观察水通道蛋白1(AQP1)在肾上腺素肺水肿(PE)大鼠肺组织表达的变化，以及甲泼尼龙(MP)对其影响。
将50只1月龄Wister大鼠随机分为对照组、PE组、MP 10 mg/kg治疗组(MP A组)、MP 20 mg/kg治疗组(MP B组)、MP 30 mg/kg治疗组(MP C组)，每组10只。对照组腹腔注射9 g/L盐水，PE组大鼠按2.7 mg/kg给予腹腔注射肾上腺素注射液(11 000), MP各组于腹腔注射肾上腺素注射液后立即腹腔注射MP。苏木精染色观察肺组织形态学改变。测量肺湿/干质量比值(W/D)。免疫组织化学染色分析AQP1的表达和分布，实时定量－聚合酶链反应(RT－PCR)检测AQP1 mRNA的表达，Western blot测定AQP1蛋白表达水平。
1.PE组大鼠肺部出现水泡音，呼吸节律明显增快，烦躁不安；病理见双肺体积增大，有出血，气管腔内液体较多，呈粉红色泡沫状。2.大鼠肺组织W/D：PE组(6.50±0.53)与对照组(4.59±0.36)比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.病理评分：PE组(3.80±0.42)与MP A组(3.30±0.48)、MP B组(2.30±0.68)和MP C组(1.20±0.42)比较，PE组显著增高，差异有统计学意义(均P<0.05)。4.肺组织AQP1免疫组织化学测定：PE组(1.20±0.79)与对照组(4.20±1.03)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，PE组与MP A组(5.60±1.58)、MP B组(7.00±1.33)、MP C组(9.20±1.55)比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。5.AQP1 mRNA表达：PE组AQP1 mRNA表达(0.12±0.43)与对照组(0.90±0.32)比较明显降低，PE组与MP A组(0.17±0.06)、MP B组(0.39±0.13)、MP C组(0.61±0.21)比较，MP各组显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。6.AQP1蛋白表达：PE组(0.20±0.04)较对照组(0.60±0.15)显著降低，PE组比MP各组[A组(0.32±0.04)，B组(0.37±0.09)，C组(0.44±0.07)]显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
AQP1在肾上腺素PE大鼠肺组织表达降低；MP能显著提高AQP1表达，并可明显改善肾上腺素PE大鼠肺部渗出、出血。
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急性肺水肿(PE)是临床常见的危重症之一，按照病因可将PE分为心源性和非心源性2大类，肾上腺素引起的PE是一种非心源性PE。肾上腺素可能来自体外，如由于手术麻醉而注射的肾上腺素进入血液[1]，心肺复苏使用大剂量肾上腺素[2]；也可能来自于体内，如嗜铬细胞瘤，或因感染肠道病毒71型(EV71)导致脑干脑炎，进而引起神经源性PE[3]。有些EV71手足口病患儿合并脑干脑炎后常引起交感神经中枢过度兴奋，导致高肾上腺素血症，继发PE、肺出血，危及患儿生命。水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一组跨膜蛋白，是负责水分子转运的主要通道。水通道蛋白1(AQP1)是水通道蛋白家族成员之一，在肺组织高表达，在维持正常肺组织水的转运中起重要作用[4]。研究证实，不同原因导致的急性肺损伤和PE均伴随AQP1表达降低[5]，而肾上腺素导致PE时AQP1表达是否改变尚不清楚。本研究用过量肾上腺素制备大鼠PE模型，观察其肺组织AQP1表达变化，探讨甲泼尼龙(MP)对AQP1表达的影响及对PE的作用，为MP治疗肾上腺素PE提供依据。
1月龄50只健康清洁级Wister大鼠，雌雄不限，体质量(100±8) g，由河北医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(冀)2008－1－003]。本研究所使用大鼠已经河北医科大学动物保护和使用委员会批准，并完全遵照国家动物保护和使用指南要求。实验动物均在同一环境按清洁级大鼠的要求分笼饲养于动物房中，专人饲养。
抗AQP1亲和纯化兔多克隆抗体(美国Santa Cruz公司生产)；即用型免疫组织化学染色试剂盒SA1022 (武汉博士德生物有限公司)；盐酸肾上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，生产批号：1605231)，注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(比利时Pfizer Manufacturing Belgium NV，生产批号：N64331)，Olympus显微镜CH20BIMF200(日本Olympus公司)；Nikon显微镜eclipse 55i (日本Nikon公司)。
