探讨微小RNA(miR)-766在多关节型幼年特发性关节炎(poly-JIA)患儿血浆中的表达及临床意义。
选取2014年11月至2016年9月在首都儿科研究所附属儿童医院风湿免疫科住院治疗的poly-JIA患儿23例为研究组，以同期收治的24例少关节型幼年特发性关节炎(oligo-JIA)和19例幼年强直性脊柱炎(JAS)患儿为病例对照组，以24例同年龄健康儿童为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法测定各组研究对象血浆miR-766的表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析miR-766表达水平的临床诊断价值。运用Pearson相关系数分析miR-766表达量与临床和实验室检查参数之间的相关性。
miR-766在poly-JIA患儿血浆中的表达水平显著低于健康对照组(t＝6.897，P<0.001)及oligo-JIA和JAS(t＝6.446、6.218，均P<0.001)2个病例对照组，差异均有统计学意义。病例对照组患儿血浆miR-766表达水平与健康对照组儿童相比差异无统计学意义(P>0.05)。与健康对照组相比，血浆miR-766水平预测poly-JIA的ROC下面积(AUC)为0.938(95%CI：0.872～1.000)，当其截断值为6.083 pmol/L时，敏感度为87.0%，特异度为91.7%。与oligo-JIA和JAS患儿相比，AUC分别为0.908(95%CI：0.819～0.996)和0.927(95%CI：0.865～1.000)。相关性分析显示，poly-JIA患儿血浆中miR-766表达量与血红蛋白水平呈正相关(r＝0.651，P<0.001)，与28处关节疾病活动度评分(DAS28)和1型辅助性T淋巴细胞(Th1)百分比(Th1%)均呈负相关(r＝－0.434，P＝0.038；r＝－0.417，P＝0.008)。
miR-766在poly-JIA患儿血浆中的表达水平显著降低，其表达水平对poly-JIA的诊断和鉴别诊断具有一定的参考价值。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是以慢性关节炎为主要特征并伴有全身多脏器受累的儿童自身免疫性疾病，严重时会导致小儿残疾和失明，多关节型JIA(poly-JIA)是其主要疾病亚型之一[1]。根据血液中是否存在自身抗体——类风湿因子(RF)，将其分为RF阴性和RF阳性。poly-JIA常表现为对称性关节炎性病变，主要累及膝、踝及指间小关节，后发展到其他关节。poly-JIA致残率高，预后较差，临床表现及相关实验室检查缺乏特异性，易漏诊、误诊[2]。目前，针对poly-JIA临床血清学指标相关性的研究报道较少。
microRNA(miR)作为一类内源性非编码的单链小RNA分子，通过与靶基因mRNA的3′-UTR区域结合，在转录后水平调节基因表达。miRs表达异常会影响免疫调控过程，并改变免疫细胞激活和细胞因子产生的程度[3]。这些特异性miRs的变化规律与疾病的病理变化相关联，并反映在体液或组织中。但目前有关miRs与poly-JIA的研究甚少，对其调控机制仍不清楚。本研究以基因芯片筛选出的miR-766为研究目标，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术检测其在poly-JIA患儿血浆中的表达水平，探讨其在poly-JIA诊断和鉴别诊断中的价值。
选取2014年11月至2016年9月在首都儿科研究所附属儿童医院风湿免疫科住院的poly-JIA患儿23例。其中男7例，女16例；年龄2～15(8.23±5.08)岁。选取同期收治的少关节型JIA(oligo-JIA)和幼年强直性脊柱炎(juvenile ankylosing spondylitis，JAS)患儿为病例对照组。oligo-JIA患儿24例，男9例，女15例；年龄2～15(6.75±3.86)岁。JAS患儿19例，男15例，女4例；年龄6～15(11.7±2.83)岁。患儿均符合美国风湿病协会(ACR)制定的诊断标准[4]。选取同期在首都儿科研究所附属儿童医院保健科体检健康的儿童作为健康对照组，共24例。其中男11例，女13例；年龄2～13(6.38±3.34)岁。poly-JIA组和健康对照组、oligo-JIA组年龄比较差异均无统计学意义(t＝1.359，P>0.05；t＝1.092，P>0.05)。poly-JIA组和JAS组年龄差异有统计学意义(t＝2.125，P<0.05)。本研究经首都儿科研究所医学伦理委员会审查通过(伦理审查编号：SHERLLM 2015002)，监护人均知情同意。
研究对象于入院次日清晨空腹采集静脉血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采血2 h内2 000 r/min(离心半径为13.5 cm)离心5 min，分离血浆与红细胞。将分装的血浆于－80 ℃冰箱保存备用。
