探讨甘草甜素(GL)预处理对幼鼠癫痫模型急性期海马组织、血清中高迁移率族蛋白1(HMGB1)表达水平及慢性期海马CA1区、CA3区神经元核特异蛋白(Neu-N)表达的影响。
52只21日龄SD大鼠按随机数字表法分为对照组(12只)、模型Ⅰ组(16只)、模型Ⅱ组(24只)。模型Ⅰ组用海人酸(KA)诱导癫痫发作,模型Ⅱ组在用KA前30 min腹腔注射GL,模型Ⅰ组根据观察时间点不同分为3 h、12 h、24 h、7 d 4个亚组,模型Ⅱ组根据GL不同剂量分为10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 3个亚组,每个亚组3只。行为学表现按照Racine评分量表进行评分,实时荧光定量PCR及Western blot检测急性海马区HMGB1 mRNA及蛋白的表达,ELISA检测血清中HMGB1蛋白的表达,免疫组织化学检测慢性期(7 d)海马Neu-N的表达。
模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,癫痫发作时间明显延长[(24.08±1.98) min比(33.39±2.66) min],差异有统计学意义(t=9.231,P<0.05);模型Ⅰ组与对照组比较,随着观察时间(3 h、12 h、24 h)的延长,HMGB1的基因表达升高,在12 h时达到峰值,差异有统计学意义(H=10.532,P<0.05),HMGB1的蛋白表达改变不明显,差异无统计学意义(H=5.227,P>0.05),血清中HMGB1水平升高,其中在12 h时升高最明显,差异有统计学意义(H=6.897,P<0.05);在12 h时间点,模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,HMGB1的基因表达降低(H=10.721,P<0.05)(100 mg/kg组明显),血清中HMGB1的水平降低(H=6.967,P<0.05)(100 mg/kg组明显);在7 d时间点,模型Ⅰ组与对照组比较,海马区神经元丢失减少(P<0.05),模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,海马区神经元的丢失减少(P<0.05)(CA1区100 mg/kg组明显,CA3区50 mg/kg明显)。
在幼鼠的颞叶癫痫模型中,GL可能通过抑制HMGB1基因的合成及释放,降低胞外HMGB1水平,抑制炎性反应的发生,从而减少神经元的丢失,发挥一定的神经保护作用。
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癫痫是神经系统常见的疾病,炎性反应与难治性癫痫的发生有关,甘草类药物有较好的抗感染和细胞保护作用,但对甘草类药物的抗癫痫作用及机制研究甚少。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)的释放是触发免疫反应的危险信号,在癫痫发病中起重要作用,释放的HMGB1可被相应的模式识别受体识别,激活核转录因子-κB(NF-κB),引起炎性反应。本研究通过建立海人酸(KA)诱导的幼鼠颞叶癫痫模型,予以甘草甜素(GL)干扰,通过对模型鼠抽搐行为的观察,探讨GL对幼鼠癫痫发作的敏感性及严重程度的影响,利用Western blot与实时荧光定量PCR(qPCR)分别从mRNA及蛋白质水平检测海马组织HMGB1的表达,利用ELISA检测血清中HMGB1的变化,采用免疫组织化学观察海马区神经元的丢失情况,探讨GL可能的抗癫痫及神经元保护机制。
21日龄的清洁级雄性SD大鼠52只,体质量(55±3) g,相当于人类5岁,由河南省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(豫)2015-0004,按照随机数字表法分为对照组(12只)、模型Ⅰ组(KA诱导,16只)、模型Ⅱ组(GL预处理KA诱导,24只),对照组及模型组造模成功且存活的动物再分别照随机数字表法随机分为3 h、12 h、24 h、7 d 4个亚组(对照组为3 h、7 d),每个亚组3只。
KA(K0250,美国Santa cruz公司);GL(50531,美国Sigma公司);UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(B511321-0100,上海生工生物工程股份有限公司);RevertAid#First Strand cDNA反转录试剂盒(B300538-0100,美国Thermo scientific);Maxima SYBR Green qPCR MM,ROX试剂盒(B310251-0200,美国Thermo scientific);全蛋白提取试剂盒(C510003-0050,上海生工生物工程股份有限公司);一抗:抗HMGB1多克隆抗体(ab191583,美国abcam公司);二抗:山羊抗小鼠IgG(D110087,美国BBI公司);ELISA试剂盒(AMEKO公司,上海岚派生物科技有限公司);兔抗人神经元核特异蛋白(Neu-N)抗体(美国Abcam公司)。
