段反应体系10 μL：2×GC Buffer I 1 μL，dNTP 0.2 μL，MgCl2 0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，HotTaq 0.06 μL，灭菌蒸馏水6.54 μL，DNA模板1 μL。反应参数：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s、62 ℃40 s，72 ℃延伸2 min，11个循环；94 ℃变性20 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，24个循环，35个循环，反应终止后置4 ℃保存。
反应体系8 μL：每个体系含有PCR反应产物6 μL，虾碱酶0.5 μL，外切酶0.5 μL，灭菌蒸馏水1 μL。PCR扩增循环参数：37 ℃ 60 min，80 ℃15 min。将PCR产物中的各种离子、三磷酸脱氧核糖核酸、引物等小片段寡聚核苷酸筛除，纯化目的片段；纯化后取2.5 μL在琼脂糖凝胶电泳定量后以备测序。
将GATA-4，-5，-6基因组DNA的PCR纯化产物在ABI Genetic Analyzer 3100型DNA测序仪中进行测序。将发现突变的样本重复正反向测序，验证结果的可靠性。
应用Chromas 2.21软件分析测序结果，利用NCBI BLAST程序将结果与GenBank人类GATA-4，-5，-6基因组DNA序列进行比对，并与PubMed数据库、单核苷酸多态性数据库以及公布的人类GATA-4，-5，-6基因变异位点进行比较分析，找出突变位点。
登陆GenBank数据库获得多物种GATA-4，-5，-6蛋白质氨基酸序列，采用Cluster W软件分析突变氨基酸保守性。
分别在1例室间隔缺损和1例永存动脉干患儿中识别出GATA-4基因相同的1个错义突变，即编码核苷酸序列第799位的鸟嘌呤变为腺嘌呤，即c．799G>A，突变使转录因子蛋白第267位的缬氨酸被蛋氨酸取代即p.V267M，同时，在300例健康对照中未发现该位点的突变。本研究突变率为1.0%(2/198例)，转录因子GATA-5，-6在本组CHD患儿病例中筛查未发现突变，见图1。
The DNA sequence result of GATA－4 gene mutation in exon 4
注：A：房间隔缺损和永存动脉干患儿p.V267M错义突变测序图，箭头示第799碱基发生G→A转换；B：健康对照组测序图，箭头示正常碱基 A：sequence of heterozygous p．V267M mutation with patients of atrial septal defects and persistent truncus，arrow displayed G to A transition of nucleotide 799；B：normal sequencing diagram，arrows displayed the normal nucleotide
The DNA sequence result of GATA－4 gene mutation in exon 4
第267位缬氨酸在进化上高度保守(phyloP：0.89[-5.2；1.1]，up to Frog，considering 12 species)。该突变位于GATA蛋白锌指结构功能域中，可能影响转录因子的功能，见图2。
Multiple sequence alignment of GATA－4 protein from various species
Multiple sequence alignment of GATA－4 protein from various species
人类GATA基因家族包括6个成员，其中，转录因子GATA-1，-2，-3主要作用于造血组织的发育，而GATA-4，-5，-6主要对心脏基因表达调节，它们在胚胎发育和心脏血管的发育中起重要作用[5]。动物模型研究发现在小鼠胚胎和心脏发育的整个过程中均有转录因子GATA-4的表达。其中，孕7.0～7.5 d GATA-4基因开始表达；孕8 d，线性心管形成的时候可见GATA-4基因表达，也表达于心肌层和心内膜；孕9 d，心脏分隔开始形成的时候GATA-4基因呈高表达，遍及整个心肌层和心内膜垫组织[6]；孕12.5 d，部分性失活GATA-4基因小鼠因心内膜垫不能形成和重塑，导致小鼠胚胎死亡。此外，GATA-4基因单倍剂量不足可导致包括共同房室通道、右心室双出口、心室肌发育不良等心脏畸形[7]。
在胚胎发育中转录因子GATA-6大量表达在心脏神经嵴，并调节主肺动脉分隔的发育。GATA-6基因敲除纯合子小鼠导致内、外胚层发育缺陷而致小鼠胚胎死亡[8,9]，部分性失活GATA-6基因导致圆锥动脉干发育异常，小鼠胚胎显示永存动脉干、主动脉弓中断和右心室双出口的发生[8]。虽然GATA-4，-5，-6基因有重叠表达的模式，而与GATA-4和GATA-6基因比较，GATA-5基因的表达受到一些限制，尤其在胚胎心内膜垫形成和心脏流出道形成时，随着胚胎的发育该基因的表达逐渐减少。但GATA-4，-5基因杂合敲除可致小鼠心室壁变薄，GATA-5 基因纯合敲除可致小鼠出现房间隔、室间隔和心内膜垫缺损较严重的心脏畸形而致小鼠胚胎死亡。提示转录因子GATA-4，-5，-6均为心脏早期发育的标志，起协同互补作用并调节下游靶基因，GATA-5基因与GATA-4，-6基因均为CHD的候选基因[10,11]。
2003年Garg等[12]首次证实了转录因子GATA-4突变是导致人类CHD的致病原因之一。随后的研究报道转录因子GATA-4突变与人类家族性房间隔缺损、法洛四联症、室间隔缺损、心内膜垫缺损和右心室双出口的发生相关[13]。目前GATA-4基因已在不同人群的CHD患儿中被报道[4]，截至2015年1月，人类基因突变数据库(HGMD)中已有100多种突变类型被收录，包括错义突变、无义突变、缺失等。2009年Kodo等[14]首次发现转录因子GATA-6突变导致人类永存动脉干的发生，之后相继报道了GATA-6基因突变可导致人类CHD的发生，本课题组前期对单纯性圆锥动脉干畸形患儿中进行GATA-6基因突变研究，也发现了3个错义突变(P.E51K、S184N和G245R)，并发现转录因子GATA-6与圆锥动脉干畸形的畸形发生相关[15]。此外，转录因子 GATA-5 突变与人类CHD的发生相关在近年来也相继报道[16,17]。
本研究对CHD患儿进行转录因子GATA-4，-5，-6的突变筛查，结果在1例室间隔缺损和1例永存动脉干患儿中识别出GATA-4基因相同的1个错义突变(即c.799G>A，p.V267M)。人类GATA-4基因定位于8p23.1～p22，包含7个外显子，全长3 419 bp，编码442个氨基酸；其基因结构包括了转录激活域、2个锌指结构域和核定位信号域，本研究识别的GATA-4 p．V267M使非极性、疏水性的缬氨酸突变成极性、中性的蛋氨酸，推测该突变可能对蛋白质的结构、稳定性或空间构象产生影响；同时p.V267M位于GATA-4基因2个锌指结构域之间，推测突变影响其转录活性而导致心脏畸形的发生。另外，GATA-4基因p.V267M该位点的突变在动脉导管未闭和房间隔缺损患者中曾见有报道[18]，提示该位点的突变可能参与多种类型CHD的发生，转录因子GATA-4可能是人类CHD的易感基因。而转录因子GATA-5，-6在本研究CHD患儿中的筛查未发现突变，考虑可能与样本病例相关，可扩大CHD样本量的筛查揭示转录因子GATA-5，-6在CHD中的发生机制。
此外，本研究突变率仅为1.0%，提示CHD发生机制的复杂性、外显率和易感基因的不确定性，虽然目前对人类CHD的发生机制取得了一定的突破和进展，但医学研究者仍任重而道远。