查阅病历，记录患者各自入院时血红蛋白(Hb)水平，并计算28处关节疾病活动度评分(disease activity score in 28 joints，DAS28)评估JIA患儿病情活动。DAS28以双手侧近端指间关节(10个)、掌指关节(10个)、腕关节(2个)、肘关节(2个)、肩关节(2个)及膝关节(2个)共计28个关节计分，评分由触痛关节数(tender joint count，TJC)、肿胀关节数(swollen joint count，SJC)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentaition ratio，ESR)等参数计算得出。计算公式：DAS28＝[0.56×sqrt(TJC)＋0.28×sqrt(SJC)＋0.70×ln(ESR)]×1.08＋0.16。DAS28<3.2分为缓解期或轻度活动期，3.2～5.1分为中度活动期，DAS28>5.1分为重度活动期[5]。
取－80 ℃冰箱保存的血浆样本置于冰上融化后12 000×g，4 ℃离心10 min。250 μL血浆中加入750 μL Trizol-LS(1︰3)，充分混匀后室温静置5 min。每个样本中加入5 μL 5 nmol/L cel-miR-39模拟物(mimics)用于定量分析。按照说明书分离总RNA及miRNA并进行纯化。紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。
参照miRBase(http：//www.mirbase.org/)中相关的miRNAs序列进行设计引物，miR-766反转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCTGAGG-3′，上下游引物序列分别如下：5′-ACACTCCAGCTGGGACTCCAGCCCCACAG-3′，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。外参cel-miR-39反转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAAGCTGA-3′，上下游引物序列分别如下：5′-ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATC-3′，5′-TG－GTGTCGTGGAGTCG-3′。提取的miRNAs加入20 μL反转录体系(reverse transcription system A3500，美国Promega公司)，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，95 ℃加热5 min失活反转录酶，4 ℃保存。通过反转录得到的cDNA产物采用SYBR Green qPCR Master Mix在Applied Biosystems 7500 Real－Time PCR System(美国Life Technologies公司)上进行表达检测。反应体系如下：SYBR Green荧光染料预混体系10 μL，上下游引物各0.2 μL，互补DNA 2 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)水7.6 μL；采用两步法扩增：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 1 min，40个循环。每个样本均设3个复孔，采用内参进行归一化。qPCR结果采用ABI 7500 software v2.0.4软件进行分析。根据miRBase中miR-766序列信息，人工合成已知浓度的miR-766 mimics，以此作为标准品。通过倍比稀释的方法构建8个浓度梯度10－2～105 pmol/L，与样本同时进行qPCR。根据标准曲线计算出每升血浆中miR-766的表达量。
取肝素抗凝血分装2管，每管100 μL。分别加入Mc IgG1-藻红蛋白(PE)和Mc IgG1-Cy5(阴性对照管)，anti-CD3-异硫氰酸荧光素(FITC)、anti-CD4-Cy5和anti-CD30-PE(Th检测管)，振荡混匀后室温避光反应15 min。加入2 mL溶血素，混匀裂解10 min，1 000 r/min离心5 min(离心半径为10 cm)后弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，加入300 μL 10 g/L多聚甲醛溶液固定，通过FACS Calibur流式细胞仪检测。采用荧光抗体染色阳性细胞百分率记录Th1(CD3＋、CD4＋、CD30－)、Th2(CD3＋、CD4＋、CD30＋)的百分率。
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。经正态性检验和方差齐性检验(F检验)后，数据均符合正态分布，计量数据采用
±s表示。2组比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。miRNA诊断和鉴别诊断的敏感性和特异性通过受试者工作特征曲线(ROC)进行分析评价。miRNA表达量和临床和实验室检查参数之间的相关性采用Pearson相关分析。
