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• 血液/肿瘤疾病 •
再生障碍性贫血患儿异基因造血干细胞移植前后免疫功能监测的意义
中华实用儿科临床杂志, 2016,31(3) : 199-202. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.03.009
摘要
目的

通过动态监测再生障碍性贫血(AA)患儿行异基因造血干细胞移植后＋1、＋3、＋6和＋12个月CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD56+、CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平，探讨AA患儿免疫功能与发病机制之间的关系及与发生移植物抗宿主病(GVHD)的意义。

方法

选取2013年1月至2014年1月在安徽医科大学附属北京军区总医院血液科行异基因造血干细胞移植的12例AA患儿，其中男4例，女8例；平均年龄7.92 (3～14)岁；人类白细胞抗原(HLA)配型全相合5例，HLA配型不全相合7例。采用流式细胞术动态监测AA患儿移植前及移植后＋1、＋3、＋6和＋12个月CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD56+、CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平，健康对照组同期监测的12例健康儿童T淋巴细胞亚群水平。

结果

随访至2015年3月，移植前12例AA患儿中10例存在细胞免疫异常(CD4＋/ CD8＋比值倒置)，与健康对照组相比，AA患儿移植前CD3＋细胞略高、分别为(66.79±7.35)%和(62.74±5.58)%(P＝0.043)，CD4＋细胞减低，分别为(33.73±7.26)%和(39.54±3.46)%(P＝0.037)，CD8＋细胞明显增高，分别为(35.69±6.78)%和(25.34±4.36)%(P＝0.000)，CD4＋/CD8＋比值明显减低，分别为1.23±0.56和1.78±0.34(P＝0.001)，CD56+细胞明显降低，分别为(7.46±2.80)%和(16.73±3.70)%(P＝0.000)，CD4＋CD25high＋FOXP3＋细胞明显降低，分别为(3.3±1.5)%和(8.1±1.3)%(P＝0.003)，差异均有统计学意义(P均<0.05)。移植后患儿CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD56+、CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平都有不同程度的恢复，基本在＋12个月恢复正常。移植后＋1、＋3、＋6和＋12个月，CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平在GVHD阳性组与阴性组分别为(0.4±0.6)%和(1.6±0.7)%，(0.7±0.3)%和(2.7±0.4)%，(1.1±0.5)%和(2.9±0.7)%，(1.4±0.3)%和(3.6±0.2)%，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

结论

AA患儿中有一部分是存在细胞免疫功能异常的。移植后CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平与急性GVHD的发生密切相关，临床可作为预测GVHD发生的参考指标。

引用本文: 童春, 郭智, 楼金星, 等.  再生障碍性贫血患儿异基因造血干细胞移植前后免疫功能监测的意义 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2016, 31(3) : 199-202. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.03.009.
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再生障碍性贫血(AA)是骨髓衰竭性疾病，临床预后极差，大部分患儿约1年内死于感染或出血等并发症[1]。目前认为免疫介导的造血功能抑制在AA发病过程中起重要作用，而T淋巴细胞是细胞免疫反应中的主要效应细胞[2]。造血干细胞移植(HSCT)是儿童AA的最有效的治疗方法，研究证实淋巴细胞亚群其中最主要的是调节性T淋巴细胞参与移植后免疫功能的重建[3]，因此动态监测AA患儿移植后免疫功能重建的意义重大，本研究通过采用流式细胞术动态监测移植前及移植后＋1、＋3、＋6、＋12个月患儿T淋巴细胞亚群水平，探讨免疫因素在AA发病机制中的作用，同时探讨移植物抗宿主病(GVHD)与CD4＋CD25high＋FOXP3＋之间的关系。

1　资料与方法
1.1　一般资料

选择2013年1月至2014年1月在安徽医科大学附属北京军区总医院血液科行异基因HSCT的AA[1]患儿共12例，其中男4例，女8例；平均年龄7.92(1～14)岁，同时采用简单随机抽样法选取12例同期体检的健康儿童作为健康对照组，其中男6例，女6例；平均年龄6.83(2～12)岁。移植方式分为人类白细胞抗原(HLA)配型全相合移植5例，HLA配型不全相合移植7例。根据患儿移植后有无发生GVHD，分为GVHD阳性组和GVHD阴性组，2组性别、年龄、诊断、HLA配型、预处理方案及GVHD的预防均具有可比性。移植前全面检查患儿各重要器官功能，均不合并严重的基础疾病或重要脏器功能不全，同时患儿家长知情并签署知情同意书，移植方案经医院医学伦理委员会批准。患儿基本资料见表1。

