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microRNA-21在急性肾损伤小鼠肾脏中的表达及意义
中华实用儿科临床杂志, 2016,31(6) : 441-444. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.011
摘要
目的

探究microRNA-21(miR-21)在急性肾损伤(AKI)小鼠肾脏再灌注不同时间点的表达及意义。

方法

将C57BL/6J小鼠分为3大组：对照组(C组)、假手术组(S组)和缺血再灌注组(IR组)，后2组又根据再灌注时间点各分为9个亚组。全自动生化仪检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平；HE染色观察肾脏病理损害情况；肾小管间质病理评分计量肾脏病理损害程度；实时荧光定量(RT)-PCR检测miR-21、丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)表达；免疫组织化学染色法检测肾组织MKK3表达。

结果

IR组再灌注之后Scr、BUN、肾脏病理损害评分水平逐渐增高，24 h达峰值，之后逐渐下降，IR组与S组同时间点亚组间在再灌注3～168 h的Scr、BUN、肾小管间质病理损害差异均有统计学意义(P均<0.01)；miR-21在肾脏缺血再灌注后表达逐渐上升，24 h达到峰值并稳定在此高值水平，与肾小管间质病理损伤呈正相关(r＝0.969，P<0.05)；IR组MKK3 mRNA及蛋白质表达在再灌注后逐渐上升，于24 h达到最高值，之后逐渐下降，IR组与S组3～168 h各相同时间点亚组MKK3 mRNA表达水平差异均有统计学意义(P均<0.01)；在0～168 h的MKK3蛋白质表达水平差异也有统计学意义(P<0.01)。

结论

miR-21在肾脏缺血再灌注后表达逐渐上升，24 h达峰值并稳定在此水平，且与肾小管间质病理损伤呈正相关，这种作用可能与miR-21调控MKK3相关。

引用本文: 邓旭, 李志辉, 康志娟, 等.  microRNA-21在急性肾损伤小鼠肾脏中的表达及意义 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2016, 31(6) : 441-444. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.011.
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急性肾损伤(AKI)是临床常见的危急重症，其病死率高达50%[1]，并呈逐年增高趋势。AKI还能增加患慢性肾脏疾病(CKD)的风险[2]及远隔器官的损伤[3]。AKI的发病机制不明，缺乏针对性的治疗靶点，是临床上十分棘手的难题。而缺血再灌注损伤(IRI)是引起AKI的主要原因。MicroRNAs(miR)是一种内源性产生的约22个核苷酸的单链小分子RNA，其通过其种子序列与靶基因3'非编码区(3'UTR)结合，导致靶基因降解或转录后翻译抑制[4]。本研究通过夹闭双侧肾蒂30 min，造成肾脏IRI，建立AKI小鼠模型，检测其肾功能、肾脏病理及miR-21的变化及意义。

1　材料与方法
1.1　材料

雄性6～8周龄(相当于人类8～11岁)C57BL/6J小鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可编号：SCXK(湘)2009～004]；丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)抗体(Santa Cruze公司，美国)；免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)；M-MLV、Oligo(dT)15 Primer、Taq[宝生物工程(大连)有限公司，中国]；普通PCR引物(上海生物工程技术有限公司，中国)；miR-21引物(广州锐博生物技术有限公司，中国)；全自动生化分析仪(西门子ADVIA 2400，德国)；梯度PCR仪(ABI Veriti 96，美国)；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国)；凝胶成像分析仪(FluorChem FC3，美国)。

1.2　方法
1.2.1　动物分组

采用随机数表法将76只小鼠(22～25 g)分为3大组：对照组(C组)4只，假手术组(S组)，缺血再灌注组(IR组)，除C组外，其余2组根据再灌注时间点分别分为9个亚组，各亚组4只，即再灌注后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h。

1.2.2　模型建立

IR组：3 mL/kg 100 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，腹部正中切口，游离双侧肾蒂，用无损伤动脉夹持续夹闭双侧侧肾蒂30 min，然后松开动脉夹，恢复灌注；S组仅游离但不夹闭双侧肾蒂，余同IR组；C组不做任何处理。

