刘翠; 刘舒; 黄锦达; 陈亦婷; 吕娟娟; 郑贵浪; 曾其毅

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.005

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• 重症医学 •

微小RNA-30e在脓毒症急性肺损伤大鼠中的表达及其与炎性因子水平的相关性

中华实用儿科临床杂志, 2016,31(6) : 417-420. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.005

摘要

目的

从体内和体外实验2个方面探讨微小RNA-30e(miR-30e)在脓毒症诱导急性肺损伤(ALI)发生时的差异表达及其与炎性因子IL-1β、TNF-α表达的相关性。

方法

30只雄性SD大鼠随机等量分为5组：正常对照组，脓毒症3、6、12、24 h组，腹腔注射脂多糖(LPS)10 mg/kg构建脓毒症大鼠ALI模型。体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383，分为空白对照组和以终质量浓度1 mg/L LPS刺激3、6、12及24 h组，采用反转录聚合酶链反应检测IL-1β、TNF-α及miR-30e表达水平，并观察大鼠肺组织病理改变。

结果

脓毒症组大鼠肺组织中IL-1β、TNF-α水平均较正常对照组明显上调，差异均有统计学意义(P均<0.01)；HE染色示脓毒症组大鼠肺组织呈ALI改变；脓毒症组大鼠3、6、12、24 h肺组织miR-30e表达水平分别为0.26±0.02、0.41±0.08、0.29±0.05和0.18±0.05，均明显低于正常对照组(1.23±0.24)，差异均有统计学意义(P均<0.01)；NR8383细胞中，与空白对照相比，LPS刺激不同时间点炎性因子IL-1β、TNF-α水平均明显上调，差异均有统计学意义(P均<0.01)；LPS刺激3、6、12、24 h时间点细胞中miR-30e表达水平分别为0.27±0.04、0.55±0.05、0.65±0.02、0.41±0.10，均明显低于空白对照组(1.17±0.21)，差异均有统计学意义(P均<0.01)；各实验组大鼠肺组织中miR-30e的表达与IL-1β、TNF-α水平均呈负相关(IL-1β：r＝-0.417，P＝0.022；TNF-α：r＝-0.437，P＝0.016)；LPS刺激NR8383细胞后不同时间点细胞中miR-30e的表达与IL-1β、TNF-α水平亦均呈负相关(IL-1β：r＝-0.713，P＝0.003；TNF-α：r＝-0.712，P＝0.002)。

结论

miR-30e在脓毒症大鼠诱导ALI发生时的表达量显著下调，并与炎性因子IL-1β、TNF-α表达水平呈负相关，有望成为脓毒症ALI早期诊断、治疗、预后评估新的生物学标志。

引用本文: 刘翠, 刘舒, 黄锦达, 等. 微小RNA-30e在脓毒症急性肺损伤大鼠中的表达及其与炎性因子水平的相关性 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2016, 31(6) : 417-420. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.005.

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脓毒症是由病原微生物感染引起的全身炎性反应综合征^[1,2,3]。微小RNAs又简称miRNAs，可在转录后水平调控蛋白的表达。近几年大量研究表明miRNA与脓毒症关系密切^[4,5,6]，有望成为脓毒症诊断、治疗和预后重要的生物学标志物。微小RNA-30e(miR-30e)是miR-30家族的成员之一，在脓毒症领域的研究报道较少。肺脏是脓毒症发生时最早受累的器官，本研究就脓毒症大鼠受损肺组织及脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞不同时间点miR-30e的差异表达展开研究，并通过探讨其与炎性因子表达的相关性来说明miR-30e在脓毒症诱导急性肺损伤(ALI)中所起的作用。

1　材料与方法

1.1　主要试剂

大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383(购自中国科学院细胞库)；Ham F-12K培养基(Sigma-Aldrich，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；LPS(E.coli，O111：B4，Sigma-Aldrich，美国)，TRIzol RNA提取液(Invitrogen，美国)，PrimeScript反转录试剂盒和实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(Takara，日本)，PCR引物(Invitrogen，美国)，氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2　模型构建^[7]、分组及标本的采集