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表1

行异基因造血干细胞移植的12例再生障碍性贫血患儿基本资料

Table 1

The basic data of 12 aplastic anemia children with allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

表1

行异基因造血干细胞移植的12例再生障碍性贫血患儿基本资料

Table 1

The basic data of 12 aplastic anemia children with allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

病例性别年龄(岁)HLAa配型输注有核细胞数(×108/kg)输注CD34+细胞数(×106/kg)随访时间(个月)并发症结局
1男35/108.473.256肺炎、肠道GVHD死亡
2女26/105.382.5212肺炎存活
3女1210/1010.842.9712肺炎、肠道GVHD死亡
4男810/105.566.8114肺炎存活
5男15/107.993.3715出血性膀胱炎、脓毒症存活
6女85/1015.5414.7316脓毒症、皮肤GVHD存活
7男910/1014.2210.1617出血性膀胱炎、皮肤GVHD存活
8女1110/1016.399.0918巨细胞病毒血症、肠道GVHD存活
9女146/108.964.1222肝脏GVHD存活
10女610/1011.162.9024肺炎、口腔感染存活
11女105/1012.458.6325皮肤GVHD存活
12女117/1011.179.3726肺炎、肠道GVHD存活

注：HLA：人类白细胞抗原；GVHD：移植物抗宿主病　HLA：human leukocyte antigen；GVHD：graft versus host disease

1.2　移植方案

均采用降低强度预处理方案。(1)HLA配型全相合5例采用氟达拉滨(Flu)＋环磷酰胺(CTX)＋抗人淋巴细胞免疫球蛋白(ATG)方案，具体方案如下：Flu 30 mg/(m2·d)，－5、－4、－3、－2 d(即移植前第5、4、3、2天)；CTX 40 mg/(kg·d)，－4、－3 d；ATG 5 mg/(kg·d)，－4、－3、－2、－1 d。(2)HLA配型不全7例患儿采用白舒非(Bu)＋ Flu＋ CTX＋ATG方案，具体方案如下：Bu 3.2 mg/(kg·d)，－6 d；Flu 30 mg/(m2·d)，－5、－4、－3、－2 d；CTX 40 mg/(kg·d)，－5、－4 d；ATG 5 mg/(kg·d)，－4、－3、－2、－1 d。移植方式采用骨髓联合外周血干细胞移植，供者接受粒细胞集落刺激因子动员[5～10 μg/(kg·d)]，共5～6 d，动员第5天采集供者骨髓混悬液，第6天血细胞分离机采集供者外周血干细胞。GVHD预防采用环孢素加短程甲氨蝶呤联合霉酚酸酯、他克莫司。

1.3　淋巴细胞亚群检测方法

采集患儿及健康对照组儿童静脉血3～4 mL进行T淋巴细胞亚群检测，取2支FACS试管(BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪配套试管)各加入抗凝全血100 μL，其中一管加入CD3－APC(别藻蓝素)、CD8－APC、CD4－FITC(异硫氰酸荧光素)、CD45－PerCP－Cy5.5(叶绿素蛋白偶联物)、CD56－PE(藻红蛋白)单抗各10 μL，混匀后室温避光孵育20 min，然后加入FACS配套红细胞溶血素红细胞裂解液裂解红细胞待测。另一管加入CD4－FITC、CD45－VioGREENA、CD25－APC各10 μL，以上抗体均为细胞膜抗体。

1.4　胞内标记检测FOXP3

采用胞内标记方法检测FOXP3抗体。

1.5　随访

随访至2015年3月，平均随访时间17.3个月(6～26个月)，存活患儿随访时间均超过1年，最长随访时间为26个月，分析移植后全部患儿植入情况、移植并发症及无病生存等情况，采用流式细胞术动态监测AA患儿移植前及移植后＋1、＋3、＋6和＋12个月CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD56+、CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平，同期监测12例健康儿童T淋巴细胞亚群水平，并统计全组患儿总体生存率。

1.6　统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，各计量资料采用±s表示，2组之间比较符合正态分布采用t检验，否则采用非参数检验；生存分析采用Kaplan－Meier方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　移植效果