1.2.3　血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)检测

经腹主动脉抽取小鼠血。血标本3 000 r/min离心(离心半径20 cm)5 min处理，留取血清-70 ℃冰箱保存。全自动生化仪测小鼠Scr和BUN水平。

1.2.4　HE染色观察肾脏病理损害情况

2 μm石蜡切片、烘片、脱蜡后，行HE染色，中性树胶封片。

1.2.5　肾小管间质病理损害计量评分

采用盲法，由2名有经验的肾脏病理医师完成，每张切片在200倍光镜下随机选取皮髓质交接部10个不重叠视野观察肾脏病理损害并评分，正常为0分，受损肾小管间质面积<25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分，以此作半定量分析并计算其均值，评分值越高代表损伤程度越重[5]。

1.2.6　荧光定量PCR检测miR-21表达水平

用Trizol提取肾组织RNA，用茎环引物反转录成cDNA，SYBR Green染料进行PCR扩增。

1.2.7　反转录PCR检测MKK3 mRNA表达水平

用Trizol提取肾组织RNA，再反转录成cDNA，然后进行PCR扩增。MKK3上游引物5'-GTTCCTGGGCATTTGAGAAA-3'，下游引物5'-CGAAGTCCATTCATTCAGTTGT-3'。内参照选用GAPDH，上游引物5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游引物5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。反应条件为：95 ℃变性30 s；95 ℃10 s，55 ℃30 s，70 ℃ 1 min，共35个循环。15 g/L琼脂糖凝胶，100 V电泳45 min，凝胶成像系统获取及保存图像，DRAFT-alphaview软件分析图像中的条带灰度。

1.2.8　免疫组织化学染色法检测肾组织MKK3蛋白质表达及结果判断

4 μm肾组织石蜡切片，常规烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水→30 mL/L过氧化氢(H2O2)封闭→高温抗原修复→兔抗小鼠MKK3抗体4 ℃过夜→二抗孵育→DAB显色→苏木精复染→盐酸乙醇分化→碳酸锂返蓝→透明、封片，光镜下观察结果。阴性对照予PBS替代一抗，步骤同上。用莱卡显微镜图像系统采集图像，Image-pro plus 6.0软件分析其吸光度值(A值)。

1.3　统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析和处理；计量资料用±s表示；2组数据比较采用t检验；多组间的资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　各组小鼠Scr、BUN水平

C组与S组各亚组间的Scr水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。IR组IR后Scr水平逐渐升高，于再灌注24 h达到峰值，之后逐渐降低，但在再灌注168 h仍显著高于C组和S组。IR组在灌注3～168 h，Scr和BUN均高于S组同时间点亚组，见表1、表2。

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表1

对照组、假手术组和缺血再灌注组小鼠血肌酐水平表达(μmol/L，±s)

Table 1

Expression of serum creatinine in the control group, sham operation group and ischemia-reperfusion group mice (μmol/L，±s)

表1

对照组、假手术组和缺血再灌注组小鼠血肌酐水平表达(μmol/L，±s)

Table 1

Expression of serum creatinine in the control group, sham operation group and ischemia-reperfusion group mice (μmol/L，±s)

组别只数缺血再灌注时间
0 h3 h6 h12 h24 h48 h72 h120 h168 h
对照组422.51±2.58        
假手术组423.12±2.4623.32±2.4723.31±3.3123.31±3.2523.52±2.2823.36±2.3223.32±2.4623.01±2.3522.55±2.42
缺血再灌注组426.52±2.3270.32±3.2887.21±2.4292.32±2.46135.81±2.3283.25±2.3369.41±2.4252.32±3.3440.11±1.37
t值 2.0122.8931.1733.8669.0436.4326.7114.3512.63
P值 >0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
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表2

对照组，假手术组和缺血再灌注组小鼠血尿素氮水平表达(mmol/L，±s)

Table 2

Expression of blood urea nitrogen in the control group, sham operation group and ischemia-reperfusion group mice(mmol/L，±s)

表2

对照组，假手术组和缺血再灌注组小鼠血尿素氮水平表达(mmol/L，±s)

Table 2

Expression of blood urea nitrogen in the control group, sham operation group and ischemia-reperfusion group mice(mmol/L，±s)

