Inhibitory effects of Allicin on apoptosis injury in hippocampus of young rats with lead poisoning

Hu Shuang; Gao Zhenyan; Ying Xiaolan; Zhou Cancan; Yan Chonghuai; Liu Jianwen

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2018.21.012

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• 实验研究 •

大蒜素对幼年铅中毒大鼠海马细胞凋亡损伤的抑制作用

中华实用儿科临床杂志, 2018,33(21) : 1652-1656. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2018.21.012

摘要

目的

探讨大蒜素对铅中毒大鼠海马细胞凋亡损伤的抑制作用。

方法

60只雄性3周龄SD大鼠按随机数字表法分成6组，每组10只，分别为低剂量(A－L)、中剂量(A－M)和高剂量(A－H)大蒜素组，铅暴露(Pb)组，二巯基丁二酸(DMSA)组和空白对照组。空白对照组提供超纯水，其余5组饮用1.0 g/L的醋酸铅水溶液，20 d后换为超纯水并进行灌胃给药，A－L组、A－M组和A－H组大蒜素用药剂量分别为2.7 mg/kg、5.4 mg/kg、10.8 mg/kg，DMSA剂量为10.8 mg/kg，Pb组予9 g/L盐水。模型建立后处死大鼠收集全血和海马组织。检测血铅和海马组织铅浓度，采用TUNEL染色法检测海马组织细胞凋亡水平，实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶－3(caspase－3)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶－9(caspase－9)和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)的mRNA和激活型蛋白表达量，采用免疫荧光技术检测细胞色素C在胞质内的表达情况。

结果

1．A－L组、A－M组和A－H组大鼠血铅和海马组织铅水平[(190.54±11.33) μg/L，(0.28±0.03) μg/L；(159.55±16.94) μg/L，(0.22±0.06) μg/L；(116.62±8.85) μg/L，(0.19±0.01) μg/L]显著低于Pb组[( 271.34±21.23) μg/L，(0.31±0.04) μg/L]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；DMSA组大鼠血铅和海马组织铅水平[(50.12±7.44) μg/L，(0.15±0.03) μg/L]低于A－L组、A－M组和A－H组。2.TUNEL染色结果显示，A－L组、A－M组和A－H组大鼠海马细胞凋亡水平显著低于Pb组[(2.81±0.17)%, (2.08±0.28)%，(1.33±0.08)%比(4.23±0.17)%]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；DMSA组大鼠海马细胞凋亡水平[(2.63±0.32)%]高于A－M组和A－H组，低于Pb组。3.qPCR结果表明，与Pb组比较，A－H组caspase－3、caspase－9和PARP的mRNA均显著下调(1.07±0.05，1.02±0.02，1.11±0.02比1.34±0.02，1.26±0.05，1.93±0.07)，差异均有统计学意义(均P<0.05)；A－L组、A－M组caspase－3和PARP mRNA表达量下调(1.21±0.05，1.43±0.12、1.16±0.02，1.20±0.06比1.34±0.02，1.93±0.07)，差异均有统计学意义(均P<0.05)，caspase－9 mRNA无明显变化；A－H组caspase－3、caspase－9和PARP的mRNA水平(1.07±0.05，1.02±0.02，1.11±0.02)均低于DMSA组(1.14±0.02，1.15±0.08，1.32±0.05)。4.Wes－tern blot结果：与Pb组比较，A－H组激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达量显著下调(A－H组：0.44±0.15、0.58±0.25、0.31±0.19和0.23±0.07比Pb组：0.69±0.13、0.72±0.22、0.55±0.21和0.43±0.10)，A－M组激活型caspase－9蛋白表达量低于Pb组(A－M组：0.59±0.18比Pb组：0.72±0.22)，差异均有统计学意义(均P<0.05); A－H组激活型caspase－3和RARP蛋白表达低于DMSA组。5.荧光染色结果显示A－L组、A－M组和A－H组细胞色素C在胞质中的表达量均显著低于Pb组及DMSA组。

