探讨神经源性尿路功能障碍(NUTD)早期输尿管平滑肌细胞(USMC)内Ca2＋的变化及意义。
选取45只SD大鼠按随机数字表法均分为NUTD组、实验对照组(EC组)和空白对照组(BC组)。其中NUTD组离断第1腰椎并破坏骶段脊髓；EC组仅咬除棘突，未破坏脊髓；BC组未争手术处理。术后1周行影像尿动力学检查，观察3组大鼠逼尿肌功能及膀胱输尿管返流发生情况。模型建立后6周，3组大鼠均行影像尿动力学检查，采用急性酶法获得USMC。应用激光共聚焦显微镜观察并比较3组细胞内Ca2＋浓度差异，并分别用10–8 mol/L、10–7 mol/L、10–6 mol/L的Bay K8644处理NUTD组细胞，比较其对细胞内Ca2＋浓度的影响。
模型建立6周后，NUTD组大鼠均表现为膀胱逼尿肌无收缩，无逼尿肌过度活动和膀胱输尿管返流。所得细胞免疫荧光证实为USMC。NUTD组USMC内Ca2＋荧光强度(FI)(9.80±1.11)显著低于EC组(32.06±3.67)和BC组(31.44±2.82)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；10–8 mol/L、10–7 mol/L、10–6 mol/L的Bay K8644处理NUTD组细胞的FI相对增加值分别是3.80±1.30、10.04±2.15、19.89±2.06，差异有统计学意义(P<0.05)。
USMC内Ca2＋浓度降低可能是神经源性输尿管原发性功能障碍的重要因素之一，钙通道激动剂可对功能受损的USMC内异常Ca2＋浓度发挥有效调节作用。
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神经源性尿路功能障碍(NUTD)是指与排尿有关的中枢或神经受到损伤出现的尿路功能障碍[1]。前期研究发现NUTD在病变早期即发生原发性输尿管功能障碍，其与输尿管平滑肌细胞(USMC)L型电压依赖性钙通道表达降低、钙激活钾通道的表达增高以及其超微结构改变有关[2,3,4]，Ca2＋相关离子通道的改变必然导致细胞内Ca2＋浓度异常。研究表明，Ca2＋能够调节USMC的兴奋性，在保证输尿管的正常蠕动、维持恒定的压力梯度和抗反流机制中起关键作用[5]。本研究通过观察NUTD大鼠USMC内Ca2＋浓度变化及Ca2＋通道调节剂的作用，从离子水平揭示输尿管原发功能障碍的发生机制，为有效预防其发生反流性上尿路损害和阻断其进展提供一种新的治疗途径。
DMEM–F12培养基(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(BI公司，以色列)；Hanks、HBSS、PBS缓冲液(北京Solarbio公司)；2.5 g/L胰蛋白酶、1 g/L Ⅰ型胶原酶(北京Solarbio公司)；钙离子荧光探针Fluo–4/AM(日本同仁化学研究所产品)；抗平滑肌肌动蛋白抗体、Cy3标记羊抗兔荧光二抗[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Bay K8644(Sigma公司，美国);培养箱、超净工作台(Thermo Scientific公司，美国)；细胞培养板、培养瓶及共聚焦培养皿(上海NEST公司)；激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，LSM700，德国，郑州大学第一附属医院生殖中心提供)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；光学倒置显微镜(Leica公司，德国)；MMS尿动力检查仪、移动式C臂X线机(型号BV Endura)。
45只SD雌性大鼠(SPF级)，体质量(250±20) g，6周龄左右，健康状况良好。编号后按随机数字表均匀分为NUTD组、实验对照组(EC组)、空白对照组(BC组)，由郑州大学实验动物中心提供。
NUTD组模型：破坏大鼠腰1椎体，并离断对应节段脊髓，捣毁骶段脊髓。EC组：仅咬除腰1棘突。BC组：不进行任何手术处理。术后1周对各组大鼠进行影像尿动力学检查，NUTD组均存在逼尿肌无收缩，无膀胱输尿管反流，为动物模型建立标准，EC组、BC组无明显膀胱尿道功能障碍。
模型建立后6周，3组大鼠进行影像尿动力学检查。记录充盈期膀胱形态及最大膀胱测压容量(MCC)、膀胱顺应性(BC)和逼尿肌漏尿点压(DLPP)。监测是否存在逼尿肌过度活动和逼尿肌无收缩。