组别只数缺血再灌注时间
0 h3 h6 h12 h24 h48 h72 h120 h168 h
对照组414.28±1.28        
假手术组414.51±2.1515.11±2.8115.23±1.9815.42±2.1116.15±2.3216.01±1.9915.76±2.0115.48±2.3614.85±2.51
缺血再灌注组415.13±2.2321.32±2.2125.87±2.4329.26±1.9843.15±2.5533.41±2.4330.15±2.3126.81±2.2124.13±2.51
t值 0.403.476.799.5715.6611.089.407.015.23
P值 >0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
2.2　各组小鼠肾脏病理及肾小管间质病理损伤评分比较

IR组小肾脏病理损害随着再灌注时间的推移逐渐加重，24 h达高峰，可见大范围肾小管上皮细胞肿胀、变性，部分肾小管上皮细胞刷状缘扁平、管腔扩张，部分肾小管上皮细胞可见片状坏死、脱落，肾小管基底膜裸露；部分扩张的肾小管管腔内可见大量上皮细胞碎片、红细胞管型，肾间质见灶性炎性细胞浸润。再灌注120 h、168 h，小鼠肾组织改变明显减轻，扩张的肾小管逐渐恢复正常，炎性细胞浸润减少(图1)。C组与S组各亚组间肾小管间质病理损害评分差异均无统计学意义(P>0.05)。再灌注3～168 h，IR组与S组同时间点亚组的肾脏病理损害差异均有统计学意义(P均<0.01)。

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图1
各组小鼠肾脏病理损伤比较
Figure 1
Comparison of renal damage of part of mice in each group
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注：A：对照组；B：假手术组；C：缺血再灌注0 h亚组；D：缺血再灌注24 h亚组；E：缺血再灌注168 h亚组；假手术组肾脏病理正常；缺血再灌注组再灌注后肾脏病理损伤逐渐加重，在再灌注24 h达到峰值，之后逐渐降低　A：control group；B：sham operation group；C：ischemia-reperfusion 0 h sub-group；D：ischemia-reperfusion 24 h sub-group；E：ischemia-reperfusion 168 h sub-group.Renal pathology of sham operation group was normal.After reperfusion，ischemia-reperfusion group's renal damage gradually increased，reached the peak at 24 hours followed reperfusion，and then gradually reduced

图1
各组小鼠肾脏病理损伤比较
Figure 1
Comparison of renal damage of part of mice in each group
2.3　各组小鼠肾组织miR-21表达水平及miR-21与肾小管间质病理损伤相关性分析

IR组再灌注后miR-21表达逐渐上升，12～24 h上升最快，再灌注24 h达峰值，为基线值的286.0倍，并稳定在此高值水平；S组miR-21一直持续低水平表达(图2A)。相关性分析示IR组肾脏miR-21与肾小管间质病理损伤评分程度在缺血再灌注后0～168 h呈正相关(r＝0.969，P<0.05)(图2B)。

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图2
假手术组和缺血再灌注组小鼠肾组织miR-21表达水平及miR-21与肾小管间质病理损伤相关性分析
Figure 2
Expression of miR-21 in renal and correlation analysis between tubulointerstitial pathological damage and expression of miR-21
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注：A：肾组织miR-21升高倍数比较；B：miR-21与肾小管间质病理损伤相关性分析　A：expression of miR-21 in renal；B：correlation analysis between tubulointerstitial pathological damage and expression of miR-21

图2
假手术组和缺血再灌注组小鼠肾组织miR-21表达水平及miR-21与肾小管间质病理损伤相关性分析
Figure 2
Expression of miR-21 in renal and correlation analysis between tubulointerstitial pathological damage and expression of miR-21
2.4　各组小鼠肾脏MKK3表达变化

C组与S组各亚组间MKK3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。IR组MKK3 mRNA再灌注后逐渐上升，于再灌注后24 h达最高值，之后逐渐下降。IR组与S组在再灌注3～168 h各相同时间点亚组MKK3 mRNA表达水平均具有统计学差异(P均<0.01)(图3)。C组与S组各亚组间MKK3蛋白质表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。IR组MKK3蛋白质表达水平在再灌注后逐渐上升，于再灌注后24 h达最高值，之后逐渐下降。再灌注0～168 h，IR组与S组各同时间点亚组的MKK3蛋白质表达水平差异有统计学意义(P均<0.01)(图4)。