结论

大蒜素在降低SD大鼠海马组织铅的同时，可通过线粒体通路抑制铅中毒大鼠海马组织细胞凋亡，大蒜素抑制凋亡损伤的作用可能优于DMSA。

引用本文: 胡爽, 郜振彦, 应晓兰, 等. 大蒜素对幼年铅中毒大鼠海马细胞凋亡损伤的抑制作用 [J] . 中华实用儿科临床杂志,2018,33 (21): 1652-1656. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2018.21.012

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铅是一种常见的有毒重金属，进入机体后对心血管、肝、肾、神经、骨骼等多器官系统造成损伤，儿童中枢神经系统对铅毒性尤为敏感^[1]。铅毒性的形成机制主要为氧化应激、与Ca^2＋竞争受体和细胞凋亡等方式^[2]。临床上治疗铅中毒的常用螯合剂主要是依地酸二钠钙(CaNa₂EDTA)和二巯基丁二酸(DMSA)，CaNa₂EDTA和DMSA能在短时间内降低机体铅负荷^[3]，但长期使用不良反应较重，且对铅毒性损伤的修复作用不明确。近年来很多中药单体已被证实具有螯合重金属作用，如葛根素、槲皮素、姜黄素、大蒜素等。研究显示，大蒜素能降低小鼠和山羊的血铅、组织铅水平^[4,5]，关于大蒜素是否能在驱铅的同时抑制铅中毒引发的组织损伤研究还未见报道。另有体内外研究表明，大蒜素对多种疾病引发的细胞凋亡产生抑制作用^[6]。因此，本研究以醋酸铅水溶液喂养大鼠建立铅暴露模型，通过对细胞凋亡水平和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族相关蛋白的表达进行检测，研究大蒜素对铅中毒大鼠海马细胞凋亡损伤的抑制作用。

1　材料与方法

1.1　动物分组和处理

3周龄雄性SD大鼠60只，由上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心提供[许可证号：SYXK(沪)2013－0106]，按随机数字表法选10只为空白对照组，予超纯水；另50只予1.0 g/L的醋酸铅水溶液20 d，第21天换回超纯水，同时将铅中毒大鼠按随机数字表法分为5组：低剂量(A－L)、中剂量(A－M)和高剂量(A－H)大蒜素组，DMSA组及铅暴露组(Pb组)，每组10只。A－L组、A－M组和A－H组大蒜素的给药剂量分别为2.7 mg/kg、5.4 mg/kg、10.8 mg/kg，DMSA给药剂量为10.8 mg/kg，Pb组予9 g/L盐水。大蒜素和DMSA均用超纯水制成混悬液，灌胃给药，每天2次，治疗5 d。治疗结束后处死大鼠取全血、全脑和海马组织。

1.2　血铅和海马铅水平测定

使用铂金埃尔默900Z型原子吸光光谱仪(PerkinElmer.美国)检测血铅，取50 μL全血，加2 g/L硝酸和1 g/L曲拉通混合液450 μL，稀释10倍后检测。使用ICP－MS7500(Agilent Technologies Inc.美国)检测海马组织铅水平，取海马组织加入200 μL 680 mL/L的硝酸和100 μL过氧化氢，完全消解后检测，重复检测3次。

1.3　TUNEL染色和免疫荧光染色

剥离全脑行石蜡包埋并切片，进行染色。采用罗氏公司试剂盒进行TUNEL染色法检测细胞凋亡，操作严格按照说明书进行。染色后切片于倒置荧光显微镜下观察，荧光检测实验条件：FITC绿光激发波长465～495 nm，发射波长515～555 nm。细胞凋亡为阳性时细胞核呈绿色。免疫荧光染色按说明书进行，染色后切片置于荧光显微镜下观察，目标蛋白呈荧光素标记的红色。

1.4　caspase酶活性检测

使用凋亡相关酶活性检测试剂盒进行。提取大鼠海马组织总蛋白，测定蛋白浓度按照试剂盒步骤配制反应体系，孵育后测定A₄₀₅吸光度值，计算样品催化生成的pNA量。酶活力单位＝pNA量/样品中蛋白总质量。

