Effects of calcitonin gene-related peptide on aquaporin 1 and aquaporin 5 expressions in young rats with acute lung injury

Fu Hongmin; Nie Wensha; Yuan Tingyun; Yu Kai; Wang Shangkun; Yang Jiawu; Fan Mao; Zhang Tiesong

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.18.008

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• 重症医学 •

降钙素基因相关肽对急性肺损伤幼鼠水通道蛋白1、5表达的影响

中华实用儿科临床杂志, 2017,32(18) : 1389-1392. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.18.008

摘要

目的

探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对脂多糖(LPS)诱导的幼鼠肺水肿及水通道蛋白(AQP)的影响。

方法

84只SD幼鼠按随机数字表法随机分为对照组(12只)、急性肺损伤(ALI)组(36只)和CGRP组(36只)。对照组不做任何干预；ALI组腹腔注射LPS(5 mg/kg)，分别处理2、6、12、24 h；CGRP组在LPS注射1 h后进行腹腔注射CGRP(1 mg/kg)。于2、6、12、24 h处死幼鼠，取出肺组织，苏木精－伊红染色对肺组织进行病理分析，称重法计量各组湿/干质量比值，荧光定量PCR和Western blot分别检测各组幼鼠肺组织中AQP1和AQP5的mRNA和蛋白表达水平。

结果

病理切片显示：与对照组相比，ALI组幼鼠组织肺泡腔明显变窄；肺泡壁毛细血管扩张，肺间质出现炎性细胞浸润。CGRP组肺水肿和炎症浸润程度明显减轻。荧光定量PCR结果显示：24 h后，ALI组AQP1和AQP5 mRNA(0.009±0.001和0.055±0.006)与对照组(0.035±0.002和0.167±0.006)相比均明显降低(均P<0.001)，CGRP处理后两者水平增高(0.024±0.002和0.134±0.012)，与ALI组相比，差异均有统计学意义(均P<0.001)。Western blot结果显示：24 h ALI组AQP1和AQP5蛋白水平(0.397±0.041和0.215±0.029)均低于对照组(0.850±0.020和0.741±0.032)(均P<0.001)，而CGRP组AQP1和AQP5蛋白水平(0.593±0.065和0.461±0.039)亦低于对照组(均P<0.001)，但明显高于ALI组(均P<0.001)。

结论

CGRP能够增加AQP1和AQP5的表达，减轻肺水肿，对ALI幼鼠肺损伤具有保护作用。

引用本文: 付红敏, 聂文莎, 袁廷运, 等. 降钙素基因相关肽对急性肺损伤幼鼠水通道蛋白1、5表达的影响 [J] . 中华实用儿科临床杂志,2017,32 (18): 1389-1392. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.18.008

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急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种常见的危重病，进一步发展可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。由于ARDS的主要病理变化之一是肺水肿，因此，如何调控肺水肿的发生在防治ARDS方面具有重要意义。降钙素基因相关肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)是用分子生物学方法发现的第1个活性多肽^[1]。作者既往研究发现，CGRP可减轻肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化损伤，维持其正常生理功能，可能在防治不同原因导致的ALI/ARDS方面具有一定作用^[2]。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一组细胞膜水转运蛋白，与急性损伤时肺水肿的发生密切相关^[3]。本研究通过制作大鼠ALI模型，予CGRP进行体内干预，检测肺组织中AQP1、AQP5的表达变化，探讨CGRP与肺水肿发生的关系及作用。

1　材料与方法

1.1　材料

清洁级SD大鼠(昆明医科大学实验动物中心提供，批号：11401300042694)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和大鼠CGRP(美国Sigma公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；cDNA第一链合成试剂盒(日本东洋纺)；荧光定量试剂盒(美国KAPA Biosystem公司)；放射性免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二辛可宁酸法(bicinchoninic acid，BCA)定量试剂盒、十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)试剂盒、脱脂奶粉(江苏碧云天有限公司)；AQP1和AQP5多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；电化学发光(ECL)液(美国Perice公司)；倒置荧光显微镜(DMI6000B，德国Leica公司)；QuantStudio™ 12K Flex荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；紫外分光光度仪(日本岛津)。