100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 mg)麻醉大鼠，无菌条件下快速游离输尿管，置于预冷的PBS液中，清除输尿管周围组织并冲洗，将标本剪成糊状，加入2.5 g/L胰蛋白酶和1 g/L Ⅰ型胶原酶，置37 ℃水浴中消化，当消化液混浊、组织块呈絮状时提示消化良好，加入含10%胎牛血清的达尔伯克必需基本培养基终止消化。反复吹打至细胞悬液，然后用细胞筛过滤。将过滤后的细胞悬液离心(1 000 r/min，离心半径13 cm)5 min，弃上清加入培养基，调整细胞密度为(5～6)×108/L后接种于培养瓶中，置于培养箱，隔日换液。整个过程注意无菌操作。
根据USMC与成纤维细胞贴壁时间的差异纯化细胞并进行免疫荧光检测α–肌动蛋白(α–actin)[6]。
当细胞融合>80%时进行传代。调整细胞密度至108/L～109/L接种于共聚焦培养皿中。
在细胞传代至共聚焦培养皿中第3天，HBSS溶液洗涤细胞后加入Fluo–4/AM与F–127混合工作液(10 μmol/L Fluo–4/AM，0.1 μmol/L F–127)200 μL至于培养箱中30 min。
将负载后的各组细胞在LSCM下扫描，激发波长488 nm，发射波长525 nm，每4 s扫描一帧，连续扫描2 min。实验结果以单细胞荧光强度(FI)及幅度的变化分别表示胞内Ca2＋的浓度及其变化。然后NUTD组再随机分成3组，分别加入10–8 mol/L、10–7 mol/L、10–6 mol/L的Bay K8644，比较不同浓度L–型钙通道激动剂作用差异。所得图像应用LSCM分析软件转化为实验数据，取平均值。
所得数据采用SPSS 17.0软件进行处理，检验各组变量正态分布情况，计量资料用
±s表示，整体比较采用ANOVA分析，组间比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
建模6周后行影像尿动力学检查发现NUTD组大鼠均表现为逼尿肌无收缩，无逼尿肌过度活动及输尿管返流发生(图1)，其MCC和BC显著高于EC组和BC组，而DLPP显著低于另外2组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
BC组、EC组及NUTD组大鼠尿动力学参数(
±s)
The urodynamics parameters of the rats in BC group，EC group and NUTD group(
±s)
BC组、EC组及NUTD组大鼠尿动力学参数(±s)
The urodynamics parameters of the rats in BC group，EC group and NUTD group(±s)
| 组别 | 只数 | MCC(mL) | DLPP(cmH2O) | BC(mL/cmH2O) |
|---|---|---|---|---|
| BC组 | 15 | 1.06±0.24 | 33.13±3.93 | 0.03±0.01 |
| EC组 | 15 | 1.00±0.19 | 33.80±3.75 | 0.03±0.01 |
| NUTD组 | 15 | 3.71±1.41ab | 19.00±4.15ab | 0.20±0.08ab |
注：BC组：空白对照组；EC组：实验对照组；NUTD组：神经源性尿路功能障碍组；MCC：最大膀胱测压容量；DLPP：逼尿肌漏尿点压；BC：膀胱顺应性；a NUTD组与EC组比较，P<0.05；b NUTD组与BC组比较，P<0.05；1 cmH2O＝0.098 kPa BC group：blank control group；EC group：expe–rimental control group；NUTD group：neuropathic urinary tract dysfunction group；MCC：maximum cystometric capacity；DLPP：detrusor leak point pressure；BC：bladder compliance；a NUTD group compared with EC group，P<0.05; b NUTD group compared with BC group，P<0.05；1 cmH2O＝0.098 kPa
注：A：空白对照组；B：实验对照组；C：神经源性尿路功能障碍组 A：blank control group；B：experimental control group；C：neuropathic urinary tract dysfunction group
提取细胞培养24 h后贴壁生长，大部分细胞为长梭形，纯化后细胞形态较一致，继续生长可见"峰和谷"样结构(图2)。免疫荧光检测α–actin阳性(图3)，证实为USMC。