1.5　Western blot法检测活化的caspase家族相关蛋白和作用底物聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)的蛋白表达

提取海马组织总蛋白，考马斯亮蓝染色法测定组织蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(1∶1 000), 4 ℃摇床孵育3 h，加入荧光标记羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，置电泳图像分析仪中观察蛋白表达情况。

1.6　实时荧光定量PCR(qPCR)法检测caspase家族相关因子和PARP的mRNA表达

采用Trizol法提取总RNA。采用TaKaRa试剂盒进行RNA反转录，生成cDNA作为qPCR检测的模板，并以特异性引物进行qPCR，引物序列见表1。qPCR采用两步法反应程序：预变性：95 ℃ 30 s，循环1次；PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循环40次。反应结束后采集数据，使用2^－ΔΔct方法处理数据。

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表1

实时荧光定量PCR引物序列

Table 1

Primer sequences of real－time PCR

表1

实时荧光定量PCR引物序列

Table 1

Primer sequences of real－time PCR

引物名称	上游引物(5′－3′)	下游引物(5′－3′)
β－actin	TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG	GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG
caspase－3	ACAGAGCTGGACTGCGGTATT	TACAGTTTCAGCATGGCGCAA
caspase－9	TGGATGCTCTGTGTCCATCGA	TCCTGGTATGGGACAGCATCT
PARP	CACAGAATCCCAGCCGAAAGG	GCTTCGTCCTTGTTCTGGGAG

注：caspase：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶；PARP：聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶　Caspase：cysteine－containing aspartate－specific proteases; PARP：poly adenosine diphosphute－ribose polymerase

1.7　统计学处理

采用GraphPad prism 5软件进行数据处理，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　大蒜素对大鼠血铅和海马组织铅水平的影响

与Pb组相比，A－L组、A－M组和A－H组血铅和海马组织铅水平显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，随着大蒜素给药剂量的增加，血铅和海马组织铅水平递减；A－H组血铅和海马组织铅水平高于DMSA组，结果见表2。

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表2

大鼠血铅和海马组织铅水平比较　(±s)

Table 2

Comparison of lead levels in blood and hippocampus of rats　(±s)

表2

大鼠血铅和海马组织铅水平比较　(±s)

Table 2

Comparison of lead levels in blood and hippocampus of rats　(±s)

组别	血铅(μg/L)	海马组织铅(μg/g)
空白对照组	14.22±5.19^a	0.04±0.01^a
A－L组	190.54±11.33^b	0.28±0.03^c
A－M组	159.55±16.94^a	0.22±0.06^c
A－H组	116.62±8.85^a	0.19±0.01^c
Pb组	271.34±21.23	0.31±0.04
DMSA组	50.12±7.44^a	0.15±0.03^a
F值	75.53	20.02
P值	<0.05	<0.05

注：A－L组：低剂量大蒜素组；A－M组：中剂量大蒜素组；A－H组：高剂量大蒜素组；Pb组：铅暴露组；DMSA组：二巯基丁二酸组；与Pb组比较，^aP<0.001，^bP<0.01，^cP<0.05　A－L group: low－dose Allicin group；A－M group：medium－dose Allicin group；A－H group：high－dose Allicin group；Pb group：lead exposure group；DMSA group: dimercaptosuccinic acid group；compared with Pb group，^aP<0.001，^bP<0.01，^cP<0.05

2.2　大蒜素对大鼠海马细胞凋亡的抑制作用

与Pb组[(4.23±0.17)%]相比，A－L组、A－M组和A－H组细胞凋亡水平[(2.81±0.17)%，(2.08±0.28)%，(1.33±0.08)%]明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，A－H抑制凋亡作用最显著；A－H组、A－M组细胞凋亡率低于DMSA组[(2.63±0.32)%]，见图1。

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图1

各组大鼠海马组织细胞凋亡水平比较(TUNEL染色，×400)

Figure 1

Apoptosis of rat hippocampal cells after treatment (TUNEL staining，×400)

