探讨和厚朴酚对细颗粒物(PM2.5)所致哮喘小鼠呼吸道炎症是否具有保护作用及其作用途径。
将50只雌性无特殊病原菌(SPF)级Balb/c小鼠按随机数字表法分为5组，每组10只。A组：正常对照组；B组：哮喘模型组；C组：PM2.5暴露哮喘组；D组：TAK-242组；E组：和厚朴酚组。采用卵清蛋白(OVA)致敏并激发建立哮喘小鼠模型，B～E组第0天和第7天经小鼠腹腔注射100 mg/L OVA和氢氧化铝混合液0.1 mL致敏，第14天至第21天，以10 g/L OVA 9 g/L盐水溶液雾化30 min激发；C～E组从首次雾化第1天开始到末次激发气管注入PM2.5激发，隔日1次，共4次；在此基础之上，D组给予TAK-242腹腔注射处理，E组给予和厚朴酚灌胃处理。A组小鼠，以9 g/L盐水代替OVA同步进行实验。末次激发24 h后麻醉并解剖小鼠，左肺进行肺泡灌洗留取肺泡灌洗液(BALF)进行炎性细胞总数及分类计数；取右肺行HE染色、病理学检查；实时荧光定量PCR分析技术检测小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)中Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)mRNA的表达，流式细胞仪检测Th17和Treg细胞的表达。
与A组比较，B组及C组小鼠支气管黏膜上皮细胞变形、脱落，上皮增生变厚，肺泡壁充血水肿，管腔内黏液分泌增加，肺部炎性细胞浸润，C组较B组更为明显，而E组小鼠呼吸道炎症明显减轻；B组及C组BALF中炎性细胞总数分别为(16.79±5.62)×108/L和(24.58±13.46)×108/L，嗜酸性粒细胞比例为0.113 8±0.022 3和0.197 8±0.084 9，均显著高于A组[(4.15±1.35)×108/L、0.012 0±0.002 3]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；E组BALF中炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞比例[(8.56±3.28)×108/L)、0.041 5±0.013 5]与C组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；B组及C组PBMCs中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达分别为1.85±0.56、1.82±0.28和2.97±0.41、2.83±0.32，均显著高于A组(1.06±0.19、1.08±0.17)，差异均有统计学意义(均P<0.05)；E组PBMCs中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达(1.60±0.28、1.54±0.25)与C组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；B组及C组PBMCs中Th17细胞的表达水平分别为(2.89±0.61)%、(4.96±0.27)%，均显著高于A组[(1.03±0.35)%]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；E组PBMCs中Th17细胞的表达[(1.83±0.23)%]明显低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；B组及C组PBMCs中Treg细胞的表达分别为(4.96±0.35)%、(2.27±0.41)%，均显著低于A组[(7.37±0.56)%]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；E组PBMCs中Treg细胞的表达[(6.45±0.38)%]明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；D、E组情况较B组及C组明显改善。
和厚朴酚能减轻PM2.5暴露哮喘小鼠的呼吸道炎症，其作用机制与下调TLR4、NF-κB表达和调节Th17及Treg细胞平衡有关。
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随着工业发展及城市化进程的加快，大气污染给人类健康带来巨大威胁。大气污染物中的细颗粒物(PM2.5)因其颗粒小，表面积大，能随呼吸进入肺泡引起肺部炎症和免疫反应，促进与支气管哮喘(哮喘)相关的细胞因子释放，与哮喘发生密切相关[1,2,3]。
哮喘是由多种炎性细胞及细胞组分共同参与的呼吸道慢性炎症性疾病。Toll样受体4 (TLR4)是一种主要表达于单核细胞、巨噬细胞及呼吸道平滑肌细胞等细胞表面的跨膜蛋白，能够通过激活转录因子核因子κB(NF-κB)调控白细胞介素(IL)-4及IL-17等细胞因子的表达而在哮喘的呼吸道炎症中发挥关键作用[4]。然而TLR4/NF-κB信号通路在PM2.5暴露哮喘的呼吸道炎症中是否起作用还不是很清楚。和厚朴酚是中药厚朴的重要组成成分，具有抗感染、抗氧化、抗衰老及免疫调节等作用[5]。有研究发现，和厚朴酚能够抑制NF-κB的表达而诱导Th17细胞凋亡[6]。因此，本研究以PM2.5暴露哮喘小鼠为研究模型，利用和厚朴酚进行干预，旨在探讨PM2.5暴露是否通过调控TLR4/NF-κB通路的表达影响哮喘呼吸道炎症的发生和发展及和厚朴酚在其中的作用。
6～8周龄雌性BALB/c小鼠，无特殊病原菌(SPF)级别，体质量为20～22 g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心[实验动物许可证号SYXK(鄂)2016－0057，批号：42000600013929]，SPF级动物饲养室内常规饲养，自由采食与饮水，以标准维持饲料进行喂养，1周后用于实验研究。