1.2　方法

1.2.1　LPS诱导ALI动物模型的建立与分组

选用健康SD大鼠84只(雌性，<21 d)，体质量60～70 g。实验前禁食12 h。按随机数字表法分为对照组、ALI组、CGRP组。ALI组(36只)：腹腔注射LPS(5 mg/kg)；CGRP干预组(36只)：LPS注射后1 h，经腹腔注射CGRP(1 mg/kg)；对照组(12只)：经腹腔注射等量9 g/L盐水。3组均于注射LPS后2、6、12、24 h处死(对照组每个时间点3只，其他组每个时间点9只)，剥离新鲜肺组织多聚甲醛固定或－80 ℃冰箱保存。

1.2.2　光镜下观察肺组织变化

各组幼鼠处死后，取右肺上叶组织经40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色，置于显微镜下进行观察。

1.2.3　肺含水量测定

取小块肺组织，吸水纸吸干表面，立即称重记作肺湿重。然后置于80 ℃烤箱内，48 h后(重量不再减轻)称重记为肺干重，计算湿/干质量比值(W/D)，以此了解组织含水量。

1.2.4　荧光定量PCR(qPCR)检测AQP－1和AQP－5 mRNA的表达

取肺组织，应用Trizol试剂提取肺组织总RNA。取总RNA 2 μg，行反转录。PCR扩增AQP1和AQP5，以β－肌动蛋白(β－actin)为内参，每个样本重复3次。AQP1的上游引物为5′－TCTGGAGGGCTGTGGTGGCT－3′，下游引物为5′－AAGTGAGTTCTCGAGCAGGGA－3′；AQP5的上游引物为5′－TGGGTCTTCTGGGTAGGGCCTATTGT－3′，下游引物为5′－GCCGGCTTTGGCACTTGAGATACT－3′。PCR反应条件为：以94 ℃预变性5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s为1个循环，共计40个循环。采用2^－△△Ct的方法比较不同样本的相对表达水平。

1.2.5　蛋白免疫印迹(Western blot)检测AQP1和AQP5蛋白的表达

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA定量蛋白。取20 μg蛋白质上样，12 g/L SDS－PAGE分离，电转移至PVDF膜，经50 g/L脱脂奶粉封闭后，与AQP1或AQP5多克隆抗体(1∶1 000) 4 ℃振摇孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000) 37 ℃孵育1 h，ECL法检测，Quantity One 4.5.0凝胶图像分析软件分析各蛋白条带的光密度。

1.3　统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，实验数据以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　LPS注射6 h后幼鼠肺组织的病理变化

LPS腹腔注射后6 h，肉眼可见肺部充血、水肿，出现淡黄色或淡红色的胸腔积液。光镜下检测对照组幼鼠肺泡结构清晰，间质、肺泡、肺血管及支气管均正常(图1A)。LPS腹腔注射6 h后，可见幼鼠肺组织肺泡腔明显变窄；肺泡壁毛细血管扩张，肺间质出现炎性细胞浸润(图1B)。6 h后，CGRP组肺水肿和炎症浸润程度明显减轻(图1C)。LPS注射后，处理组在各时间点的W/D均高于对照组(P<0.05)；CGRP处理后，W/D较相应时间点的LPS组W/D降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

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表1

对照组、ALI组和CGRP组幼鼠肺组织的湿/干质量比值(±s)

Table 1

The wet/dry of rats lung tissue in cotrol group，ALI model group and CGRP group(±s)

表1

对照组、ALI组和CGRP组幼鼠肺组织的湿/干质量比值(±s)

Table 1

The wet/dry of rats lung tissue in cotrol group，ALI model group and CGRP group(±s)

组别	例数	处死2 h	处死6 h	处死12 h	处死24 h
对照组	3	1.487±0.040	1.504±0.015	1.526±0.030	1.513±0.018
ALI组	9	4.896±0.290^a	5.370±0.219^a	5.013±0.306^a	4.465±0.091^a
CGRP组	9	2.303±0.179^ab	2.834±0.128^ab	2.282±0.376^ab	2.093±0.097^ab
F值		552.50	1 613.00	308.30	3 666.00
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