随访至2015年3月，患儿移植后均获造血重建，中性粒细胞≥0.5×109/L和血小板≥20×109/L的平均时间分别为16.8 d和18.5 d。移植后8例发生急性GVHD，无慢性GVHD发生。移植后发生肺部感染6例，巨细胞病毒血症2例，出血性膀胱炎2例，脓毒症1例，口腔感染1例。因急性GVHD死亡1例，因肺部感染死亡1例，其余10例存活。全组患儿生存曲线见图1。

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图1
行异基因造血干细胞移植的12例再生障碍性贫血患儿Kaplan－Meier生存曲线
Figure 1
Kaplan－Meier survival curves of 12 cases with aplastic anemia under allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
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图1
行异基因造血干细胞移植的12例再生障碍性贫血患儿Kaplan－Meier生存曲线
Figure 1
Kaplan－Meier survival curves of 12 cases with aplastic anemia under allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
2.2　移植前T淋巴细胞亚群对比

与健康对照组相比，AA患儿移植前CD3＋细胞高，CD4＋细胞减低，CD8＋细胞明显增高，CD4＋/CD8＋比值明显减低，CD56+细胞明显降低，CD4＋CD25high＋FOXP3＋细胞明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)，12例AA患儿中，10例AA患儿存在细胞免疫异常(CD4＋/CD8＋比值倒置)，见表2。

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表2

健康对照组儿童与再生障碍性贫血患儿外周血T淋巴细胞亚群的比较(%，±s)

Table 2

Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between the healthy control group and aplastic anemia cases(%，±s)

表2

健康对照组儿童与再生障碍性贫血患儿外周血T淋巴细胞亚群的比较(%，±s)

Table 2

Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between the healthy control group and aplastic anemia cases(%，±s)

组别例数CD3＋CD4＋CD8＋CD4＋/CD8＋CD56+CD4＋CD25high＋FOXP3＋
健康对照组1262.74±5.5839.54±3.4625.34±4.361.78±0.3416.73±3.708.1±1.3
再生障碍性贫血组1266.79±7.3533.73±7.2635.69±6.781.23±0.567.46±2.803.3±1.5
t值　2.3732.4434.0763.7924.0763.413
P值　0.0430.0370.0000.0010.0000.003
2.3　移植后T淋巴细胞亚群变化

移植后1个月CD3＋细胞比例明显减少(P<0.05)，3个月CD3＋细胞数逐渐恢复至移植前水平，CD8＋细胞移植后3个月已基本恢复甚至超过移植前水平，CD4＋细胞恢复较迟，CD4＋/CD8＋比值持续倒置超过1年；CD56+细胞于移植后1个月降低明显，移植后3个月逐渐恢复。CD4＋CD25high＋FOXP3＋细胞在移植后早期表达较低，见表3。

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表3

再生障碍性贫血患儿移植前后T淋巴细胞亚群水平比较(%，±s)

Table 3

Comparison of T lymphocyte subsets in children with aplastic anemia before and after transplantation(%，±s)

表3

再生障碍性贫血患儿移植前后T淋巴细胞亚群水平比较(%，±s)

Table 3

Comparison of T lymphocyte subsets in children with aplastic anemia before and after transplantation(%，±s)

组别例数CD3＋CD4＋CD8＋CD4＋/CD8＋CD56+CD4＋CD25high＋FOXP3＋
移植前1266.79±7.3533.73±7.2635.69±6.781.23±0.567.46±2.803.3±1.5
移植后/＋1个月1248.00±28.20a20.80±23.70a20.20±23.80a1.50±2.70a5.35±3.20a1.2±1.1a
　＋3个月1258.10±27.1010.80±7.7051.30±18.800.20±0.2012.65±3.601.1±0.9
　＋6个月1263.90±28.4023.70±7.6037.50±28.301.00±0.9013.78±2.101.6±1.7
　＋12个月1279.10±6.5028.00±2.9047.40±6.100.60±0.1015.73±4.701.3±0.6

注：与移植前相比，aP<0.05　Compared with before transplantation，aP<0.05

2.4　CD4＋CD25high＋FOXP3＋与GVHD的相关性

CD25high＋FOXP3＋比例在GVHD阳性组和GVHD阴性组的差异具有统计学意义(P<0.01)，见表4。

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表4

GVHD阴性组与GVHD阳性组再生障碍性贫血患儿CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平比较(%，±s)