卵清蛋白(OVA，美国Sigma公司)，氢氧化铝[Al(OH)3]干粉(美国Sigma公司)，小鼠淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；改良伊格尔培养基(DMEM培养基)、新生牛血清、胎牛血清及Trizol Reagent (美国Invitrogen公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI7900/illumina eco)，FERMENTAS(MBI)反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；SYBRGreenPCR Master Mix (美国Biosystems ABI公司)；anti-mouse CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)、anti-mouse IL-17-别藻蓝蛋白(APC)、anti-mouse CD25-APC (美国eBiosciences公司)；TAK-242购于上海皓元生物医药有限公司(目录号HY-11109)，PM2.5购于湖北省疾控中心，厚朴酚标准品购于中国生物制品检定所(批号：TCI H1309)。
将50只雌性SPF级Balb/c小鼠按随机数字表法分为5组，每组10只。A组：正常对照组；B组：哮喘模型组；C组：PM2.5暴露哮喘组；D组：TAK-242组；E组：和厚朴酚组。参照North等[7]OVA致敏并激发建立哮喘小鼠模型的方法并加以改进，B～E组第0天和第7天经小鼠腹腔注射100 mg/L OVA和Al(OH)3混合液0.1 mL致敏，第14天至第21天，以10 g/L OVA 9 g/L盐水溶液雾化30 min激发；C～E组从首次雾化第1天开始到末次激发气管注入PM2.5 15 mg/kg激发，隔日1次，共4次；在此基础之上，D组给予3 μg/kg TAK-242腹腔注射处理，直至造模完成；E组给予8 μg/kg和厚朴酚连续灌胃，直至造模完成。A组小鼠，以9 g/L盐水代替OVA同步进行实验。小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛、喘鸣为阳性反应。各组于最后一次激发后24 h处死动物行各项检测。
每组各取5只小鼠右下肺组织，100 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色镜检。
将各组小鼠用100 g/L水合氯醛300 mg/kg麻醉后，解剖小鼠回收BALF，回收率约80%，分装于离心管内。在4 ℃，1 500 r/min(离心半径为13.5 cm)离心10 min，取上清液－80 ℃保存待测细胞因子。经离心沉淀细胞于2 h内作细胞分离，即细胞沉淀用0.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，取0.1 mL于血细胞计数台测定细胞总数，取0.2 mL涂片Wright-Giemsa染色，计数200个细胞作细胞分类。
将各组小鼠用100 g/L水合氯醛300 mg/kg麻醉后心脏穿刺取血，每只小鼠取抗凝血1.5 mL，以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入等体积小鼠淋巴细胞分离液上层，1 000×g离心20 min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的PBMCs，加入Hanks液3 mL，混匀后，1 500×g离心5 min。弃去上清，用含100 g/L胎牛血清和含终质量浓度为5 mg/L刀豆蛋白A的RPMI 1640培养液，调整PBMCs浓度至1×109/L进行培养。
分别取各组PBMCs悬液，PBS洗2遍，采用Trizol法抽提细胞总RNA，反转录后采用实时荧光定量PCR法检测各组PBMCs中TLR4 mRNA及NF-κB mRNA表达情况。TLR4及NF-κB引物采用Primier 3.0在线软件设计，见表1。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s；共30个循环，72 ℃再延伸4 min。样品均重复检测3次，最后通过计算2－△△Ct获得各基因的相对含量。
实时荧光定量PCR引物序列
Real－time quantitative PCR primer sequence
实时荧光定量PCR引物序列
Real－time quantitative PCR primer sequence
| 基因 | 引物序列(5′－3′) |
|---|---|
| β-actin | 正向引物：ACGATGGAGGGGCCGGACTCATC |
| 反向引物：AAAGACCTCTATGCCAACACAGT | |
| TLR4 | 正向引物：TGGGTCAAGGAACAGAAGCA |
| 反向引物：TCACACTGACCACTGACACA | |
| NF-κB | 正向引物：TGCTGGAAGTCACATCTGGT |
| 反向引物：TGCTGAGGATTCTGTCGTGT |
注：TLR4：Toll样受体4；NF-κB：核转录因子-κB TLR4：Toll－like receptors 4；NF－κB：nuclear factor－κB
分别取各组PBMCs 100 μL于流式管中，加入流式抗体anti-mouse-APC-IL-17和anti-mouse-FITC-CD4或anti-mouse CD25-APC和anti-mouse-FITC-CD4进行标记(操作按美国eBioscience公司试剂盒说明书要求进行)。室温25 ℃静置，避光染色30 min。用洗涤液洗2次，每次加洗涤液2 mL，300×g离心5 min。弃上清，加入20 g/L多聚甲醛固定液300 μL重悬细胞。流式细胞仪分析。
