探讨不同孕期胎儿肾脏及羊水中水通道蛋白-2(aquaporin－2，AQP-2)的表达规律。
收集引产胎儿肾脏22例，按妊娠时间分为3组：17～23＋6周8例，24～31＋6周8例，32～38＋6周6例。采用Western blot法检测不同孕期肾脏中AQP-2的表达。收集不同妊娠时期羊水24例，按妊娠时间分为3组：17～23＋6周10例，24～31＋6周6例，32～38＋6周8例。收集8例健康成人晨尿作为阳性对照。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测羊水中AQP-2的表达，采用冰点渗透压测定仪检测不同孕期羊水的渗透压。
随胎龄增加，胎儿肾脏中AQP-2的表达水平逐渐增加(17～23＋6周：0.986±0.335，24～31＋6周：1.566±0.272，32～38＋6周：2.080±0.246)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同孕期羊水与肾脏中AQP-2的变化呈正相关(r＝0.985，P<0.05)，且随胎龄增加表达逐渐增加[17～23＋6周：(30.253±5.843) mg/L，24～31＋6周：(35.103±7.271) mg/L，32～38＋6周：(42.580±1.230) mg/L，成人尿液：(46.493±0.450) mg/L]。妊娠不同时期羊水渗透压分别为17～23＋6周(272.600±4.827) mmol/L，24～31＋6周(252.000±15.360) mmol/L，32～38＋6周(261.750±5.560) mmol/L，成人尿液(455.250±4.573) mmol/L，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
胎儿肾脏和羊水中AQP-2的表达呈良好相关性，提示羊水中的AQP-2可反映胎儿肾脏中AQP-2的表达水平。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是存在于动物、植物和微生物体内的一种转运水的通道蛋白，其所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径。迄今为止，在哺乳动物发现的AQPs有13种(AQP-0～12)[1]。肾脏是调节水转运的主要器官，其表达AQPs水平和种类最多，目前发现有8种AQPs在肾脏表达(AQP-1、-2、-3、-4、-6、-7、-8、-11)[1]，其中AQP-2在肾脏浓缩尿液方面发挥重要作用。肾脏相关的多种疾病如肾性尿崩症等均与AQP-2的表达异常有关[2,3,4]。目前已有关于AQP-2在动物(猪及大鼠等)和成人肾脏及尿液中表达规律的研究，并发现AQP-2与肾脏的浓缩功能有关[5,6]。但不同胎龄胎儿肾脏及羊水中AQP-2的变化仍未见完整的报道。每天约有3%的肾脏AQP-2经尿液排出体外，并且尿液中的AQP-2能反映肾脏AQP-2的功能状态，间接反映肾脏的尿液浓缩功能。本研究检测胎儿肾脏和羊水中AQP-2的表达，检测不同胎龄羊水的渗透压，比较不同胎龄胎儿肾脏及羊水中AQP-2的表达变化规律，为胎儿发育时期肾脏浓缩功能的检测提供潜在的生物学指标。
胎儿肾脏收集：收集2013年2月至2017年9月在郑州大学第一附属医院孕母身体健康、由于其他原因(母亲因素：胎膜早破、难免流产、重度子痫等；胎儿因素：发育畸形)而引产的胎儿肾脏标本22例，泌尿系统彩超检查均未发现胎儿肾脏异常。按胎龄分为3组：17～23＋6周8例，24～31＋6周8例，32～38＋6周6例。羊水收集：在产前诊断中心收集2015年10月至2017年9月由于高龄妊娠等原因行羊膜腔穿刺的孕妇羊水(主要集中在17～26＋6周)；在手术室收集剖宫产时的羊水(主要在27～38＋6周)。由于引产，同时收集到了孕38周、29周、27周、26周、25周、23周及20周各1例的羊水和对应胎儿肾脏。所收集羊水对应的胎儿肾脏超声无异常发现。羊水按胎龄分为3组：17～23＋6周10例，24～31＋6周6例，32～38＋6周8例。同时收集8例健康成人[(25.0±2.6)岁]晨尿作为阳性对照。本研究获得医院医学伦理委员会批准(批准号：2013-LW-1202)。
肾脏标本取出后去除肾蒂及肾包膜，用9 g/L盐水冲洗干净后立即放入液氮中保存，后置－80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。肾脏标本的收集均经胎儿监护人知情同意，并签署知情同意书。