Table 4

Comparison of the level of CD4＋CD25high＋FOXP3＋ in children with aplastic anemia between GVHD negative and GVHD positive group(%，±s)

表4

GVHD阴性组与GVHD阳性组再生障碍性贫血患儿CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平比较(%，±s)

Table 4

Comparison of the level of CD4＋CD25high＋FOXP3＋ in children with aplastic anemia between GVHD negative and GVHD positive group(%，±s)

组别例数CD4＋CD25high＋FOXP3＋
＋1个月＋3个月＋6个月＋12个月
GVHD性组41.6±0.72.7±0.42.9±0.73.6±0.2
GVHD阳性组80.4±0.60.7±0.31.1±0.51.4±0.3
t值　3.0164.0763.1193.247
P值　0.0070.0000.0050.006

注：GVHD：移植物抗宿主病　GVHD：graft versus host disease

3　讨论

HSCT移植后患儿免疫功能重建需要相当长的一段时间，造血干细胞在骨髓中产生淋巴系造血干/祖细胞后可迁徙至胸腺，在胸腺中增殖、分化和成熟[4,5]，一般CD3＋ T淋巴细胞数量于移植后3个月逐渐恢复正常，而CD4＋T淋巴细胞减少持续1年以上，CD8＋T淋巴细胞恢复较快，CD4＋/CD8＋比例倒置持续1年以上，其原因可能为CD4＋T淋巴细胞的生成主要依赖胸腺，而CD8＋T淋巴细胞的生成和成熟不完全依赖胸腺[6]。相关研究显示，淋巴细胞各亚群尤其是T淋巴细胞亚群的动态平衡与机体免疫功能状态密切[7]，异基因HSCT显著提高了AA患儿的无病生存率，移植后疗效与感染、GVHD等移植相关并发症相关，免疫功能的恢复可减少移植相关并发症[8]。所以，监测移植后免疫功能重建过程对改善移植效果有重要意义。

对于T淋巴细胞在AA发病机制中的作用，目前认为CD4＋/CD8＋比值是人体免疫系统内环境稳定最重要的指标，CD4＋与CD8＋细胞比例失衡是导致AA患儿造血功能抑制的根本原因。本研究中相当一部分AA患儿外周血中T淋巴细胞亚群存在失衡，主要表现为CD8＋细胞比例增多，CD4＋细胞比例减少，CD4＋/ CD8＋比值倒置。此外大多数AA患儿体内自然杀伤细胞的数量和活性均有显著降低[9]。正常状态下机体不存在自身免疫反应，最重要的原因就是CD4＋CD25+FOXP3＋调节性T淋巴细胞的存在抑制了自身反应性T淋巴细胞的活化[10]。FOXP3特异性地表达于CD4＋CD25+调节性T淋巴细胞的胞质中，介导调节性T淋巴细胞在胸腺的发育及其在外周的表达，并维持其免疫抑制功能[11,12]。Magenau等[13]研究证实CD4＋CD25high＋FOXP3＋可作为预测急性GVHD和判断预后的一项有价值的生物学标志物，大多数AA患儿CD4＋CD25+FOXP3＋调节性T淋巴细胞减少，这可能减弱T淋巴细胞免疫抑制功能，从而使效应性T淋巴细胞维持持久活化状态，最终导致自身免疫调节失衡。

本研究结果表明未发生急性GVHD的患儿CD4＋CD25high＋FOXP3＋的水平随着移植后时间的延长而增加，最终达到正常水平，而合并急性GVHD的患儿，CD4＋CD25high＋FOXP3＋的表达相对减少。没有患儿发生慢性GVHD，这可能与样本例数较少有关。

综上，CD4＋CD25high＋FOXP3＋水平与急性GVHD的发生密切相关，通过定期监测移植后患儿外周血CD4＋CD25high＋FOXP3＋表达水平，可先于临床症状出现前及时发现并预防急性GVHD，从而提高移植患儿的生存率。