50只实验大鼠根据随机数字表随机分为对照组、PE组、MP 10 mg/kg治疗组(MP A组)、MP 20 mg/kg治疗组(MP B组)、MP 30 mg/kg治疗组(MP C组)，每组10只。用水合氯醛麻醉大鼠，仰卧在操作台上，固定四肢及头，去毛，在上腹正中切开胸腔，结扎气管，取出双肺。肉眼观察肺组织大体外貌，切取右肺中叶，以吸水纸吸净表面液体，称其湿质量，放在60 ℃烤箱中烘烤72 h至恒重，称其干质量。以40 g/L多聚甲醛固定左肺叶，4 ℃冰箱存放，常规方法石蜡切片并进行HE染色及免疫组织化学染色。取新鲜右肺，经PBS处理后置－80 ℃冰箱保存备用，保存样本进行实时定量－聚合酶链反应(RT－PCR)和Western blot测定。对照组给予相同体积的9 g/L盐水腹腔注射。PE组参照薛敬礼等[6]的方法制备肾上腺素PE大鼠模型，仅给予2.7 mg/kg肾上腺素腹腔注射(肾上腺素11 000，0.27 mL),制备单纯肾上腺素PE模型，MP A、B、C各组于腹腔注射肾上腺素注射液后立即腹腔注射MP(40 mg/瓶)，剂量分别为10、20、30 mg/kg。60 min后将实验动物镇静处死，实验过程中存活时间小于60 min予以剔除并替补。
常规石蜡切片，HE染色。病理评分标准[7]：没有损伤＝0，损伤面积≤25%＝1，损伤面积≤50%＝2，损伤面积≤75%＝3，损伤弥散＝4。
标本采用生物素复合体法免疫组织化学染色，经抗原热修复，滴加血清封闭液，再加一抗(生物素化山羊抗兔IgG)4 ℃过夜处理，加入二抗，37 ℃孵育20 min，氨基联苯胺显色液显色，苏木精轻度复染，最后经脱水、透明、封片，于高倍显微镜下观察，以中性粒细胞胞质显棕黄色颗粒为阳性细胞。在每高倍镜(×400)视野下，随机选取20个阳性细胞，用MPLAS－1000型高清晰度彩色图像分析仪(日本Nikon公司)测定光密度值(OD)，以平均光密度值作为其相对表达量。
取实验大鼠右上叶肺组织，采用TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)，按照说明书步骤提取各组肺组织细胞的总RNA，然后反转录成cDNA，取少量cDNA作为模板。将调制好的PCR反应溶液于RealtimePCR仪上进行扩增反应，反应条件类同。AQP1引物由Invitrogen公司合成，引物序列：甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH) β－actin：上游引物5′－GGCATGGACTGTGGTCATGA－3′；下游引物5′－TTCACCACCATGGAGAAGGC－3′(244 bp)，AQP1上游引物5′－GTGACAGACAAGCCAATGGATAA－3′；下游引物5′－GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT－3′(287 bp)。通过内参校正，计算AQP1 mRNA的相对表达量。
取右肺下叶肺组织500 mg冷研磨、TRIzol试剂充分裂解，9 500×g，4 ℃离心5 min，收集上清分装后置－80 ℃冰箱保存备用。取待测样本3 μL，稀释后用考马斯亮蓝法测各样品的蛋白水平。经过制胶、预电泳、恒压10～20 V，20～30 min预电泳、电泳、转膜、抗体封闭，增强化学发光法显色。将膜放入二氨基联苯胺(DAB)显色液中，显示清晰条带后，洗膜，终止反应。数码相机拍照，用Gel－pro凝胶分析软件定量分析结果，测定各条带的OD值，以光密度值代表AQP1蛋白的表达量。AQP1蛋白表达量与内参照β－actin表达量进行对比，得出AQP1蛋白的相对表达量。
应用SPSS 16.0软件进行统计学处理，数据以
±s表示，以α＝0.05为显著性水准。各组均数进行单因素方差分析(One－Way ANOVA)，各组间两两比较采用SNK－q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
单纯注射肾上腺素的PE组大鼠均发生明显呼吸频率加快、烦躁不安、双肺底可闻及湿啰音，部分大鼠逐渐呼吸变浅、变慢；加注不同剂量MP的大鼠呼吸加快不明显，主要表现为躁动，或活动减少。这些变化符合急性PE的表现，提示肾上腺素PE模型制备成功。
与对照组比较，PE组W/D显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各MP干预组与PE组相比，W/D均显著降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，MP 3组之间相比，C组W/D最低，见表1。
各组大鼠肺组织W/D、病理评分及免疫组织化学结果比较 (
±s)
Comparison of lung tissue，pathological grading and immunohistochemical results in rats among different groups (
±s)
各组大鼠肺组织W/D、病理评分及免疫组织化学结果比较 (±s)
Comparison of lung tissue，pathological grading and immunohistochemical results in rats among different groups (±s)