应用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用
±s表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，方差齐性者组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。
HE染色可见A组小鼠支气管上皮黏膜完整、支气管黏膜下和周围肺组织无炎性细胞浸润(图A)，与A组相比，B、C组支气管黏膜上皮细胞变形、脱落，基底膜增厚及管腔内分泌物增多，大量炎性细胞浸润，C组较B组更为明显(图B、图C)。D组及E组小鼠呼吸道炎症明显减轻(图D、图E)。
注：A：正常对照组；B：哮喘模型组；C：PM2.5暴露哮喘组；D：TAK-242组；E：和厚朴酚组 A：normal control group；B：asthma model group；C：PM2.5 group；D：TAK－242 group；E：honokiol group
与A组比较，B组及C组小鼠BALF中的炎性细胞总数及分类(包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞百分比)显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；且C组高于B组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；D组及E组显著低于C组，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组及E组之间并无差异，见表2。
各组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数及分类计数 (
±s)
Leukocyte and subgroup cell count in bronchoalveolarlavage fluid of mice among normal control group，asthma model group，PM2.5 group，TAK－242 group and Honokiol group (
±s)
各组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数及分类计数 (±s)
Leukocyte and subgroup cell count in bronchoalveolarlavage fluid of mice among normal control group，asthma model group，PM2.5 group，TAK－242 group and Honokiol group (±s)
| 组别 | 只数 | 细胞总数(×108/L) | 嗜酸性粒细胞比例 | 中性粒细胞比例 | 淋巴细胞比例 |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | 4.15±1.35 | 0.012 0±0.002 3 | 0.014 7±0.004 2 | 0.006 7±0.003 1 |
| 哮喘模型组 | 10 | 16.79±5.62a | 0.113 8±0.022 3a | 0.045 8±0.015 7a | 0.048 3±0.014 6a |
| PM2.5暴露哮喘组 | 10 | 24.58±13.46ab | 0.197 8±0.084 9ab | 0.114 6±0.063 8ab | 0.156 5±0.076 5ab |
| TAK-242组 | 10 | 7.95±2.29c | 0.040 2±0.008 7c | 0.041 8±0.006 2c | 0.024 1±0.005 6c |
| 和厚朴酚组 | 10 | 8.56±3.28c | 0.041 5±0.013 5c | 0.042 1±0.015 6c | 0.024 9±0.003 7c |
| F值 | 17.23 | 26.58 | 8.12 | 64.57 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：与正常对照组比较，aP<0.05；与哮喘模型组比较，bP<0.05；与PM2.5暴露哮喘组比较，cP<0.05 Compared with normal control group，aP<0.05；compared with asthma model group，bP<0.05；compared with PM2.5 exposure asthmatic group，cP<0.05
与A组比较，B组及C组小鼠PBMCs中TLR4 mRNA及NF-κB mRNA显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；且C组均显著高于B组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；D组及E组显著低于C组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；D组及E组之间并无差异，见图2。