参考文献
[1]
赵焱，谢晓恬．重型获得性再生障碍性贫血治疗新进展[J]．中华实用儿科临床杂志，2015，30(3)：236-238. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.03.019.
ZhaoY, XieXT.The latest treatment advances of severe acquired aplastic anemia[J].Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(3):236-238.DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.03.019.
[2]
苏雁，吴润晖，马洁，等．兔抗胸腺细胞球蛋白联合环孢素免疫抑制治疗儿童重型再生障碍性贫血的疗效[J]．中华实用儿科临床杂志，2015，30(3)：189-193. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.03.008.
SuY, WuRH, MaJ, et al.Evaluation of the efficacy of immunosuppressive therapy with rabbit－antithymocyte globulin combined with Cyclosporine in children with severe aplastic anemia[J].Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(3):189-193.DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.03.008.
[3]
LiJ, LuS, YangS, et al.Impaired immunomodulatory ability of bone marrow mesenchymal stem cells on CD4(＋) T cells in aplastic anemia[J].Results Immunol, 2012, 2(1):142-147.DOI:10.1016/j.rinim.2012.07.002.
[4]
郭智，陈惠仁，刘晓东，等．单倍型异基因造血干细胞移植治疗儿童重型再生障碍性贫血[J]．中华实用儿科临床杂志，2014，29(15)：1145-1148. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.15.007.
GuoZ, ChenHR, LiuXD, et al.Clinical analysis of haplotype allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for children with severe aplastic anemia[J].Chin J Appl Clin Pediatr, 2012, 2(1):142-147.DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.15.007.
[5]
HuttunenP, TaskinenM, SiitonenS, et al.Impact of very early CD4＋ /CD8＋ T cell counts on the occurrence of acute graft－versus－host disease and NK cell counts on outcome after pediatric allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].Pediatr Blood Cancer, 2015, 62(3):522-528.DOI:10.1002/pbc.25347.
[6]
丁丽，董磊，郑晓丽，等．单倍体相合造血干细胞移植后早期T细胞数量及功能初步分析[J]．中国实验血液学杂志，2013，21(3)：702-706. DOI: 10.7534/j.issn.1009-2137.2013.03.003.
DingL, DongL, ZhengXL, et al.Analysis of T lymphocyte absolute number and function in the early phase after haploidentical hematopoie－tic stem cell transplantation[J].J Exp hematol, 2013, 21(3):702-706.DOI:10.7534/j.issn.1009-2137.2013.03.003.
[7]
AhmedRK, PoiretT, AmbatiA, et al.TCR＋CD4－CD8－T cells in antigen－specific MHC class I－restricted T－cell responses after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].J Immunother, 2014, 37(8):416-425.DOI:10.1097/CJI.0000000000000047.
[8]
YamasakiS, Miyagi–MaeshimaA, KakugawaY, et al.Diagnosis and evaluation of intestinal graft－versus－host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation following reduced－intensity and myeloablative conditioning regimens[J].Int J Hematol, 2013, 97(3):421-426.DOI:10.1007/s12185-013-1297-9.
[9]
HuX, GuY, WangY, et al.Increased CD4＋ and CD8＋ effector me－mory T cells in patients with aplastic anemia[J].Haematologica, 2009, 94(3):428-429.DOI:10.3324/haematol.13412.
[10]
Kennedy–NasserAA, KuS, Castillo–CaroP, et al.Ultra low－dose IL－2 for GVHD prophylaxis after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation mediates expansion of regulatory T cells without diminishing antiviral and antileukemic activity[J].Clin Cancer Res, 2014, 20(8):2215-2225.DOI:10.1158/1078-0432.CCR-13-3205.
[11]
BaeKW, KimBE, KohKN, et al.Factors influencing lymphocyte reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in children[J].Korean J Hematol, 2012, 47(1):44-52.DOI:10.5045/kjh.2012.47.1.44.
[12]
CuzzolaM, FiaschéM, IacopinoP, et al.A molecular and computational diagnostic approach identifies FOXP3, ICOS, CD52 and CASP1 as the most informative biomarkers in acute graft－versus－host disease[J].Haematologica, 2012, 97(10):1532-1538.DOI:10.3324/haematol.2011.059980.
[13]
MagenauJM, QinX, TawaraI, et al.Frequency of CD4(＋)CD25(hi)FOXP3(＋) regulatory T cells has diagnostic and prognostic value as a biomarker for acute graft－versus－host－disease[J].Biol Blood Marrow Transplant, 2010, 16(7):907-914.DOI:10.1016/j.bbmt.2010.02.026.
　
　
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