模型Ⅱ组提前30 min腹腔注射不同剂量的GL(10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg),模型Ⅰ组及对照组给予等量9 g/L盐水,模型Ⅱ组及模型Ⅰ组在分别给予GL或9 g/L盐水后30 min,腹腔注射KA 12 mg/kg诱导癫痫[1],对照组给予等量9 g/L盐水。根据Racine标准分级[2]:Ⅰ级:面肌抽动,节律性咀嚼动作;Ⅱ级:节律性点头或湿狗样抖动;Ⅲ级:一侧前肢阵挛;Ⅳ级:双侧前肢阵挛伴站立;Ⅴ级:跌倒、全身强直阵挛性。达到Ⅳ级及以上者为造模成功,持续观察2 h后给予水合氯醛(350 mg/kg)终止发作。给予KA注射后2 h内密切观察模型Ⅰ组及模型Ⅱ组大鼠的行为学表现,根据Racine行为学评分表格进行评分,达到Ⅳ级及以上者为造模成功,癫痫持续状态(SE)2 h后给予水合氯醛(350 mg/kg)终止发作,以降低病死率,未达到Ⅳ级者从实验中剔除。详细记录注射完KA达到初次Ⅲ级癫痫发作的时间(seizure onset time,SOT),用来评价大鼠癫痫发作的易感性。分别在KA注射后的3 h、12 h、24 h时间点处死动物,取海马组织及血液,制备匀浆及血清标本,在KA注射后第7天,取新鲜海马组织,多聚甲醛固定后,行石蜡包埋,制作石蜡标本,进行后续实验。
采用qPCR、Western blot检测海马内HMGB1基因mRNA和蛋白的表达,ELISA检测血清中HMGB1的表达。(1)qPCR检测:引物设计利用Primer 5.0软件进行,设计HMGB1基因上游引物序列为:5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′,下游引物序列为:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′;β-actin基因上游引物序列为:5′-TATGGCAAAGGCTGACAAGG-3′,下游引物序列为:5′-TTTCTTCGCAACATCACCAA-3′。新鲜海马组织提取后,迅速放入液氮中冻存,Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度,要求样本RNA的吸光度(A)值为1.8~2.0;配制反应体系,总反应体积为20 μL,反转录合成cDNA;再以cDNA为模板,采用SYBR法,进行荧光定量PCR,得到相应的Ct值。采用相对定量2-ΔΔCt分析法对大鼠海马组织HMGB1基因相对表达量进行分析,得相对表达倍数为N(N=2-ΔΔCt),其中ΔΔCt=(待测组的目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值)-(对照组的目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)。(2)Western blot检测:海马组织全蛋白提取后,测得蛋白的浓度,按上样量50 μg计算出上样体积,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜,牛血清封闭2~3 h,加入TBST稀释的一抗。放入4 ℃冰箱过夜。TBST洗涤洗3×10 min。加入稀释的相应的二抗封闭液(11 000),室温条件下在水平摇床上摇2 h,TBST室温洗3×10 min。显影,图片曝光保存。使用AlphaEaseFC Imaging software 4.0系统分析条带光密度,将目的蛋白条带的光密度值与内参β-actin的A值做比较,所得数值再与对照组比较,则对照组的相对A值设为1,计算各目的蛋白的相对A值。(3)ELISA检测:将血液标本放入4 ℃冰箱过夜后,1 500 r/min离心10 min(离心半径5 cm)后取上清,剩余操作根据ELISA试剂盒进行,每个样品和空白孔均加做复孔,根据标准品的浓度及对应的A值计算出HMGB1标准曲线的直线回归方程,再根据样品的A值及回归方程算出对应的样品浓度。
采用免疫组织化学检测Neu-N的表达。取制作好的石蜡切片依次脱蜡至水,经抗原修复后,滴加PBS稀释的一抗(Neu-N工作液稀释比例为1200),同时作9 g/L盐水对照,湿盒中4 ℃过夜;PBS液冲洗,滤纸吸干;切片上滴加稀释的HRP标记二抗,湿盒中37 ℃孵育;PBS冲洗切片,甩干,蒸馏水洗1次;二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精染液复染,切片的透明处理,中性树胶封片。免疫组织化学观察实验大鼠海马CA1、CA3神经元或Neu-N阳性细胞的形态及数目分布,计数各亚区Neu-N阳性的细胞数。
采用SPSS 21.0软件,若实验数据满足独立性、正态性及方差齐性,多组之间比较采用One-Way ANOVA检验,2组之间多重比较采用LSD法;若不符合,多组之间比较采用Kruskal-Wallis检验,2组之间多重比较采用Bonferroni秩和检验,数据以±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。