注：ALI：急性肺损伤；CGRP：降钙素基因相关肽；与对照组比较，^aP<0.001；与ALI组比较，^bP<0.001　ALI：acute lung injury；CGRP：calcitonin gene－related peptide；compared with control group，^aP<0.001; compared with ALI group，^bP<0.001

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图1

脂多糖处理6 h后各组幼鼠肺组织镜下病理改变（HE染色，×200）

Figure 1

The lung tissue pathological changes of rat pups under the microscope after lipopolysaccharides-injection 6 h (HE staining, ×200)

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注：ALI:急性肺损伤；CGRP：降钙素基因相关肽；A:对照组；B:ALI组；C:CGRP组　ALI:acute lung injury; CGRP; calcitonin generelated peptide; A: control group; B: ALI group; C: CGRP group

图1

脂多糖处理6 h后各组幼鼠肺组织镜下病理改变（HE染色，×200）

Figure 1

The lung tissue pathological changes of rat pups under the microscope after lipopolysaccharides-injection 6 h (HE staining, ×200)

2.2　CGRP干预后幼鼠肺组织AQP1、AQP5 mRNA的表达变化

对照组、ALI组和CGRP组AQP1和AQP5的mRNA平均表达水平在同一时间点相比，ALI组较对照组明显下降，CGRP处理后，AQP1和AQP5的表达水平较LPS组明显增加，但仍未达到对照组水平(均P<0.001)，见表2。

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表2

对照组、ALI组和CGRP组幼鼠AQP1和AQP5 mRNA表达变化(±s)

Table 2

The mRNA levels of AQP1 and AQP5 in rats lung tissue from control group，ALI group and CGRP group(±s)

表2

对照组、ALI组和CGRP组幼鼠AQP1和AQP5 mRNA表达变化(±s)

Table 2

The mRNA levels of AQP1 and AQP5 in rats lung tissue from control group，ALI group and CGRP group(±s)

组别	例数	AQP1 mRNA				AQP5 mRNA
组别	例数	2 h	6 h	12 h	24 h	2 h	6 h	12 h	24 h
对照组	3	0.034±0.002	0.035±0.003	0.035±0.002	0.347±0.002	0.154±0.013	0.157±0.003	0.160±0.015	0.167±0.006
ALI组	9	0.0263±0.003^a	0.008±0.002^a	0.009±0.001^a	0.009±0.001^a	0.141±0.015	0.017±0.008^a	0.048±0.005^a	0.055±0.004^a
CGRP组	9	0.023±0.002^ab	0.021±0.001^ab	0.025±0.001^ab	0.024±0.002^ab	0.138±0.014	0.110±0.013^ab	0.133±0.015^ab	0.134±0.012^ab
F值		22.00	285.70	744.40	528.54	1.41	293.60	168.50	276.90
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.270	<0.001	<0.001	<0.001

注：ALI：急性肺损伤；CGRP：降钙素基因相关肽；AQP：水通道蛋白；与对照组比较，^aP<0.001；与ALI组比较，^bP<0.001　ALI：acute lung injury；CGRP：calcitonin gene－related peptide；AQP：aquaporin；compared with control group，^aP<0.001; compared with ALI group，^bP<0.001

2.3　CGRP干预后3组幼鼠肺组织AQP1、AQP5蛋白表达变化

24 h后，ALI组AQP1和AQP5蛋白的表达水平(与β－actin的灰度值比)明显较对照组降低，而CGRP组AQP1和AQP5表达水平明显升高，但与对照组比较差异仍有统计学意义(均P<0.001)，见图2，表2。

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图2

处理24 h后各组幼鼠肺组织AQP1和AQP5的蛋白表达水平

Figure 2

The protein levels of AQP1 and AQP5 in rat lung tissue from control group，ALI group and CGRP group after 24 h treatment

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注：AQP：水通道蛋白；ALI：急性肺损伤；CGRP：降钙素基因相关肽　AQP：aquaporin；ALI：acute lung injury；CGRP：calcitonin gene－related peptide