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注：A：低剂量大蒜素组；B：中剂量大蒜素组；C：高剂量大蒜素组；D：铅暴露组；E：二巯基丁二酸组；F：空白对照组　A：low dose Allicin group；B：medium dose Allicin group；C：high dose Allicin group；D：lead exposure group；E：dimercaptosuccinic acid group；F：control group

图1

各组大鼠海马组织细胞凋亡水平比较(TUNEL染色，×400)

Figure 1

Apoptosis of rat hippocampal cells after treatment (TUNEL staining，×400)

2.3　大鼠海马组织caspase－3、caspase－9和PARP的mRNA表达情况

与Pb组相比，A－L组、A－M组和A－H组caspase－3和PARP mRNA表达量显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；A－H组caspase－9 mRNA表达量低于Pb组，差异有统计学意义(P<0.05)；A－L组、A－M组caspase－9 mRNA表达量与Pb组无明显差异；A－H组caspase－3、caspase－9和PARP mRNA表达量均低于DMSA组，见图2。

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图2

海马组织细胞Capase-3、Caspase-9和PARP mRNA表达情况

Figure 2

The expressions of Capase-3, Caspase-9 and PARP mRNA in hippocampus

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注：Caspase ：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶;PARP：聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶；A-L组：低剂量大蒜素组;A-M:中剂量大蒜素组；A-H组：高剂量大蒜素组；Pb组：铅暴露组；DMSA组：二巯基丁二酸组；RQ：相对定量；与Pb组比较，^aP<0.05, ^bP<0. 01 Caspase:cysteinyl aspartate specific proteinase；PARP:poly adenosine diphosphate-ribose polymerase；A-L group: low-dose allicin group ；A-M group: medium-dose allicin group；A-H group:high-dose allicin group；Pb group: lead exposure group；DMSA group:dimercaptosuccinic acid group；RQ:relative quantification;compared with Pb group, ^aP<0. 05, ^bP<0. 01

图2

海马组织细胞Capase-3、Caspase-9和PARP mRNA表达情况

Figure 2

The expressions of Capase-3, Caspase-9 and PARP mRNA in hippocampus

2.4　各组海马组织细胞激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达情况

与Pb组(0.69±0.13、0.72±0.22、0.55±0.21和0.43±0.10)相比，A－H组激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达量(0.44±0.15、0.58±0.25、0.31±0.19和0.23±0.07)显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；A－M组激活型caspase－9蛋白表达量(0.59±0.18)低于Pb组(0.72±0.22)，差异有统计学意义(P<0.05)，激活型caspase－3和PARP蛋白表达量与Pb组无明显差异；A－L组激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达量与Pb组无明显差异；A－H组激活型caspase－3和PARP蛋白表达量(0.44±0.15、0.31±0.19和0.23±0.07)低于DMSA组(0.48±0.20、0.40±0.08和0.33±0.09)，激活型caspase－9蛋白表达量高于DMSA组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3。

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图3

Western blot检测大鼠海马组织细胞激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达情况

Figure 3

Western blot analysis of expression of cleaved－caspase 3，cleaved－caspase 9 and cleaved－PARP proteins in rat hippocampus

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注：caspase：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶；PARP：聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶；A－L组：低剂量大蒜素组；A－M组：中剂量大蒜素组；A－H组：高剂量大蒜素组；Pb组：铅暴露组；DMSA组：二巯基丁二酸组　caspase：cysteine－containing aspartate－specific proteases; PARP：poly ade－nosine diphosphate－ribose polymerase；A－L group：low－dose Allicin group；A－M group：medium－dose Allicin group；A－H group：high－dose Allicin group；Pb group：lead exposure group；DMSA group：dimercaptosuccinic acid group

图3

Western blot检测大鼠海马组织细胞激活型caspase－3、caspase－9和PARP蛋白表达情况

Figure 3

Western blot analysis of expression of cleaved－caspase 3，cleaved－caspase 9 and cleaved－PARP proteins in rat hippocampus