30只雄性SD大鼠(200～250 g，8周)，购自广东省医学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(粤)2013-0002。按照安全随机方法等量分为正常对照组和脓毒症3、6、12、24 h 4个时相组，脓毒症组大鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg(用9 g/L盐水溶解)，正常对照组腹腔注射等量9 g/L盐水。实验完成后，放血处死大鼠，取肺组织，一部分用40 g/L多聚甲醛溶液固定，用于病理切片；另一部分标本于-196 ℃液氮速冻，放于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3　实验方法

1.3.1　细胞培养及分组

大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养在含15 g/L胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠、2 mmol/L L-谷氨酰胺的Ham's F-12K培养基中，37 ℃，50 mL/L CO₂，2～3 d换液1次，3～4 d传代1次。按1×10³个/L接种于6孔板，每孔2 mL，实验分为5组：空白对照组及LPS(1 mg/L)处理3、6、12、24 h组，1 000 r/min(离心半径为15 cm)离心5 min收集细胞沉淀。

1.3.2　RT-PCR检测

肺组织总RNA和细胞总RNA的提取按照TRIzol试剂要求进行，用超微量紫外分光光度计测定总RNA 260 nm和280 nm处吸光度(A)值，鉴定纯度和测定浓度。反转录反应按照PrimeScript反转录试剂盒进行，PCR引物序列由上海捷瑞生物公司合成，引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 30 s，40个扩增循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)。采用ABI 7500荧光定量PCR仪检测和2^-ΔΔCt相对定量法进行数据分析。

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表1

PCR引物序列

Table 1

Primer synthesis sequence of PCR

表1

PCR引物序列

Table 1

Primer synthesis sequence of PCR

基因名称	序列号	引物序列(5'→3')
miR-30e	MIMAT0000805	TGTAAACATCCTTGACTGGAAG
TNF-α	NM_012675.3	上游：CCAACAAGGAGGAGAAGTTCC
		下游：CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC
IL-1β	NM_031512.2	上游：GGAACCCGTGTCTTCCTAAAG
		下游：CTGACTTGGCAGAGGACAAAG
GAPDH	NM_017008.4	上游：TGATTCTACCCACGGCAAGTT
		下游：TGATGGGTTTCCCATTGATGA

注：TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶　TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL-1β：interleukin-1β；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.3.3　肺组织病理学观察

取肺组织，经常规固定、脱水、包埋、切片、HE染色后，光镜下观察并拍照。

1.4　统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据以±s表示，不同时间点多个均数比较采用单因素方差分析，2组均数比较采用t检验，行相关性检验，双变量都服从正态分布时采用Pearson相关分析，不服从则采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　大鼠基本情况

正常对照组大鼠一般情况良好。LPS处理组大鼠出现精神反应差、呼吸急促、体温上升、肌张力下降、腹泻等内毒素血症表现，部分大鼠口鼻有红色泡沫样液体溢出。

2.2　大鼠肺组织病理改变

肺组织石蜡切片HE染色显示，正常对照组大鼠肺组织结构完整，形态正常，肺泡腔清晰，腔内无渗液，肺泡壁光滑，肺泡和肺间质无炎性细胞浸润(图1A)；脓毒症组大鼠肺组织可见结构破坏，肺泡膨胀不全、肺泡融合或塌陷，肺泡腔内有渗出液；肺泡间隔明显增厚，可见大量炎性细胞浸润；肺组织毛细血管扩张、淤血，管腔内充满红细胞，甚至有血栓形成，随着脓毒症炎症损伤时间的延长，肺组织损伤程度不断加重(图1B，图1C，图1D，图1E)。

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图1

正常对照组和各脓毒症组大鼠肺组织病理学改变(HE染色，×200)

Figure 1

Histopathologic observation of lung tissue of rats in normal control group and sepsis groups (HE staining，×200)

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注：A、B、C、D、E分别为正常对照组和脓毒症3、6、12、24 h组大鼠肺组织病理改变　A，B，C，D，E respectively for histopathologic observation of lung tissue in normal control group and 3，6，12，24 hours sepsis group

图1

正常对照组和各脓毒症组大鼠肺组织病理学改变(HE染色，×200)