羊水及尿液标本收集后立即置冰上，并尽快离心(1 000 r/m离心10 min，离心半径82 mm)，取上清，置－80 ℃冰箱保存，用于后续酶联免疫吸附试验(ELISA)及渗透压检测。羊水标本的收集均经孕妇及其家属的同意，并签署知情同意书。成人尿液收集经本人同意并签署知情同意书。
取出冻存的肾脏标本，置1.5 mL离心管中，加入裂解液，冰上孵育20 min，10 000 g×离心20 min，取上清，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min备用。每个标本蛋白上样量为20 μg进行电泳，100 V转膜1 h。50 g/L脱脂奶粉常温封闭2 h。4 ℃一抗孵育过夜(AQP-2 1300，β-actin 1500)。二抗室温孵育1 h(18 000)。在暗室内用发光液曝光1～3 min。胶片条带经凝胶灰度值分析软件(Image J)分析，以AQP-2条带灰度值除以相应内参条带灰度值作为蛋白的相对表达量。
根据说明书对标准品进行梯度稀释，每个标准品和所测样品设2个复孔，最终结果取其平均值。
用冰点渗透压测定仪检测不同孕期羊水的渗透压。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用
±s表示；正态性检验用K-S检验，多组间比较采用单因素方差分析，各组之间的两两比较采用LSD法，羊水和肾脏中AQP-2的关系采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
17～23＋6周胎儿肾脏AQP-2的表达量为0.986±0.335，24～31＋6周为1.566±0.272，32～38＋6周为2.080±0.246，组间比较差异有统计学意义(F＝19.632，P<0.05)。随胎龄增加，胎儿肾脏中AQP-2的表达量也逐渐增加，组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。
不同孕周的羊水中均可以检测到AQP-2，孕龄17～23＋6周 羊水中AQP-2水平为(30.253±5.843) mg/L，24～31＋6周为(35.103±7.271) mg/L，32～38＋6周为(42.580±1.230) mg/L，成人尿液为(46.493±0.450) mg/L，组间比较差异有统计学意义(F＝14.398，P<0.05)。随着孕周增加，经胎儿尿液中排出的AQP-2量也逐渐增加，在妊娠后期，羊水中AQP-2的水平接近但仍低于健康成人尿液中AQP-2的水平，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
不同孕期羊水中AQP-2的水平与对应孕期胎儿肾脏中AQP-2的表达呈正相关(r＝0.985，P<0.05)。
孕龄17～23＋6周羊水渗透压为(272.600±4.827) mmol/L，24～31＋6周为(252.000±15.360) mmol/L，32～38＋6周为(261.750±5.560) mmol/L，健康成人尿液为(455.250±4.573) mmol/L，组间比较差异有统计学意义(F＝516.792，P<0.05)。组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。
胎儿泌尿系统畸形是常见的先天畸形之一，发生率为0.15%～0.40%，占胎儿各系统畸形的15%～20%[7]。目前主要通过超声等检查手段对胎儿畸形进行筛查。但在一些病理状态下，如病理性肾积水、肾盂输尿管反流和后尿道瓣膜等，不但有形态学改变，肾脏浓缩、稀释功能也会发生变化，目前临床上尚无较好的检测手段对胎儿时期肾脏的浓缩、稀释功能进行评估。而对胎儿肾脏浓缩、稀释功能的评估对临床医师诊断疾病和后续治疗方案的选择有较大的临床价值。本研究发现同孕期肾脏和羊水中AQP-2的水平呈良好的相关性，说明羊水中的AQP-2能够反映肾脏中的AQP-2的水平，间接反映肾脏的浓缩、稀释功能。