poly-JIA患儿血浆中miR-766的表达量显著低于健康对照组(5.89±0.22比6.25±0.13)，差异具有统计学意义(t＝6.897，P<0.001)；与oligo-JIA组和JAS组相比，poly-JIA患儿血浆中miR-766的表达量也显著低于oligo-JIA组(6.22±0.12)(t＝6.446，P<0.001)和JAS组(6.26±0.14)(t＝6.218，P<0.001)，见图1。健康对照组儿童与oligo-JIA、JAS组患儿血浆miR-766表达水平比较差异无统计学意义(t＝1.031、0.035，均P>0.05)。
注：poly-JIA：多关节型幼年特发性关节炎；oligo-JIA：少关节型幼年特发性关节炎；JAS：幼年强直性脊柱炎 poly－JIA：polyarticular juvenile idiopathic arthritis；oligo－JIA：oligoarticular juvenile idiopathic arthritis；JAS：juvenile ankylosing spondylitis
对poly-JIA患儿和健康对照组儿童血浆miR-766表达水平进行ROC绘制，结果显示ROC曲线下面积(AUC)为0.938(95%CI：0.872～1.000)，当其截断值为6.083 pmol/L时，敏感度为87.0%，特异性为91.7%。对poly-JIA与oligo-JIA和JAS患儿血浆miR-766表达量进行ROC分析，AUC分别为0.908(95%CI：0.819～0.996)和0.927(95%CI：0.865～1.000)。当截断值为6.094 pmol/L时鉴别poly-JIA与oligo-JIA的敏感度为91.7%，特异性为87.0%；当截断值为6.080 pmol/L时鉴别poly-JIA与JAS的敏感度为100%，特异性为87.1%，结果见表1。
健康对照组与poly-JIA组、oligo-JIA和JAS病例对照组miR-766的ROC曲线分析
ROC curve analysis of the levels of miR－766 in the plasma of poly－JIA group，healthy control group，oligo－JIA group and JAS group
健康对照组与poly-JIA组、oligo-JIA和JAS病例对照组miR-766的ROC曲线分析
ROC curve analysis of the levels of miR－766 in the plasma of poly－JIA group，healthy control group，oligo－JIA group and JAS group
| 组别 | AUC | 95%CI | P值 |
|---|---|---|---|
| poly-JIA组比健康对照组 | 0.938 | 0.872～1.000 | <0.001 |
| poly-JIA组比oligo-JIA组 | 0.908 | 0.819～0.996 | <0.001 |
| poly-JIA组比JAS组 | 0.927 | 0.865～1.000 | <0.001 |
注：poly-JIA：多关节型幼年特发性关节炎；oligo-JIA：少关节型幼年特发性关节炎；JAS：幼年强直性脊柱炎；ROC：受试者工作特征曲线；AUC：曲线下面积 poly－JIA：polyarticular juvenile idiopathic arthritis；oligo－JIA：oligoarticular juvenile idiopathic arthritis；JAS：juvenile ankylosing spondylitis；ROC：receiver operating characteristic curve；AUC：area under the curve
血浆miR-766的表达水平与Hb水平呈显著正相关(r＝0.651，P<0.001)，与DAS28呈负相关(r＝－0.434，P＝0.038)。在实验室检查参数中，miR-766的表达水平与Th1细胞百分比(Th1%)呈负相关(r＝－0.417，P＝0.008)，见图2。而miR-766的表达量与Th2细胞百分比(Th2%)无相关性(r＝0.193，P>0.05)。
注：poly-JIA：多关节型幼年特发性关节炎；Hb：血红蛋白；DAS28：28处关节疾病活动度评分；Th1：1型辅助性T细胞 poly-JIA:polyarticular juvenile idiopathic arthritis;Hb:hemoglobin;DAS28: discasc activity score in 28 joints; Th1: type 1 helper T cells