图2

处理24 h后各组幼鼠肺组织AQP1和AQP5的蛋白表达水平

Figure 2

The protein levels of AQP1 and AQP5 in rat lung tissue from control group，ALI group and CGRP group after 24 h treatment

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表3

处理24 h后对照组、ALI组和CGRP组幼鼠AQP1和AQP5的蛋白表达水平(±s)

Table 3

The protein levels of AQP1 and AQP5 in rats lung tissue from control group，ALI model and CGRP group after 24 h(±s)

表3

处理24 h后对照组、ALI组和CGRP组幼鼠AQP1和AQP5的蛋白表达水平(±s)

Table 3

The protein levels of AQP1 and AQP5 in rats lung tissue from control group，ALI model and CGRP group after 24 h(±s)

组别	例数	AQP1蛋白	AQP5蛋白
对照组	3	0.850±0.020	0.741±0.032
ALI组	9	0.397±0.041^a	0.215±0.029^a
CGRP组	9	0.593±0.065^ab	0.461±0.039^ab
F值		93.08	296.50
P值		<0.001	<0.001

3　讨论

本研究通过腹腔注射LPS的方式构建幼鼠肺损伤模型，发现注射LPS 2 h后，幼年大鼠出现烦躁、发绀、呼吸加快，肺泡上皮细胞出现肿胀，间质水肿，肺W/D比较对照组明显升高，说明幼鼠ALI模型构建成功。

ALI后的主要病理变化之一是肺水肿，在这一过程中，水通道蛋白起重要作用^[4]。目前已发现13种AQP(AQP0～AQPl2)，称为AQP家族。其中AQP1、AQP5主要分布在下呼吸道，对维持肺泡腔内相对干燥的环境，从而进行有效的气体交换具有非常重要的意义^[5]。许多研究已经证明，在ALI和ARDS的病理过程中，AQP表达下调，造成肺间质和肺泡内水转运障碍，从而使肺泡腔、肺间质水肿加重^[6,7]。本结果显示，给幼年大鼠注射LPS 6 h后，肺组织AQPl和AQP5表达水平明显降低，且此时肺上皮细胞及间质肿胀明显，提示肺损伤时AQP可能通过调节肺内液体平衡参与ALI肺水肿发生。

因此，调控AQP的表达或活性在防治ALI肺水肿的过程中有重要意义。AQPs的调节通常分为2种：(1)调节AQPs的活性。由于AQP磷酸化为环磷酸腺苷(cAMP)依赖性，因此激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP增加，提高AQP上的丝氨酸磷酸化，可使细胞膜对水的通透性增加。(2)通过改变细胞上AQP的含量来调节跨膜水流动^[8]。研究表明，糖皮质激素使水通道蛋白上调；而肿瘤坏死因子α使水通道基因表达下调^[9]。

CGRP是一种含37个氨基酸的感觉神经肽，广泛存在于肺神经内分泌细胞(PNEC)和肺的神经纤维中，参与了呼吸道病理生理的调节过程^[10]。诸多研究发现CGRP能够减缓LPS诱导的ALI^[11,12,13]，但多数集中于同炎性反应相关方面，但尚未存在对水通道蛋白作用的研究。作者既往研究同样发现，CGRP可减轻肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤，减轻肺组织水肿，但这种效应是否是通过提高肺组织上AQP的表达来实现，目前尚不清楚^[14]。本研究在幼鼠ALI模型中给予CGRP干预，发现注射CGRP 6 h后，肺组织AQP1 mRNA和AQP5 mRNA表达均增加，且肺W/D比明显下降，肺上皮细胞及间质肿胀明显减轻，提示CGRP可能通过提高AQP的表达减轻了肺水肿。然而，CGRP是直接还是间接调控水通道蛋白仍然需要进一步研究。

调控AQP的表达以改善肺水肿应是治疗ALI/ARDS的重要手段，而神经肽CGRP可以增加AQP的表达，可能在防治儿童ARDS的发生发展过程中发挥重要作用。如何提高内源性CGRP的表达，寻找其表达调控机制可能是未来ARDS防治研究中的新课题。

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付红敏