通过对一疑似Blau综合征(BS)的中国家系进行NOD2基因分析，研究中国患者的基因突变类型和临床特点。
研究对象为疑似BS患儿及其家属，共9例。其中男4例，女5例。患儿及其父母进行Sanger测序和医学外显子测序，其余人员仅进行Sanger测序；对于新发现错义突变，在线预测其致病性；结合基因型与BS患者的临床资料，为BS的诊断提供临床依据。
1．序列分析结果显示，先证者NOD2基因4号外显子的2处位点同时发生错义突变，一处为已知突变：c.2006A>G，p.H669R，另一处为新发突变：c.1981G>C，p.A661P。2.经家系验证分析，先证者之父和祖母在这2个位点具有同样的杂合变异，先证者之母和祖父该位点无变异。3.先证者具有皮疹、虹膜睫状体炎和关节炎三联征症状，无发热，C反应蛋白(CRP)正常。
家系中NOD2基因A661P和H669R双突变引起BS，突变由祖母经父亲传递给先证者；A661P是个新发现的突变位点；先证者无反复发热，CRP不升高，该临床表现有可能作为本病区分于其他自发炎症性疾病的鉴别标准。
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Blau综合征(BS)(MIM no.#186580)是一种少见的单基因常染色体显性遗传病，以家族形式发病，主要引起关节、眼葡萄膜和皮肤发生肉芽肿样改变。该病起病早，在婴儿或儿童期就开始出现上诉的典型症状。近年研究发现在2/3的患者中还可出现骨发育不良等不典型的临床症状[1]。BS的致病基因是位于16号染色体的NOD2基因，目前已报道的致病突变均位于该基因的第4号外显子上，R334W和R334Q是最常见的突变热点，占60%～80%。NOD2发生突变时，可造成核因子(NF)-κB持续活化，引起前炎性因子大量释放。NOD2突变不仅可以引起BS，还与Crohn病和YAO综合征(NAID)的发病有关。与BS不同，Crohn病的致病突变散布在NOD2基因的各个外显子上，多发生在1007fs，G908R和R702W，而NAID的突变主要发生在IVS8＋158、R702W和R703C。因此，在诊断这些风湿病时，除了结合典型的临床症状，还要进行分子遗传学的检测来确诊。BS在亚洲人群中非常少见，尤其是中国人群[2]。本研究通过对一疑似BS的家系进行NOD2基因分析以确诊该病，并总结该病的临床表现，以期寻找区分BS的临床指征。
选择江西省儿童医院就诊的疑似BS患儿及其家属为研究对象，共9例。其中男4例，女5例；年龄5～68岁，无近亲结婚记录。该项研究得到江西省儿童医院医学伦理委员会批准(批准文号：JXSETYY-YXLW-2018001)，并取得了患者及监护人的知情同意。
从患儿及其家系成员的外周静脉抗凝血中提取基因组，PCR扩增NOD2基因4号外显子(表1)，扩增产物经切胶回收，送上海生工进行Sanger测序。患儿及其父母的另一份外周血样品直接送北京迈基诺医学检验所进行医学外显子检测(高通量测序)。
NOD2基因4号外显子PCR扩增引物
Amplification primers for NOD2 gene exon 4
NOD2基因4号外显子PCR扩增引物
Amplification primers for NOD2 gene exon 4
| 引物名称 | 方向 | 碱基序列(5′－3′) | 长度 | 扩增片段大小(bp) |
|---|---|---|---|---|
| Exon4a | F | CTGGCTCTCCTATCCCTTCA | 20 | 555 |
| R | TGTCTTCTTGACCAACATCAG | 21 | ||
| Exon4b | F | TCTCTTTGTCTTCCCATTCAG | 21 | 462 |
| R | AGGGCTGAGGTCTCTTGGA | 19 | ||
| Exon4c | F | GCTTCTCTGAACAGGGCATC | 20 | 689 |
| R | TGCTGTGATCTGAAGGTTGTG | 21 | ||
| Exon4d | F | AGGTGTCGTGCCAGGGAGTA | 20 | 755 |
| R | CACACTTAGCCTTGATGGTG | 20 |
结合患者的临床表现、实验室检查及影像学检查结果，总结BS的临床特征。
对于新发现的错义突变，通过Polyphen2、SIFT和Clinvar在线推测其致病性；通过多物种NOD2蛋白同源序列比对和突变蛋白的空间构象预测，分析NOD2突变蛋白的功能变化。
先证者(Ⅳ-2，图1)，男，5岁1个月，1年前无明显诱因出现踝关节、膝关节及双侧腕关节肿胀，外院诊断有虹膜睫状体炎。患儿姐姐(Ⅳ-1，图1)有类似病史，已逝。患儿父亲(Ⅲ-2，图1)在7岁左右出现关节炎、白内障，曾进行手术治疗。患儿的姑姑6岁时出现此症状，12岁时双目失明，13岁死于风湿性心脏病。患儿祖母(Ⅱ-2，图1)有类风湿关节炎病史，双目失明已有15年。其他家庭成员(Ⅱ-3，Ⅲ-6，图1)自述关节有类似的关节炎表现，Ⅲ-6因类风湿性关节炎而造成肢体终身残疾。
注：箭头表示先证者，星号表示经过分子遗传学检测的个体，实心表示有临床症状的个体。罗马数字代表代数，阿拉伯数字代表个体 The asterisks indicate the individuals who had undergone genetic analysis.The filled squares and circles indicate the individuals who displayed similar clinical performance.The roman numerals represent the generations，and the arabic numbers represent each generation of individuals.Arrow indicates the proband
