了解成都地区5岁以下腹泻患儿A组轮状病毒感染的分子流行病学特征，为四川地区A组轮状病毒的防控及疫苗研制提供科学依据。
采集成都市妇女儿童中心医院2008年1月至2015年6月5岁以下急性腹泻住院患儿粪便标本，送四川省疾病预防与控制中心微生物检验所检测，记录临床资料。提取粪便标本病毒核酸，利用ELISA法检测A组轮状病毒抗原，反转录(RT)－PCR进行基因分型。
检测粪便标本共计2 122份，检出病毒标本1 210份(男843例，女367例)，A组轮状病毒总体检出率为26.3%(558/1 210例)，2009年后占病毒性腹泻比例较前有所降低。7～12月龄为主要感染人群，11－12月份为流行季节。成都地区儿童G分型总体分布以G1型所占最高，其次为G9型与G3型：G1型在2010年出现流行高峰；G3型的流行位于中等强度；G2型于2012年出现小高峰；G9型在2011年之后呈陡然上升趋势，成为2012年至2015年的优势G分型。P分型总体以P[8]型所占比例最高，其次为P[4]型：P[4]型的流行处于中等强度，2011年至2012年较前稍有增高；P[10]型仅在2009年出现一过性流行高峰。G/P组合总体以G9P[8]最多见，其次是G1P[8]、G3P[8]和G2P[4]。G3P[8]在2008年为优势株，但之后降低，在2012年至2013年较前增加；同时G1P[8]在2009年后逐渐增加，为2009年至2011年优势株，但2012年及以后其优势地位逐渐被G9P[8]取代。轮状病毒感染患儿较易合并呼吸道症状和肝功能、心肌损害。
成都地区A组轮状病毒仍为5岁以下腹泻患儿主要病原，但近年较前下降。G9型于2012年后明显增多，P分型总体仍以P[8]型所占比例最高，2012年后以G9P[8]为优势株。
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轮状病毒(RV)是引起婴幼儿腹泻最主要的病毒[1]，全世界每年因RV感染导致约1.25亿婴幼儿腹泻和90万婴幼儿死亡，目前无特效治疗药物，服用RV疫苗是预防的重要手段[2,3]。但由于RV抗原成分复杂、型别繁多，且存在明显地区差异性，给疫苗的研制带来巨大挑战。因此，建立广泛的RV监测网，动态监测RV流行株的变化，可为疫苗的研制提供分子流行病学依据。现将2008年至2015年成都地区5岁以下RV感染分子流行病学特征进行报道，为四川地区RV的防控提供科学依据。
采集成都市妇女儿童中心医院2008年1月至2015年6月5岁以下腹泻患儿粪便标本，置－20 ℃冰箱保存，送四川省疾病预防与控制中心微生物检验所检测，同时记录患儿临床资料。所有标本及资料的收集均征得患儿家长知情同意，并签署知情同意书，并得到医院医学伦理委员会批准。
RV抗原检测：用ELISA法检测RV抗原(Premier Rotaclone)。RV抗原阳性的采用反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)检测毒株的血清型和基因型。所用引物见表1。分型过程中使用的反转录酶和Taq酶购自上海Promega公司，引物由美国疾病预防控制中心肠道病毒部门提供。
轮状病毒分型的反转录－PCR引物序列
Primer sequences of reverse transcription－PCR in rotavi－rus typing
轮状病毒分型的反转录－PCR引物序列
Primer sequences of reverse transcription－PCR in rotavi－rus typing
| 引物 | 分型用途 | 位置 | 序列(5′－3′) | 产物大小(bp) |
|---|---|---|---|---|
| 9Con1 | G(＋) | 37－56 | TAGCTCCTTTTAATGTATGG | |
| 9Con2 | G(－) | 922－941 | GTATAAAAATACTTGCCACCA | 905 |
| 9T1 | G1(－) | 176－195 | TCTTGTCAAAGCAAATAATG | 159 |
| 9T2 | G2(－) | 262－281 | GTTAGAAATGATTGTCCACT | 245 |
| 4Con2 | P(－) | 868－887 | ATTTCGGACCATTTATAACC | |
| 4Con3 | P(＋) | 11－32 | TGGCTTCGCCATTTTATAGACA | 877 |
| 1T1 | P[8](－) | 339－356 | TCTACTTGGATAACGTGC | 346 |
| 2T1 | P[4](－) | 474－494 | CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC | 484 |