AQP-2于1993年首先由Fushimi等[8]克隆出。AQP-2主要在肾脏集合管主细胞表达，大部分AQP-2位于主细胞管腔面细胞膜和该侧细胞膜的囊泡内，少量位于基底侧膜上。在肾脏，AQP-2是受抗利尿激素(arginine vassopressin，AVP)调节的最主要的AQP。2017年Lin等[9]报道AQP-2表达降低会导致肾脏集合管重吸收水异常，产生大量的稀释尿，如遗传性肾性尿崩症或长期服用锂剂等，AQP-2表达量增加，会导致水潴留，如充血性心力衰竭，妊娠等[10,11,12]，这提示AQP-2在肾脏调节机体水平衡的过程中起至关重要的作用。在AQP-2由胞质内的囊泡转移至胞膜的过程中，部分AQP-2可以脱落于小管腔内，随尿液排出体外，有研究发现，随尿液排出的AQP-2的量约占肾脏AQP-2的3%[13,14,15]，说明检测尿液中的AQP-2能够较好的反应肾脏中AQP-2的水平。在动物实验中也发现，尿液中的AQP-2水平与肾脏中AQP-2基因的表达水平具有较好的相关性[16]。但胎儿肾脏AQP-2的表达和尿液浓缩、稀释功能的关系未见研究报道。
人类胎儿后肾在孕4～5周开始发育[17]，9～12周开始产生尿液[18]，至孕中期胎儿尿液成为羊水的主要来源。胎肾产生大量的稀释尿液，以维持羊水量的平衡。有研究发现，尿液中的AQP-2水平与肾脏中AQP-2基因的表达水平具有较好的相关性[15,16]。在人体AQP-2主要存在于肾脏集合管主细胞，说明羊水中检测到的AQP-2主要来自于胎儿肾脏。本研究收集孕17～38周的羊水，并对其中的AQP-2进行检测，结果发现随孕期增加，羊水中的AQP-2也逐渐增多。本研究也收集了对应孕期的胎儿肾脏，结果发现胎儿肾脏中的AQP-2的表达也随孕期的增加而逐渐增加，且与羊水中AQP-2的变化呈正相关，说明羊水中AQP-2在一定程度上能够反映胎儿肾脏中AQP-2的水平。但是妊娠早期中羊水渗透压高于妊娠中后期，可能由于在妊娠早中期，母体血浆是羊水的主要来源，故羊水的渗透压接近于母体血浆，妊娠中后期，胎儿大量的稀释尿成为羊水的主要来源，故羊水渗透压低于妊娠早期。但在妊娠中后期，羊水的渗透压也随胎龄的增加而增加，这可能与胎儿肾脏中的AQP-2表达逐渐增高，胎儿肾脏集合管系统重吸收水的能力增加，从而能够产生部分浓缩尿液有关，但渗透压仍低于成人尿液，约为成人尿液渗透压的1/2。
之前也有较多关于动物和少量关于人类胎儿发育过程中AQP-2变化规律的研究，但均有一定的局限性。1996年Devuyst等[19]对孕8～24周人类胎儿肾脏和成人肾脏中AQP-2进行分析，发现孕12周之前胎儿肾脏中检测不到AQP-2的表达，孕12周时检测到微弱的AQP-2表达，妊娠中期胎儿肾脏中AQP-2的表达水平仅相当于成人水平的34%。胎儿时期AQP-2在肾脏的分布和成人相同，均位于集合管顶端膜。但该研究样本例数较少，并缺乏妊娠中后期的胎儿肾脏标本。之后有研究者对整个孕期及成年大鼠肾脏中AQP-2的变化规律进行研究，发现胎龄15 d的大鼠肾脏中检测不到AQP-2的表达，18 d时有极少量表达，19 d时有中度表达，21 d及出生1 d可以检测到大量AQP-2的表达，AQP-2在大鼠肾脏发育过程中的分布与在人的研究相似，在整个孕期胎鼠与成年鼠肾脏中AQP-2也均位于肾脏集合管主细胞顶端膜[20]。该研究者同时收集了1例出生3 d胎龄27周的早产儿肾脏和1例成人肾组织进行免疫组织化学分析，发现AQP-2的分布也均位于肾脏集合管主细胞。Xing和Nørregaard[5]对猪发育过程中AQP-2的表达规律进行分析，发现在妊娠60 d和80 d时，胎猪肾脏中仅能检测到微弱的AQP-2的表达，在妊娠100 d时，AQP-2表达增强，但仍弱于成年猪肾脏AQP-2的表达。胎儿时期猪肾脏AQP-2的分布与成年猪相似，也位于肾脏集合管主细胞顶端膜。这说明不同物种在胚胎发育过程中随胎龄的增加胎儿肾脏中AQP-2的表达逐渐增加，并且AQP-2较稳定的分布于肾脏集合管主细胞。胎儿时期肾脏中AQP-2的变化规律与本研究结果相似。羊水中AQP-2的研究较少，曾有研究者报道在足月妊娠的羊水中未检测到AQP-2[21]，本课题组考虑与其检测手段或标本质量有关。
目前随着临床产前诊断的开展，有越来越多的孕妇行羊膜腔穿刺抽取羊水对胎儿进行相关检查。妊娠中后期羊水作为胎儿尿液的主要来源，抽取羊水，并对其中的AQP-2进行分析，可以较好地反映胎儿的肾脏浓缩稀释功能。结合超声检查，羊水中AQP-2的检测有望成为产前诊断胎儿肾脏疾病尤其是肾积水等梗阻性肾病的一个生物标志物。
本研究也有不足之处，如收集到的引产的胎儿肾脏和收集到的羊水并不全是一一对应的，考虑到同孕期的正常胎儿羊水差异不大，即使收集到的肾脏和羊水之间不全是一一对应，同孕期羊水中AQP-2也能反映对应孕期的胎儿肾脏中AQP-2的表达水平。本研究探讨胎儿肾脏及羊水中AQP-2的变化规律，尚不能完全证明其与胎儿肾脏浓缩功能的关系，将来需要对该课题作进一步研究，争取收集更多的引产胎儿肾脏和对应羊水，并对其AQP进行检测分析，为临床产前诊断胎儿肾脏疾病提供参考。