查体：双侧踝关节囊肿样肿胀，无明显触痛，有波动感。无明显发热，左臂皮肤有苔癣样皮疹，右侧眼球结膜充血(图2)。实验室检查：C反应蛋白(CRP) 2.9 mg/L(正常值≤10 mg/L)；红细胞沉降率(ESR)20 mm/1 h(正常值0～15 mm/1 h)；免疫球蛋白IgE 0.5×103 IU/L(正常值≤0.11×103 IU/L)；免疫球蛋白IgM 1.09 g/L(正常值0.6～2.5 g/L)；免疫球蛋白IgG 9.75 g/L(正常值7.0～17.0 g/L)；免疫球蛋白IgA 2.10 g/L(正常值0.7～3.8 g/L)。肺部CT显示两肺纹理稍紊乱，关节彩超及MRI提示双侧膝关节及左侧踝关节积液(图3)。
注：A：右眼球结膜充血；B：臂部陈旧皮疹；C：右踝关节肿胀 A：the right eye revealed conjunctival congestion；B：papules on the upper limb；C：boggy swelling of the right ankle joint
注：A、B：磁共振成像结果显示右踝关节周围软组织内囊性病变(箭头示)；C：彩超结果显示右膝关节髌上囊积液，囊壁毛糙增厚 A，B：soft tissue cystic lesions of magnetic resonance imaging scan of the right ankle joint(marked by white arrow)；C：ultrasonography of the right knee showed effusion and synovial thickening
经过对NOD2基因的第4外显子测序，先证者及其父亲和祖母发现2个杂合的错义突变(图4)，分别为c.1981G>C，p.A661P和c.2006A>G，p.H669A。其余家庭成员在该基因位点未检测出突变，提示致病基因由祖母(Ⅱ-2)经父亲(Ⅲ-2)传递给先证者(Ⅳ-2)。p.H669A突变曾在2014年报道过，具有潜在致病性[3]，人群频率数据库没有收录该位点。p.A661P为新发现突变，在人类基因突变数据库(HGMD)中尚未检索到(截止到2017年9月)，根据ExAC数据库和gnomAD数据库的查询结果，该位点不属于SNP位点，人群中发生频率是0.000 065 41，Clinvar、SIFT和PolyPhen软件分析结果提示A661P病理意义不明。
p．H669A和p.A661P位于Blau综合征致病结构域NBD上，同源序列比对的结果证实661和669位点的氨基酸在多个物种中非常保守，提示其存在着重要功能(图5)。三维建模的结果提示双突变引起NOD2氢键数目的增加，影响了蛋白的空间构象(图6)。
注：A：野生型；B：突变型；绿色虚线表示氢键，连接2个氨基酸，粉色虚线代表新形成的氢键(白色箭头所示) A：wild type；B：mutant type；The green dotted line represents the hydrogen bond and the pink dotted line represents the newly formed hydrogen bond (white arrow indicated)
外显子测序结果显示患儿及其父母还存在着其他可疑变异，如与骨骼发育相关的ACAN基因(母源，c.6809G>A，p.R2270H)，与系统性红斑狼疮相关的ITGAM基因(父源，C.1234T>G，p.L412V)以及与自身炎症性疾病相关的NLRC4基因(父源，c.3053C>G，p.A1018G)。除ITGAM遗传方式不明外，ACAN和NLRC4均为显性遗传，这些位点发生杂合突变是否会引起相应的临床症状，尚不明确。
BS属于由单基因突变引起的自身炎症性疾病，以皮疹、肉芽肿性关节炎和眼部病变为典型症状，但临床观察的结果提示BS的临床表现具有明显的个体差异性，具体表现在三联征不一定会同时出现，患者还会出现一些不典型的临床症状，如中枢神经系统脱髓鞘病变、主动脉窦瘤、肝脏肉芽肿等，甚至在同一家系中，患者病情的严重程度也不一致。在一些特殊的病例中，还可能混杂着BS和NAID 2种疾病的表型[4]。因此，BS的诊断除了考虑临床症状和病理诊断，还要结合BS的分子遗传学特征，以区别于其他自身炎症性疾病和感染性疾病。
BS是常染色体显性遗传病，由NOD2基因的第4号外显子即NOD2蛋白的NBD结构域发生突变引起。本研究家系的突变位点即位于该区域范围内。根据2015年美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的序列变异的解释标准指南，669位点和661位点可能致病[5]。一般认为NBD突变是一种功能获得性突变，突变导致NBD分子持续寡聚化，激活了NF-κB通路，引起前炎性因子释放。与之前报道的BS患者只有单个位点突变不同，本研究发现了2个突变位点p.A661P和p.H669R同时存在于一个患者中，并在家系中延续，这2个共存的突变位点具有什么样的临床意义，尚不知晓。
先证者出现多关节的多发性囊肿和关节积液，有虹膜睫状体炎和皮疹，ESR升高，CRP正常，自身抗体正常，不伴有发热，符合BS的诊断标准。先证者的父亲出现关节和眼部病变，而先证者的祖母已经失明，先证者的姐姐及姑姑有类似病史，已经死于相关疾病，可能是因为脏器病变导致，证实了BS临床表现的差异性，仅根据临床症状诊断极其困难，NOD2基因分析是确诊的有效手段。
BS尚无特异的治疗药物，一般常规用糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等对症治疗。沿关节周围的多发性囊肿是BS的典型表现，手术切除囊肿效果不佳，可用甲氨蝶呤缓解关节情况，出现眼部症状的可尝试用环孢素[1,6]。近年来，英夫利昔(肿瘤坏死因子α拮抗剂)广泛用于BS治疗中，但长期疗效及对眼部症状的缓解作用并不明确。尽管经过系统的治疗，大部分患者的病情仍持续加重，出现手弯曲挛缩和/或视力丧失等情况。BS患者通常不伴有CRP的升高，多数不伴发热，可以借此与幼年特发性关节炎鉴别诊断。