采用SPSS 22.0软件进行数据处理。分类资料采用χ2检验或Fisher′s确切概率法进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。
检测粪便标本共计2 122份，检出病毒标本1 210份，RV总体检出率为26.3%(558/1 210例)，每年检出率见表2。RV在2009年后占病毒性腹泻比例呈下降趋势，且占病毒性腹泻构成比有所下降。
成都地区2008年至2015年5岁以下儿童腹泻RV检出情况
Detection rate of RV in children under 5 years old in Chengdu from 2008 to 2015
成都地区2008年至2015年5岁以下儿童腹泻RV检出情况
Detection rate of RV in children under 5 years old in Chengdu from 2008 to 2015
| 年份 | 总受检人数(例) | 病毒阳性例数(例) | RV阳性例数(例) | RV检出率(%) | RV构成比(%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 2008 | 144 | 71 | 43 | 29.9 | 60.6 |
| 2009 | 175 | 106 | 65 | 37.1 | 61.3 |
| 2010 | 407 | 280 | 127 | 31.2 | 45.4 |
| 2011 | 228 | 162 | 52 | 22.8 | 32.1 |
| 2012 | 328 | 178 | 73 | 22.3 | 41.0 |
| 2013 | 463 | 247 | 121 | 26.1 | 49.0 |
| 2014 | 273 | 145 | 56 | 20.5 | 38.6 |
| 2015(1－6月) | 104 | 42 | 21 | 20.2 | 50.0 |
| 合计 | 2 122 | 1 210 | 558 | 26.3 | 46.1 |
注：RV：轮状病毒
RV：rotavirus
成都地区儿童G分型总体分布以G1型所占最高，其次为G9型与G3型，并且检出多种混合型。G9型在2011年之后呈陡然上升趋势，成为2012至2015年的流行血清型，明显高于其他分型(图1)。
G types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
G types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
成都地区儿童P分型总体以P[8]型所占比例最高，其次为P[4]型，检出2种混合感染。P[8]型为本地区主要RV主要基因型，除2009年外均处于高水平(图2)。
P types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
P types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
总体以G9P[8]最多见，其次为G1P[8]、G3P[8]和G2P[4]。同时检出少见混合感染类型。G9P[8]在2011年后逐年增加，为2012年至2014年优势株，明显高于其他组合；G3P[8]在2008年为优势株，但之后降低，在2012年至2013年较前增加；同时G1P[8]在2009年后逐渐增加，为2009年至2011年优势株，但2012年及以后其优势地位逐渐被G9P[8]取代(图3)。
G/P types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
G/P types of rotavirus in Chengdu from 2008 to 2015
患儿年龄1～48月龄，7～12月龄为主要感染人群。男843例，女367例。
11－12月份为流行季节，到次年1月之后感染率明显降低。
绝大多数患儿为急性病程(91.2%，1 103/1 210例)，无慢性病程患儿。脱水程度以轻度脱水为主，伴消化道外表现，如呼吸道症状、肝损害及心肌损害较非RV感染患儿多见，见表3，但在随访中均能恢复正常。
轮状病毒感染患儿临床表现[例(%)]
Clinical manifestations of children with rotavirus infection[n(%)]
轮状病毒感染患儿临床表现[例(%)]
Clinical manifestations of children with rotavirus infection[n(%)]