| 组别 | 只数 | W/D | 病理评分(分) | AQP1免疫组织化学 |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 10 | 4.59±0.36 | 4.20±1.03 | |
| PE组 | 10 | 6.50±0.53a | 3.80±0.42 | 1.20±0.79a |
| MP A组 | 10 | 6.01±0.32b | 3.30±0.48b | 5.60±1.58b |
| MP B组 | 10 | 5.40±0.37b | 2.30±0.68b | 7.00±1.33b |
| MP C组 | 10 | 5.03±0.36b | 1.20±0.42b | 9.20±1.55b |
| F值 | 37.06 | 50.61 | 54.03 | |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注：W/D：湿/干质量比值；AQP1：水通道蛋白1；PE：肺水肿；MP：甲泼尼龙；与对照组比较，aP<0.05；与PE组比较，bP<0.05 W/D：wet/dry weight；AQP1：aquaporins 1；PE：pulmonary edema；MP：Methylprednisolone；compared with control group，aP<0.05；compared with PE group，bP<0.05
对照组光镜下肺泡结构清晰，无渗出。PE组双肺明显水肿，体积显著增大，肺表面可见淤血和出血灶，气管内可见较多呈泡沫样液体，肺切面有血性液体溢出。切片下可见肺泡结构异常，肺泡内大量液体和红细胞漏出，肺泡间毛细血管弥散性充血、出血。MP各干预组较PE病理改变均明显减轻，肺泡壁增宽程度、炎性细胞浸润较轻。肺泡液体和红细胞渗出少，这些改变在MP C组最为明显，各组肺组织病理学改变见图1。病理评分：与PE组比较，MP A组、MP B组和MP C组显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；3组相比，MP C组评分最低(P<0.05)，见表1。
Histological changes of lung tissue in rats among different groups(HE staining, ×200)
注：MP：甲泼尼龙；A：对照组；B：肺水肿组；C：MP 10 mg/kg组；D：MP 20 mg/kg组；E：MP 30 mg/kg组 MP: Methylprednisolone；A：control group；B：pulmonary edema group；C：MP 10 mg/kg group；D：MP 20 mg/kg group；E：MP 30 mg/kg group
Histological changes of lung tissue in rats among different groups(HE staining, ×200)
免疫组织化学检测以细胞膜呈现黄褐色颗粒者表示AQP1的阳性表达结果，以PBS空白结果为阴性对照。对照组：AQP1主要表达于肺微血管内皮细胞及Ⅱ型肺泡上皮细胞，血管内皮表达比Ⅱ型肺泡上皮更为显著。PE组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PE组与MP A组、MP B组、MP C组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，MP各组明显升高，其中C组升高最显著，见图2、表1。
The immunohistochemical staining showing the expression of aquaporin 1 of lung tissue in rats among different groups (×400)
注：MP：甲泼尼龙；A：对照组；B：肺水肿组；C：MP 10 mg/kg组；D：MP 20 mg/kg组；E：MP 30 mg/kg组 MP：Methylprednisolone；A：control group；B：pulmonary edema group；C：MP 10 mg/kg group；D：MP 20 mg/kg group；E：MP 30 mg/kg group
The immunohistochemical staining showing the expression of aquaporin 1 of lung tissue in rats among different groups (×400)
PE组AQP1 mRNA表达(0.12±0.43)较对照组(0.90±0.32)明显降低，PE组与MP A组(0.17±0.06)、MP B组(0.39±0.13)、MP C组(0.61±0.21)比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，MP各组显著升高，AQP1的mRNA表达在287 bp处，见图3。