模型组中有10只大鼠死于严重的SE,9 g/L盐水对照组12只均未死亡或发生癫痫发作,模型Ⅰ组16只,造模成功12只,死亡4只,模型Ⅱ组24只,造模成功18只,死亡6只,模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,SOT时间明显延长[(33.39±2.66 ) min比(24.08±1.98) min],差异有统计学意义(t=9.231,P<0.05)。
模型Ⅰ组与对照组比较,随着KA注射后时间的延长,HMGB1基因的表达显著增加,在12 h时达到峰值,差异有统计学意义(均P<0.05),24 h时HMGB1 mRNA表达逐渐降至正常(P>0.05);模型Ⅰ组与对照组比较,随着KA注射后时间的延长,HMGB1蛋白的表达改变不明显,差异无统计学意义(均P>0.05);模型Ⅰ组与对照组比较,随着KA注射后时间的延长,血清中HMGB1水平在12 h时明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),3 h、24 h时差异无统计学意义(P>0.05),见图1,表1。
组别 | 只数 | 海马HMGB1N值(2-ΔΔCt) | 目的蛋白相对吸光度值 | 血清中HMGB1水平(μg/L) |
---|---|---|---|---|
对照组 | 3 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 5.24±1.73 |
模型Ⅰ组(3 h) | 3 | 1.32±0.11a | 1.10±0.16b | 5.62±0.45b |
模型Ⅰ组(12 h) | 3 | 1.69±0.15a | 1.17±0.12b | 10.33±0.74a |
模型Ⅰ组(24 h) | 3 | 1.11±0.03b | 1.08±0.07b | 6.18±0.71a |
H值 | 10.532 | 5.227 | 6.897 | |
P值 | <0.05 | >0.05 | <0.05 |
注:HMGB1:高迁移率族蛋白1;与对照组比较,aP<0.05,bP>0.05 HMGB1:high mobility group protein 1;compared with the control group,aP<0.05,bP>0.05
注:KA:海人酸;HMGB1:高迁移率族蛋白1 KA:kainic acid;HMGB1:high mobility group protein 1
KA注射后的12 h,GL预处理(模型Ⅱ组)与模型Ⅰ组比较,其中100 mg/kg组可以显著降低HMGB1基因的表达,差异有统计学意义(P=0.044),10 mg/kg、50 mg/kg组改变不明显(P=0.366,P=0.178);GL预处理对HMGB1蛋白的表达无明显影响,差异无统计学意义(P=1.000),GL预处理(10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg)可以明显降低血清中HMGB1的水平,差异有统计学意义(P<0.05),见图2、表2。
组别 | 只数 | 海马HMGB1N值(2-ΔΔCt) | 目的蛋白相对吸光度值 | 血清HMGB1水平(μg/L) |
---|---|---|---|---|
对照组 | 3 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 5.24±1.73 |
模型Ⅰ组 | 3 | 1.69±0.15 | 1.11±0.16 | 10.33±0.74 |
模型Ⅱ组(10 mg/kg) | 3 | 1.44±0.13a | 1.00±0.07a | 5.00±1.33b |
模型Ⅱ组(50 mg/kg) | 3 | 1.40±0.16a | 1.06±0.18a | 5.41±0.40b |
模型Ⅱ组(100 mg/kg) | 3 | 1.32±0.11a | 1.06±0.20a | 5.37±2.34b |
H值 | 10.721 | 0.888 | 6.967 | |
P值 | <0.05 | >0.05 | <0.05 |
注:HMGB1:高迁移率族蛋白1;与模型Ⅰ组比较,aP>0.05,bP<0.05 HMGB1:high mobility group protein 1;compared with the model group Ⅰ,aP>0.05,bP<0.05
注:GL:甘草甜素;KA:海人酸;HMGB1:高迁移率族蛋白1 GL:glycyrrhizin;KA:kainic acid;HMGB1:high mobility group protein 1
对照组CA1、CA3区神经元大小及形态正常,结构层次完整,模型组Ⅰ、Ⅱ组可见大量极性紊乱,神经元细胞丢失,模型Ⅱ组神经元丢失较模型Ⅰ组减少,见图3。模型Ⅰ、Ⅱ组与对照组比较,CA1和CA3区Neu-N阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,CA1和CA3区Neu-N阳性细胞增加,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。