Figure 1

Histopathologic observation of lung tissue of rats in normal control group and sepsis groups (HE staining，×200)

2.3　大鼠肺组织IL-1β、TNF-α的表达水平

脓毒症3、6、12、24 h组IL-1β、TNF-α的表达较正常对照组显著上升，差异均有统计学意义(P均<0.01)，且在脓毒症3 h时达到最高峰，随后开始下降(表2)。

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表2

正常对照组和各脓毒症组大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、miR-30e的表达(±s)

Table 2

Changes of IL-1β，TNF-α and miR-30e levels of rats in normal control group and sepsis groups(±s)

表2

正常对照组和各脓毒症组大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、miR-30e的表达(±s)

Table 2

Changes of IL-1β，TNF-α and miR-30e levels of rats in normal control group and sepsis groups(±s)

组别	例数	IL-1β	TNF-α	miR-30e
正常对照组	6	0.90±0.85	0.83±0.24	1.23±0.24
脓毒症3 h组	6	103.84±5.87^a	85.80±9.84^a	0.26±0.02^a
脓毒症6 h组	6	18.98±5.14^a	19.00±1.25^a	0.41±0.08^a
脓毒症12 h组	6	2.93±0.23^a	2.97±0.39^a	0.29±0.05^a
脓毒症24 h组	6	4.46±0.20^a	4.78±1.33^a	0.18±0.05^a
F值		950.977	387.084	39.707
P值		0.000	0.000	0.000

注：IL-1β：白细胞介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；与正常对照组比较，^aP<0.01　IL-1β：interleukin-1β；TNF-α：tumor necrosis factor-α；compared with normal control group，^aP<0.01

2.4　大鼠肺组织miR-30e的表达

脓毒症组大鼠肺组织miR-30e表达较正常对照组明显下降，差异均有统计学意义(P均<0.01)，其中脓毒症24 h组下降最明显(表2)。

2.5　LPS刺激NR8383后细胞中IL-1β、TNF-α的表达水平

LPS刺激3、6、12、24 h后细胞中IL-1β、TNF-α的表达水平较空白对照组显著上升，差异均有统计学意义(P均<0.01)，在LPS 3 h组时达到最高峰，随后开始下降(表3)。

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表3

LPS刺激NR8383后细胞中IL-1β、TNF-α、miR-30e的表达变化(±s)

Table 3

Changes of IL-1β，TNF-α and miR-30e levels in rat alveolar macrophages after stimulated with LPS at different time points(±s)

表3

LPS刺激NR8383后细胞中IL-1β、TNF-α、miR-30e的表达变化(±s)

Table 3

Changes of IL-1β，TNF-α and miR-30e levels in rat alveolar macrophages after stimulated with LPS at different time points(±s)

组别	样本数(孔)	IL-1β	TNF-α	miR-30e
空白对照组	3	0.94±0.90	0.88±0.14	1.17±0.21
LPS 3 h组	3	32.05±5.95^a	162.79±18.27^a	0.27±0.04^a
LPS 6 h组	3	22.85±5.20^a	89.50±15.71^a	0.55±0.05^a
LPS 12 h组	3	8.61±0.66^a	13.17±0.99^a	0.65±0.02^a
LPS 24 h组	3	7.90±0.24^a	9.76±2.14^a	0.41±0.10^a
F值		38.091	124.931	30.967
P值		0.000	0.000	0.000

注：LPS：脂多糖；IL-1β：白细胞介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；与空白对照组比较，^aP<0.01　LPS：lipopolysaccharide；IL-1β：interleukin-1β；TNF-α：tumor necrosis factor-α；compared with blank control group，^aP<0.01

2.6　LPS刺激NR8383后细胞中miR-30e的表达水平

LPS刺激3、6、12、24 h后细胞中miR-30e表达水平较空白对照组明显下降，差异均有统计学意义(P均<0.01)，其中LPS 3 h组下降最明显(表3)。