The proportion of expression of AQP1 mRNA in rats among different groups
注：AQP1：水通道蛋白1；MP：甲泼尼龙 AQP1：aquaporins 1；MP：Methylprednisolone
The proportion of expression of AQP1 mRNA in rats among different groups
PE组AQP1蛋白表达(0.20±0.04)较对照组(0.60±0.15)显著降低，PE组比MP各组[A组(0.32±0.04)，B组(0.37±0.09)，C组0.44±0.07)]均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，C组与其他2组比较表达最强，见图4。
The expression of AQP1 protein in rats among different groups
注：MP：甲泼尼龙；A：对照组；B：肺水肿组；C：MP 10 mg/kg组；D：MP 20 mg/kg组；E：MP 30 mg/kg组；AQP1：水通道蛋白1 MP：Methylprednisolone；A：control group；B：pulmonary edema group；C：MP 10 mg/kg group；D：MP 20 mg/kg group；E：MP 30 mg/kg group；AQP1：aquaporins 1
The expression of AQP1 protein in rats among different groups
近年来，部分由EV71感染导致的手足口病患儿伴发脑干脑炎，脑干脑炎也是手足口病最主要的死亡原因之一[8]。脑干脑炎伴有的自主神经功能紊乱是手足口病患者严重的神经系统并发症。研究发现，脑干被EV71毁坏之后去甲肾上腺素和肾上腺素如潮水般进入体循环，大量去甲肾上腺素和肾上腺素以及细胞因子风爆引起PE[9]。高剂量肾上腺素也会刺激血管和心脏α1－受体，导致血管收缩，增加心肌收缩力，加重心肌耗氧量，有学者提出在这种状态的手足口病禁忌使用肾上腺素[8]。
采用过量肾上腺素制造的PE模型的肺组织在组织病理特点和大体观察非常类似于手足口病PE的肺组织变化[10]，肺W/D也显著增加。肾上腺素制造的PE模型为研究手足口病PE的机制和治疗提供了简单易行的研究方法。
本研究证实过量肾上腺素导致的PE肺组织中AQP1表达显著下降，提示AQP1表达下降可能与PE发生、发展有关。AQPs是一组存于人体和动物组织中的对水有特异通透性的膜蛋白。目前为止，已发现6种AQPs在肺组织表达，分别是AQP1、AQP3～5、AQP8～9，在下呼吸道主要表达的是AQP1和AQP5。AQP1主要表达在肺泡毛细血管内皮细胞，在肺毛细血管上皮与肺泡上皮之间水转移中有重要作用，新的研究发现，AQP1敲除的动物肺泡－毛细血管系统之间水的转运能力显著降低，证实了AQP1在水转运的重要性[11]。但也存在不同研究结果，一些研究已发现急性肺损伤和PE大鼠肺组织中AQP1表达下降[12,13,14]，本研究结果与之一致，提示AQP1与PE或肺损伤的重要关联性，但其降低原因及对肺组织水代谢的影响有待进一步研究。关注AQP1在肺部疾病中的变化及机制也许能为治疗这些疾病找到另一途径。
糖皮质激素对AQP1的调控作用是研究的一个热点，有研究发现糖皮质激素可通过改变AQP1的表达调节各器官的水转运[15]。MP是脂溶性类固醇激素，易通过血脑屏障。在手足口病脑炎时应用MP一直被写进手足口病指南中，手足口病诊疗指南(2010年版)指出，在神经系统受累时可酌情使用大剂量MP冲击治疗，MP的早期应用还可预防和治疗脑水肿，以及阻断PE和脑水肿之间恶性循环。与其他激素相比，同等剂量MP在肺组织和肺泡上皮衬液中的水平较高，且滞留时间也较长[16]。有研究发现，MP能提高百枯草引起的肺损伤大鼠存活力[17]。
一项MP治疗急性肺损伤的研究表明，MP具有强大的抗炎作用，能改善早期肺损伤性炎性反应以及白细胞介素－6水平[18]。本研究用MP冲击治疗后，实验大鼠肺部病理改变减轻，肺W/D降低，PE明显减轻，同时免疫组织化学等检测显示MP组AQP1的表达较PE组显著增加，特别是30 mg/kg组改善更为显著。提示MP能改善PE和肺出血，可能是通过提高AQP1表达，并且可能与剂量有关。
糖皮质激素在手足口病的应用也存在争议。本研究基于单纯的肾上腺素PE模型，没有病毒感染及相应的机体反应因素，没有受其他药物等因素对AQP1表达的影响，因此，进一步研究MP对EV71脑炎的PE状态下肺组织中AQP1的影响很有必要。本研究选择MP而不是地塞米松的原因还鉴于MP在体内消除较快，基本不在体内蓄积，对下丘脑－垂体－肾上腺轴抑制时间仅为地塞米松的1/2，因而肾上腺危象和全身不良反应发生率低。
综上，本研究发现肾上腺素PE大鼠模型肺组织中AQP1的表达降低，并证明MP能提高肾上腺素PE肺组织中AQP1表达，同时减轻PE和肺出血，大剂量组作用更为明显。这些发现提示也许通过提高AQP1表达或者活性，可增强PE患者肺泡水清除率，减轻或消除PE。本研究结果可能成为治疗PE的有效途径之一，也为重症手足口病的PE和肺出血提供了新的治疗思路。