组别 | 只数 | 阳性细胞数 | |
---|---|---|---|
CA1区 | CA3区 | ||
对照组 | 3 | 57.67±2.52 | 54.67±4.51 |
模型Ⅰ组 | 3 | 44.67±3.06a | 35.00±2.00a |
模型Ⅱ组(10 mg/kg) | 3 | 49.00±2.00ab | 45.67±2.08ac |
模型Ⅱ组(50 mg/kg) | 3 | 51.33±3.22ac | 46.67±6.11ac |
模型Ⅱ组(100 mg/kg) | 3 | 53.00±2.65cd | 44.00±4.36ac |
F值 | 9.383 | 8.712 | |
P值 | <0.05 | <0.05 |
注:与对照组比较,aP<0.05,dP>0.05;与模型Ⅰ组比较,bP>0.05,cP<0.05 Compared with the control group,aP<0.05,dP>0.05;compared with model group Ⅰ,bP>0.05,cP<0.05
注:A、F:对照组,神经元大小及形态正常,结构层次完整;B、G:模型Ⅰ组;C、D、E、H、I、J:模型Ⅱ组,可见大量极性紊乱,神经元细胞丢失,模型Ⅱ组神经元丢失较模型Ⅰ组减少 A,F:the control group,the size and morphology of neuron were normal,the structure and level were complete;B,G:model group Ⅰ;C,D,E,H,I,J:model group Ⅱ,showed a large number of polar disorder,neuronal cell loss,compared with the model group Ⅰ,neuronal loss was reduced in the model group Ⅱ
KA是兴奋性氨基酸-谷氨酸的类似物,尤其作用在海马区高亲和性KA受体上,可选择性引起颞叶癫痫,已被广泛用于人类颞叶癫痫的急性模型[3]。HMGB1是近年来发现的一种重要的炎性因子[4],正常情况下主要存在于细胞核中,当发生组织损伤时由死亡的细胞释放到细胞外、脑脊液及血清中[5],HMGB1的释放是触发免疫反应的危险信号,在脓毒症、关节炎等多疾病中具有重要作用。最新研究发现其与癫痫的发生也有着紧密的联系[6,7]。释放的HMGB1作为一种组织损伤信号[8],可以被Toll样受体(TLR)2、TLR4、TLR9等其识别[9,10],最终激活NF-κB引起炎性反应,NF-κB信号通路的激活又可以释放IL-1、IL-6、TNF-α、HMGB1等各种炎性因子[11],同时HMGB1作为促炎因子,在癫痫发作发展中也可通过调节IL-1、IL-6等炎性因子的释放启动、维持及放大炎性反应。有研究证明各种炎性因子的释放增加神经元的兴奋性,导致海马区神经元的丢失和海马区硬化[12]。本研究发现在KA诱导的幼年大鼠癫痫模型急性期,海马组织HMGB1的基因合成增加,总蛋白量不变,癫痫造模后12 h时血清中HMGB1的水平增高,说明HMGB1的胞外释放可能与癫痫的发生密切相关。并且慢性期(7 d),海马区病理结构破坏明显及严重的神经元丢失。因此,对HMGB1进行干预可能会减轻癫痫的发作及脑损伤[13]。
GL是甘草类的提取物,有抗感染抗病毒及细胞膜稳定作用,临床上用于肝炎、肿瘤、各种皮肤病等治疗。有研究通过磁共振及荧光的方法证明GL是HMGB1的小分子抑制剂,其通过直接结合HMGB1BoxA,抑制其释放到细胞外、脑脊液及血清中,解释了其抗感染的部分机制[14,15,16,17]。有文献报道称在缺血再灌注动物模型中GL的干预能明显减轻与HMGBl相关的损伤[18]。Luo等[19,20]研究发现在KA所致的癫痫模型中,与提前30 min注射GL的癫痫模型比较,后者可以显著抑制胶质细胞的增生,减少神经元的丢失,并可显著抑制促炎标志物的产生。但是GL在幼鼠癫痫模型中神经元保护机制的实验并不多,因此,本实验通过建立KA诱导的幼鼠癫痫模型,并予以GL干预,结果发现模型Ⅰ组,与提前30 min注射GL的癫痫模型Ⅱ组比较,行为学观察发现后者可明显延长癫痫发作的潜伏期,降低癫痫发作的易感性及提高SE发生后的生存率。GL预处理可以降低HMGB1基因的表达及血清中HMGB1的水平,抑制HMGB1的胞外释放。并且GL预处理后Neu-N阳性细胞表达计数明显增加,提示GL可以显著减少慢性期海马区神经元的丢失。Cherng等[21]报道GL可抵抗由谷氨酸盐引起的初级神经元的兴奋毒性作用,起到神经元保护作用。Wang等[22]也报道GL及18β-GA(GL的代谢物)在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系中有神经元保护作用,本研究结果与之一致。
综上所述,在幼鼠癫痫模型中,GL也具有抑制癫痫发作的作用,其机制很可能在于通过抑制HMGB1基因的合成及释放到血清中,抑制癫痫发作过程中的炎性反应,从而减轻癫痫慢性期所致的海马区病理性损害,减少了神经元的丢失。