2.7　相关性研究

各实验组大鼠肺组织中miR-30e与IL-1β及TNF-α水平均呈负相关(IL-1β：r＝-0.417，P＝0.022；TNF-α：r＝-0.437，P＝0.016)；LPS刺激NR8383细胞后不同时间点细胞中miR-30e的表达与IL-1β及TNF-α水平亦均呈负相关(IL-1β：r＝-0.713，P＝0.003；TNF-α：r＝-0.712，P＝0.002)。

3　讨论

脓毒症是各种微生物及免疫原性物质引起的机体免疫应答性反应。在发生严重脓毒症时，可序贯出现多个器官的功能损伤，形成多器官障碍，其中肺脏首当其冲，最终发展成为ALI甚至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。目前脓毒症-ALI和ARDS病死率已达25%～40%^[8]，成为重症监护室患者死亡的首要原因之一，因此，探索脓毒症-ALI的生物学标志，对疾病的早期诊断、治疗效果判断、预后评估具有重要的现实意义。

miRNA是一类可以在转录后调控基因表达的长21～25个核苷酸的小分子RNA。已有大量研究表明miRNA参与到脓毒症免疫炎症的发生发展，并有望成为辅助诊断脓毒症和判断预后的潜在生物标记物^[4,5,6,9]。而目前国内外对miRNA在ALI/ARDS发生发展中所起作用的研究不多，陈丽等^[10]发现miR-146a与miR-29a在新生大鼠ALI发生时可出现差异表达。王斌等^[11]用生物芯片的方法分析ALI/ARDS小鼠肺组织，发现有48个miRNAs明显差异表达，而这些差异表达miRNAs的靶基因可能参与调控炎症相关的信号通路。miR-30e(又叫miR-30e-5p)，参与脂肪细胞分化^[12]、细胞衰老^[13]、乳腺癌细胞的凋亡和再生^[14]、肿瘤细胞自噬^[15]、缺血性心肌损伤^[16]、上皮细胞间质转化^[17]等一系列生命活动，与免疫炎症和脓毒症的相关研究虽报道较少，但该家族与炎症的关系却不可忽视，Wu等^[18]发现用LPS刺激人足细胞可显著下调miR-30家族。另外miR-30家族靶蛋白Notch1^[18]可增强LPS诱导激活的NF-κB信号通路活性，进一步增强巨噬细胞的炎性反应。而miR-30e靶向的另一个蛋白UCP2^[19]，能通过下调ROS水平，减轻炎性反应^[20]。本研究复制脓毒症诱导大鼠ALI模型，光镜下观察脓毒症各组大鼠肺组织呈ALI改变，且随着时间的延长损伤程度逐渐加重。IL-1β、TNF-α是快速反应炎性因子，在炎症发生4～6 h即可达到高峰，是启动"瀑布样"炎性反应最上游的细胞因子，在一定程度上可反映病情的程度和预后。本研究中，各脓毒症组IL-1β、TNF-α水平较正常对照组均明显上升，在3 h达到高峰后开始下降。miR-30e表达量较正常对照组显著降低，在24 h达到最低，分析得出二者呈明显负相关。提示miR-30e与脓毒症诱导ALI的发生发展具有紧密相关性，而这种相关性很可能与调控炎性反应的进展有关。

肺泡巨噬细胞是一种在肺损伤时被激活并参与到防御和免疫的细胞，在脓毒症肺损伤发生时发挥重要作用。该细胞在受到LPS刺激时可通过细胞表面Toll样受体4活化核转录因子-κB启动细胞炎性反应，从而诱导多种促炎因子如IL-1β、TNF-α等的大量释放。本研究采用LPS成功诱导了大鼠肺泡巨噬细胞的炎性反应，实验观察到刺激组IL-1β、TNF-α显著升高，在3 h即达到高峰，随后呈下降趋势，与Ren等^[21]的研究结果相符。刺激组miR-30e的表达较空白对照组明显下降，且与IL-1β、TNF-α的表达呈负相关，与动物实验结果一致，充分说明miR-30e在脓毒症诱导ALI的发生发展中发挥着重要作用，而这种作用很可能是通过调控炎性反应实现的。