JIA是由于免疫系统功能紊乱引起的儿童自身免疫性疾病。该疾病具有异质性，各亚型起病、病程、转归及预后均不尽相同，导致其发病机制仍无法阐明。除与遗传、感染因素有关外，目前普遍认为JIA发病与机体免疫失衡和炎性反应密切相关[1]。miRNAs是近年来广受关注的参与基因表达调控的重要因子，通过沉默靶基因或基因组，调控细胞增殖、分化、凋亡等重要生命过程[3]。研究发现，miRNAs参与多种免疫炎症信号通路的调节，其异常表达会影响免疫细胞的分化、激活和细胞因子的产生等，导致免疫系统相关疾病的发生[6]。除此之外，血浆miRNAs因其稳定性、组织特异性和成熟的检测方法，逐渐发展成为多种疾病诊断和预后的较为理想的生物标志物[7,8]。JIA的诊断为排他性诊断，需要除外其他引起小儿慢性关节炎的疾病才能确诊，因此其鉴别诊断尤为重要。目前为止，JIA尚无特异的实验室检查指标，实验室检查结果仅用来判断该疾病活动性及治疗效果。miRNAs的发现为JIA的诊断提供了新的思路。
目前，关于miRNAs在JIA中的表达谱及调控机制的研究甚少。Kamiya等[9]发现5个已知在成人类风湿关节炎中差异性表达的miRNAs(miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155和miR-233)在JIA血清的表达量也发生改变。Li等[10]和Schulert等[11]分别发现miRNA-125a-5p和miR-146a在全身型JIA中显著升高，通过调节巨噬细胞向M1型极化参与全身型JIA发病。本课题组提取了健康儿童和JIA患儿(全身型、少关节型和多关节型)血浆miRNAs进行芯片筛查。结果显示，与健康儿童相比，JIA患儿血浆中miRNAs表达谱发生改变，且这3个亚型间差异性表达的miRNAs不尽相同[12,13]。本课题组前期研究发现，miR-16在poly-JIA患儿血浆中特异性上调表达，且与血浆中IL-6的表达水平呈正相关性，但ROC曲线分析结果表明该miRNA用于诊断poly-JIA和oligo-JIA的敏感度和特异性不足，不能很好地区分这2种亚型[12]。本研究通过比较23例poly-JIA、24例oligo-JIA、19例JAS患儿和24例健康对照组儿童血浆miR-766的表达水平，发现poly-JIA患儿血浆miR-766的表达水平显著下调。ROC分析显示，miR-766表达水平不仅可以将健康儿童与poly－JIA患儿区别开来(截断值为6.083 pmol/L)，还可有效地将JIA2种亚型区别开来(截断值为6.094 pmol/L)，诊断及鉴别诊断效果优于miR-16。综合以上结果，miR-766表达水平的截断值6.1 pmol/L有潜力作为poly-JIA诊断和相似疾病鉴别诊断的阈值。因本研究样本量有限，仍有待进一步扩大样本量加以证实。
本结果显示，poly-JIA患儿外周血中miR-766的表达水平与Hb水平呈显著正相关，与关节炎疾病活动度评分DAS28呈负相关。poly-JIA除了特征性关节损伤外，还会导致多种组织系统受累，如贫血、血小板异常等血液学改变[14]。有研究表明，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者体内的特殊环境和细胞因子异常表达会影响Hb的生成，且Hb水平与RA的活动度有一定相关性[15]。DAS28评分是评估关节炎病情活动的综合指标，包括关节肿痛数和实验室指标，能够一定程度反映疾病活动性及评估药物疗效的综合指标[16]。说明miR-766在一定程度上能够反映poly-JIA疾病的活动性。目前大多研究认为，poly-JIA主要为自身抗原诱导的T淋巴细胞性自身免疫性疾病，T淋巴细胞在其发病过程中起重要作用[17,18]。poly-JIA中，Th1和Th2细胞免疫失衡，活化的Th1细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α等增多，引起前炎性细胞因子的产生，参与自身炎症与组织损伤过程[19]。姜丽娇等[20]报道，非全身型JIA患儿外周血中Th1/Th2细胞因子失衡且Th1细胞呈应答优势。Huang等[21]研究发现，JIA外周血Th2细胞减少，Th1/Th2明显升高。本研究发现poly-JIA患儿外周血中miR-766的表达水平与Th1细胞的百分比具有相关性，提示miR-766有可能通过靶向调控T淋巴细胞增殖、分化的基因影响多关节型JIA的发生。通过生物信息学预测分析发现，IL-7是miR-766一个可能的靶基因。IL-7是一种多效细胞因子，在T淋巴细胞的生长、存活及分化方面具有重要作用[22,23,24]。最近有研究发现阻断IL-7受体α能够下调Th1细胞比率，抑制Th1细胞分化和CD4＋T淋巴细胞迁移，从而有效缓解胶原诱导的关节炎[25]。MiR-766是否通过IL-7影响poly-JIA的发生仍需进一步证实。
综上所述，本研究利用qPCR的方法探讨miR-766在poly-JIA患儿血浆中的表达水平及其意义，发现了miR-766的差异表达现象及其具有作为临床诊断poly-JIA的生物标志物的潜力。通过与临床和实验室检查指标的相关性分析，结合生物信息学方法，预测了miR-766参与poly-JIA发生的可能性靶基因，为下一步深入研究其作用机制打下了一定基础。