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图3
各组小鼠肾脏MKK3 mRNA表达
Figure 3
Expression of MKK3 mRNA in mice kidney in each group
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注：MKK3：丝裂原活化蛋白激酶激酶3　MKK3：mitogen-activated protein kinase kinase 3

图3
各组小鼠肾脏MKK3 mRNA表达
Figure 3
Expression of MKK3 mRNA in mice kidney in each group
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图4
各组小鼠肾脏丝裂原活化蛋白激酶激酶3蛋白表达
Figure 4
Expression of mitogen-activated protein kinase kinase 3 protein in part of mice kidney in each group
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注：A：对照组；B：假手术组；C：缺血再灌注0 h亚组；D：缺血再灌注24 h亚组；E：缺血再灌注168 h亚组　A：control group；B：sham operation group；C：ischemia-reperfusion 0 h sub-group；D：ischemia-reperfusion 24 h sub-group；E：ischemia-reperfusion 168 h sub-group

图4
各组小鼠肾脏丝裂原活化蛋白激酶激酶3蛋白表达
Figure 4
Expression of mitogen-activated protein kinase kinase 3 protein in part of mice kidney in each group
3　讨论

IRI是引起AKI的主要原因。肾脏IRI发病机制复杂。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞外信号向细胞内传递的重要信号系统，普遍存在于多种生物，包括酵母和哺乳动物细胞。p38MAPK是MAPK信号通路的重要信号通路之一。p38MAPK能被白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1、血小板源性生长因子、活性氧、拉伸、渗透压、紫外线照射等激活[6]。p38MAPK有4种异构体，其中α、β、δ都能在肾脏表达。上游激酶—MKK3的活化能引起p38MAPK磷酸化而激活[6]。活化的p38MAPK导致胞质和胞核的各种靶标磷酸化，引起凋亡、炎症和纤维化等各种细胞内反应。研究证实，MKK3及p38MAPK在肾脏IRI中发挥了重要作用[7]，MKK3-/-大鼠能抑制MKK3-p38MAPK通路，对凋亡和炎症有抑制作用[8]。

miR是近年来研究的热点，在多种病理生理过程中发挥重要的作用。本研究发现IRI肾脏miR-21表达显著增高，12～24 h上升最快，24 h达到峰值，之后一直维持峰值不变。IRI肾脏持续高表达miR-21的病理生理学意义值得进一步探讨。本研究与Liu等[9]的研究结果相似，IR小鼠肾脏miR-21升高87.85倍。此外，Godwin等[10]研究也发现肾IRI的C57BL/6J小鼠肾脏细胞miR-21在IRI的开始就发生了改变，并且这种改变一直持续到整个实验过程。MiR-21可以通过下调各种靶基因的表达，对组织器官起保护作用[11]。本课题组之前的研究证实MKK3是miR-21的靶基因[12]。本研究通过夹闭双侧肾蒂30 min，造成肾脏IRI，建立小鼠AKI模型，观察各个再灌注时间点小鼠肾功能、肾脏病理、肾组织miR-21及MKK3的表达变化。结果显示：小鼠肾脏功能及肾脏病理损伤在再灌注后逐渐上升，于再灌注24 h达到峰值，之后逐渐降低。miR-21在缺血再灌注后逐渐上升，24 h达到峰值，此后维持在峰值水平，在再灌注0～5 h与肾小管间质病理损伤程度具有显著相关性。MKK3 mRNA及蛋白质表达在缺血再灌注后逐渐增高，再灌注24 h达到峰值，之后逐渐降低，与Scr、BUN水平及肾脏病理损害程度平行，说明肾脏IR后能激活MKK3表达，MKK3参与了肾脏IRI病理过程。

综上所述，MKK3是miR-21的靶基因，miR-21和MKK3在肾脏IRI中均起至关重要的作用。推测miR-21在肾脏IRI的作用可能与调控MKK3，进而调节下游p38 MAPK等通路相关。

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