| 症状 | 轮状病毒(＋)(1 210例) | 轮状病毒(－)(912例) | χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 水样腹泻 | 1 049(86.7) | 149(16.3) | 14.17 | <0.01 |
| 黏液性腹泻 | 96(7.9) | 481(52.7) | 9.65 | <0.01 |
| 血性腹泻 | 31(2.6) | 99(10.9) | 3.16 | <0.01 |
| 呕吐 | 898(74.2) | 91(10.0) | 13.77 | <0.01 |
| 发热 | 296(24.5) | 161(17.6) | 1.54 | >0.05 |
| 精神萎靡 | 415(34.3) | 252(27.6) | 1.23 | >0.05 |
| 脱水征 | 409(33.8) | 35(3.8) | 8.69 | <0.01 |
| 呼吸道症状 | 1 002(82.8) | 137(15.0) | 13.89 | <0.01 |
| 肝损害 | 264(21.8) | 31(3.4) | 6.21 | <0.01 |
| 心肌损害 | 624(51.6) | 80(8.8) | 10.11 | <0.01 |
A组RV是2岁以下婴幼儿严重腹泻病的最主要病原，是婴幼儿致死性腹泻的首要病原。1998年至1999年全国8个城市多中心流行病学研究报道RV在急性腹泻患儿的总体检出率为39.6%，其中成都地区检出率为27.3%[4]。本研究结果显示，2008年1月至2015年6月成都地区5岁以下急性腹泻患儿大便标本RV的总体检出率为26.3%，与1998年至1999年的报道数据相差不大，连续6.5年的监测数据提示，2009年以后成都地区RV感染较前降低，这可能跟RV疫苗的普及有关[1]，但还需要相关流行病学数据加以证明。与2000年以后的全国其他地区流行病学研究报道数据相比，位于全国中等水平，低于重庆与云南所报道的检出率[5,6]。
RV疫苗的开发和使用是防控其感染的重要手段，RV分型是疫苗研制的基础，但不同地区、不同年份流行RV的G 、P型别及其组合型别可发生变化，具有复杂而多变的分子流行病学特征[7]。因此，了解成都地区RV分型是制定地区性5岁以下患儿腹泻防治策略的流行病学依据，地区性的RV的分子流行病学长期监测具有必要性及重要意义。RV基因编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白，其中结构蛋白VP4和VP7为特异性抗原决定簇，可诱导产生机体产生保护性中和抗体。根据VP7抗原区分G血清型，按VP4抗原性可分为不同的P血清型。
我国目前仍以G1和G3血清型常见，G3为大部分地区的优势流行株[8,9,10,11,12]，少部分地区以G1为主，G4少见，但G4可造成产科病房新生儿腹泻暴发[4]。本研究结果显示，G1、G9是成都地区常见G分型，但G1在2009年至2011年为占优势，2012年以后G9型逐年明显增高，于2014年至2015年达高峰。自1983年美国首次报道G9型RV感染人之后，我国于1994年报道首例G9型RV腹泻患儿[13]，但1998年前G9型比例为0.1%，1998年至2004年G9所占比例增长至3.6%，且1998年至2000年为G9P[8]，2001年至2004年为G9P[6,14]。并且G9逐渐成为部分地区的优势流行株[9,15,16] 。本研究数据也提示了G9在成都地区流行的趋势，已成为目前成都地区的优势G分型。相比G分型，P分型相对稳定，目前P[8]仍为最流行的P分型。本研究结果也提示，成都地区以P[8]为主要流行株，其次为P[4]、P[6]，但未发现P[9]。P[10]在2009年有一过性流行，但2011年之后P[8]明显增高。成都地区常见的G、P组合有G9P[8]、G1P[8]、G3P[8]和G2P[4]，同时检出部分少见混合株。2014年至2015年6月G9P[8]为成都地区优势株，明显高于其他类型。但本研究主要以住院患儿为研究对象，未进行大范围的以人群为对象的流行病学调查，故RV型别的流行趋势有一定的局限性，无法获取轻微或无症状携带者的分型。
成都地区RV的临床流行病学特征与其他地区报道一致。<6月龄及> 24月龄检出率均较低，提示母体抗体对RV感染的可能存在保护作用，因此，RV疫苗的适用对象应为6个月～2岁婴幼儿，特别是6～12月龄婴儿。同时，RV所致消化道症状和肝功能、心肌损害较非RV感染重，故对RV患儿除对症补液外，应加强脏器功能的保护[17]。综上，通过长期的、连续性的分子流行病学研究，明确了成都地区作为西部重要城市，在2008年至2015年A组RV腹泻的病原分型特点与流行趋势，为临床诊治及该地区RV预防工作的开展提供了数据支持。