注：A：正常对照组；B：哮喘模型组；C：PM2.5暴露哮喘组；D：TAK-242组；E：和厚朴酚组；RQ：相对定量；TLR4：Toll样受体4；NF-κB：核转录因子-κB；与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05 A：normal control group；B：asthma model group；C：PM2.5 group；D：TAK－242 group；E：honokiol group；RQ：relative quantification；TLR4：Toll－like receptors 4；NF－κB：nuclear factor－κB；compared with group A，aP<0.05；compared with group B，bP<0.05；compared with group C，cP<0.05
选择CD4＋IL-17＋T及CD4＋CD25＋T分别代表Th17及Treg进行观察。结果显示：与A组[(1.03±0.35)%]比较，B组[(2.89±0.61)%]及C组[(4.96±0.27)%]小鼠PBMCs中CD4＋IL-17＋显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；且C组[(4.96±0.27)%]高于B组[(2.89±0.61)%]，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组[(1.81±0.20)%]及E组[(1.83±0.23)%]显著低于C组[(4.96±0.27)%]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；D组[(1.81±0.20)%]及E组[(1.83±0.23)%]之间并无差异。与A组[(7.37±0.56)%]比较，B组[(4.96±0.35)%]及C组[(2.27±0.41)%]小鼠PBMCs中CD4＋CD25＋T显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且C组显著低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组[(6.51±0.43)%]及E组[(6.45±0.38)%]显著高于C组[(2.27±0.41)%]，差异有统计学意义(P<0.05)；D组[(6.51±0.43)%]及E组[(6.45±0.38)%]之间并无差异，见图3。
注：A：正常对照组；B：哮喘模型组；C：PM2.5暴露哮喘组；D：TAK-242组；E：和厚朴酚组 A：normal control group；B：asthma model group；C：PM2.5 group；D：TAK－242 group；E：Honokiol group
哮喘是一种受遗传和环境因素共同影响的异质性疾病。近几十年来，全球哮喘的患病率和病死率不断上升，我国同样如此，是世界上哮喘病死率最高的国家之一，目前无法单纯用基因变化解释其快速上升的患病率，因此大气污染对哮喘的影响成为研究的热点[8,9]。研究显示PM2.5吸附的物质可作为变应原诱发哮喘，引起哮喘的发作与急性加重；PM2.5因体积小，在空中滞留时间长，能随呼吸进入下呼吸道，进而加重呼吸道炎症反应诱发哮喘，且其浓度与哮喘严重程度呈正相关[10,11]。本研究发现，PM2.5暴露哮喘小鼠肺组织炎症改变及BALF中炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞比例均显著高于哮喘模型组，证实PM2.5的暴露加重了哮喘的呼吸道炎症。
TLR4是一种重要的免疫识别受体，连接固有免疫和适应性免疫，在启动和调节呼吸道炎症过程中发挥重要作用。NF-κB是具有广泛生物学活性的核转录因子，TLR4可使下游NF-κB活化，进而促进各种促炎性因子如IL-6等的表达而形成炎症反应[12,13]。目前观点认为CD4＋T淋巴细胞的数量及功能失衡在哮喘呼吸道慢性炎症中扮演着极为重要的角色，其中高水平分泌IL-17等细胞因子的Th17细胞介导的适应性免疫应答与哮喘呼吸道炎症的发生发展密切相关。那么在PM2.5暴露的哮喘模型中，TLR4/NF-κB是否在其中起作用以及有无影响Th17细胞还不是很清楚。本研究结果显示哮喘组TLR4及NF-κB mRNA明显升高，而且PM2.5暴露哮喘模型中升高更为明显，说明TLR4/NF-κB通路参与PM2.5暴露哮喘的呼吸道炎症；进一步观察发现CD4＋IL-17＋T细胞在PM2.5暴露哮喘小鼠明显升高，CD4＋CD25＋T细胞在PM2.5暴露哮喘小鼠明显降低，说明PM2.5暴露可加重哮喘的呼吸道炎症反应并且与Th17/Treg失衡相关。另本研究结果发现使用TAK-242抑制TLR4的表达，明显减轻肺组织炎症损伤，降低炎性细胞浸润程度及Th17细胞的表达，升高了Treg细胞水平，表明阻断TLR4/NF-κB通路可缓解PM2.5暴露哮喘的呼吸道炎症，调节Th17/Treg失衡。
近几十年来哮喘的治疗采取包括吸入糖皮质激素在内的综合抗炎治疗方案，但哮喘的患病率、病死率仍呈逐年增高趋势，因此从天然植物中寻找安全有效的药物成为哮喘研究的热点。和厚朴酚是中药厚朴的重要化学成分，能有效抑制NF-κB、转录信号转导子与激活子3(STAT3)及表皮生长因子受体(EGFR)等细胞因子的表达而发挥抗炎作用[14,15]。本研究中将和厚朴酚用于PM2.5暴露哮喘小鼠治疗，结果显示肺组织损伤及炎症细性浸润程度均明显降低，和厚朴酚减少BALF中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞比例，降低TLR4/NF-κB及Th17细胞的表达，升高了Treg细胞水平，具有与TAK-242相似的效果。
综上，TLR4/NF-κB通路很可能通过调控Th17/Treg失衡参与PM2.5暴露哮喘呼吸道炎症的发生和发展过程，而和厚朴酚能够通过干预TLR4/NF-κB通路，诱导Th17细胞凋亡，从而抑制呼吸道炎症而在PM2.5暴露哮喘的防治中发挥关键作用。这个结果为哮喘的药物治疗提供了重要的实验基础，同时为PM2.5对哮喘发生和发展影响的机制研究提供新思路。