综上，在脓毒症诱导ALI发生时，miR-30e的表达量显著下调，并与炎性因子水平呈负相关，进一步推测miR-30e可能负向调控炎性反应，抑制脓毒症发生时炎症的进展，有望成为脓毒症ALI和ARDS诊断和治疗新的作用靶点。本研究的不足之处在于未深入做具体机制的研究。由于miR-30e在炎症领域的研究尚处于初始阶段，下一步计划探讨miR-30e负向调控炎性反应的靶基因及靶基因参与炎性反应的机制，为防治脓毒症所致的ALI和ARDS提供更有力的实验依据。

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贡献者信息

刘翠

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

刘舒

511442　广州，广东省妇幼保健院产前诊断和遗传病诊疗中心

黄锦达

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

陈亦婷

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

吕娟娟

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

郑贵浪

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

曾其毅

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

通信作者

曾其毅

510282　广州，南方医科大学珠江医院儿科

Email：zqy_88@163.com

关键词

微小RNA-30e; 脓毒症; 肺损伤，急性; NR8383; 炎性因子;

基金项目

国家自然科学基金（81272070）

广东省科技计划项目（2014A020212725）

历史

出版日期：2016-03-20

收稿日期：2015-11-03

本文编辑

申玉美

Critical Care Medicine

Expression of microRNA-30e in sepsis-induced acute lung injury rats and its correlation with the levels of inflammatory cytokines

Cui Liu, Shu Liu, Jinda Huang, Yiting Chen, Juanjuan Lyu, Guilang Zheng, Qiyi Zeng

Published 2016-03-20

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2016, 31(6): 417-420. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2016.06.005

Abstract

Objective

To investigate the differential expression of microRNA-30e in sepsis-induced acute lung injury(ALI)and its correlation with interleukin(IL)-1β and tumor necrosis factor(TNF)-α from two aspects of in vivo and in vitro.

Methods

Thirty SD male rats were randomly divided into 5 groups: normal control group, 3-hour sepsis group, 6-hour sepsis group, 12-hour sepsis group and 24-hour sepsis group in equal number.Sepsis-induced ALI model was induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(LPS, 10 mg/kg). The rat alveolar macrophages NR8383 were divided into blank control group and LPS(1 mg/L) stimulated 3, 6, 12, 24 hour groups.Inverse transcription-polymerase chain reaction was used to assay the production changes of IL-1β, TNF-α and miRNA-30e in lungs and cells.The injury of lung tissue was evaluated through histopathology.

Results

The levels of IL-1β and TNF-α in lung tissues of rats in sepsis groups were obviously up-regulated when compared with those in normal control groups(all P<0.01). The lung tissue hematoxylin-eosin staining indicated ALI in the sepsis group.The relative expression of miR-30e in rat lung tissue in sepsis 3, 6, 12, 24 hour groups were respectively 0.26±0.02, 0.41±0.08, 0.29±0.05 and 0.18±0.05, which were significantly lower than those in normal control group(1.23±0.24, all P<0.01). The levels of IL-1β and TNF-α in LPS stimulated NR8383 cells at different time points were obviously up-regulated when compared with those in blank control groups(all P<0.01). The relative expression of miR-30e in LPS stimulated 3, 6, 12, 24 hour groups were respectively 0.27±0.04, 0.55±0.05, 0.65±0.02 and 0.41±0.10, which were significantly lower than those in blank control group(1.17±0.21, all P<0.01). The expression of miR-30e in lung tissues of groups showed significantly negative correlations with those of IL-1β and TNF-α (IL-1β: r=-0.417, P=0.022; TNF-α: r=-0.437, P=0.016). The expression of miR-30e in LPS stimulated NR8383 cells of groups also showed significantly negative correlations with those of IL-1β and TNF-α (IL-1β : r=-0.713, P=0.003; TNF-α: r=-0.712, P=0.002).

Conclusions

The expression level of miR-30e was significantly down-regulated in sepsis-induced ALI, and had a significantly negative correlation with IL-1β and TNF-α, which may be used as a new biomarker of diagnostic, prognosis evaluation and therapy of sepsis-induced ALI.

Key words:

MicroRNA-30e; Sepsis; Lung injury, acute; NR8383; Inflammatory cytokines

Contributor Information

Cui Liu