NUTD组胞内Ca2＋荧光强度为9.80±1.11，较其他2组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，BC组和EC组分别为31.44±2.82、32.06±3.67，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4、图5。10–8 mol/L、10–7 mol/L、10–6 mol/L的Bay K8644均能够升高胞内Ca2＋浓度，其平均荧光强度相对增加值分别为3.80±1.30、10.04±2.15、19.89±2.06，差异具有统计学意义(P<0.05)，具有明显的浓度依赖性(图6)。
注：A：空白对照组；B：实验对照组；C：神经源性尿路功能障碍组 A：blank control group；B：experimental control group；C：neuropathic urinary tract dysfunction group
注：BC组：空白对照组；EC组：实验对照组；NUTD组：神经源性尿路功能障碍组；与NUTD组相比，aP<0.05，bP<0.05 BC group：blank control group; EC group：experimental control group；NUTD group：neuropathic urinary tract dysfunction group；compared with NUTD group，aP<0.05，bP<0.05
国内外对泌尿系统平滑肌的研究主要集中在膀胱逼尿肌细胞[7,8,9,10]，对USMC的研究较少。与传统平滑肌游离肌条或器官水平的研究相比，培养细胞不仅成分纯净，避免肌条中其他成分对细胞生理及药理特性的影响，而且便于进行细胞内机制研究。本研究用急性酶分离法获得USMC，在分子水平探究NUTD大鼠USMC内Ca2＋变化及相关调节剂的作用，为输尿管平滑肌原发性功能学变化提供分子学依据。目前，激光共聚焦图像系统结合新一代荧光染料的技术，已广泛应用于研究活细胞内Ca2＋的动态变化[11]。
研究发现NUTD组早期输尿管蠕动次数显著低于EC组和BC组，而且NUTD组输尿管平滑肌组织中L型电压依赖性钙通道表达水平降低和钙激活钾通道表达水平增高，证实其收缩功能的减弱与神经系统损伤引起Ca2＋相关通道的表达异常有关[2,3]。然而，USMC内的Ca2＋浓度变化与胞膜钙通道变化是否一致还未得到证实。本研究运用LSCM测定USMC内Ca2＋浓度，发现NUTD组明显低于正常水平。这不仅是对前期研究的验证和完善，而且与杨冬梅等[12]发现血管平滑肌细胞L型电压依赖性钙通道表达上调时胞内Ca2＋水平升高的研究相一致。此外，Hristov等[13,14]发现不稳定性膀胱与大电导钙激活钾通道的表达降低有关，而调节剂使其表达上调后，逼尿肌细胞内Ca2＋浓度降低，兴奋性和收缩性显著降低。可见，NUTD中USMC L型电压依赖性钙通道表达降低、钙激活钾通道表达升高导致胞内Ca2＋浓度降低是其收缩功能受损的重要因素之一。细胞内除Ca2＋之外，其他离子如K＋等对细胞的膜电位及兴奋性也发挥重要作用[15,16]，而其在USMC的作用机制将是后续研究的方向。
细胞外Ca2＋内流主要通过电压依赖性钙通道，其构成了动作电位去极化的主要部分，Balkanci等[17]也证实L型电压依赖性钙通道在平滑肌细胞的兴奋和收缩功能中起决定作用。为此，本研究选择L–型钙离子通道激动剂Bay K8644对NUTD组细胞进行干预。当NUTD组中加入不同浓度Bay K8644后细胞内Ca2＋浓度均升高，且具有明显的浓度依赖性。赵清和赵克森[18]研究发现Bay K8644可促进细胞外Ca2＋内流导致血管平滑肌细胞的去极化，从而协调血管平滑肌的收缩。作为L–型钙通道激动剂Bay K8644不仅增加钙通道开放概率，而且能延长其开放时间，可以迅速有效升高胞内Ca2＋的浓度。特异性钙通道激动剂对胞内Ca2＋浓度的有效调节，对于恢复受损USMC功能具有重要意义。
结构和功能正常的离子通道是细胞电活动的分子基础。许多药物正是将细胞的离子通道作为作用靶点发挥作用的。如钙通道阻滞剂在治疗心血管系统疾病中已深入研究并广泛应用[19]。而钙通道调节剂在泌尿系统疾病中应用较少，临床中对NUTD发生的返流性上尿路损害一直缺乏有效的治疗手段，结合本研究推测通过应用特异性钙通道性激动剂升高细胞内Ca2＋浓度，从而达到恢复早期受损平滑肌细胞收缩能力的目标。然而能否切实有效地维持输尿管平滑肌功能、达到保护上尿路的目的，尚需进一步的动物实验及临床研究。