2.5　各组海马组织细胞质中细胞色素C的表达情况

空白对照组细胞色素C主要分布于线粒体内膜间隙，荧光染色为点状分布，且染色效果不明显；Pb组细胞色素C从线粒体内膜释放至胞质中，荧光染色呈弥散行分布且亮度明显；与Pb组比较，A－L组、A－M组和A－H组细胞色素C在胞质中的分布显著降低，A－H组与Pb组差异更为明显；A－H组细胞色素C在胞质中的分布量低于DMSA组，见图4。

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图4

大鼠海马组织中细胞色素C在胞质中表达情况(免疫荧光染色，×400)

Figure 4

Expression of cytochrome C in cytoplasm of rat hippocampus (fluorescence staining，×400)

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图4

大鼠海马组织中细胞色素C在胞质中表达情况(免疫荧光染色，×400)

Figure 4

Expression of cytochrome C in cytoplasm of rat hippocampus (fluorescence staining，×400)

3　讨论

中枢神经系统是铅毒性作用的主要靶器官之一，儿童发育未健全的血脑屏障对铅具有较高的通透性，随年龄的增长，通透性会有所下降^[7]。本研究采用3周龄SD大鼠旨在模拟人类的儿童期。研究显示，铅暴露可间接或直接干扰相关凋亡基因的表达和调控，引发神经细胞凋亡^[8]。细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定而自发的程序性死亡过程，此过程中涉及一系列基因的调控作用^[9]。细胞接受外刺激后，凋亡启动子接收信号并转变为激活状态即可诱导后续凋亡程序，最终启动凋亡执行因子，caspase－3、caspase－9为线粒体途径中的凋亡启动子^[10,11]。

细胞色素C是细胞呼吸链中的一个重要组成部分，当其释放到胞质中时是重要的凋亡因子^[12]。当凋亡刺激被细胞接收后，细胞色素C从线粒体内膜间隙释放回胞质中，释放到胞中的细胞色素C能启动caspase－9^[13]。PARP是caspase酶的切割底物，在体内是cspase－3的主要切割对象^[14]，被切割的PARP会失去稳定细胞和支持细胞活性的作用，加速细胞的损伤病变，在细胞凋亡中发挥重要作用^[15]。

基于目前临床铅中毒治疗对新型药物的迫切需求和大蒜素极具优势的药理性质，本研究将大蒜素应用于抑制铅诱导的海马细胞凋亡损伤，结果发现经大蒜素治疗后，大鼠海马细胞凋亡水平降低，caspase－3、caspase－9、PARP的mRNA和蛋白表达水平均明显下调，即线粒体途径中的凋亡启动子、执行因子以及切割底物的活化态表达量均得到负性调控。同时本研究通过对细胞色素C表达情况分析发现，细胞色素C在胞质中的表达量随大蒜素剂量的增加而显著降低。因此推测，大蒜素能有效抑制铅暴露诱导的海马细胞凋亡，且可能是通过线粒体途径。

本研究设置了DMSA治疗组，将同等剂量的大蒜素组和DMSA组比较分析，发现大蒜素组的海马组织铅水平高于DMSA组，推测大蒜素的降铅效果弱于DMSA，但大蒜素组海马细胞凋亡的抑制程度显著优于DMSA组，同时大蒜素对caspase－3、caspase－9和PARP的下调作用也优于DMSA。因此推测，大蒜素对铅中毒诱导的细胞凋亡可能具有不依赖铅负荷变化的抑制作用。

细胞凋亡涉及的途径错综复杂，本研究探讨铅中毒诱导海马细胞凋亡更深层的毒理机制，并了解大蒜素是否具有更广泛的调控作用具有重要的意义。本课题组后续研究将进一步围绕铅中毒诱导海马细胞凋亡损伤和药物治疗，并逐步注重铅中毒诱导的其他病变以及大蒜素对这些病变的修复作用，从多层面多角度展开实验和分析，以期为大蒜素在铅中毒临床治疗中可能存在的利用价值提供科学的依据。

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贡献者信息

胡爽

200237　上海，华东理工大学药学院

郜振彦

200092　上海交通大学医学院附属新华医院环境与儿童健康重点实验室

应晓兰

200092　上海交通大学医学院附属新华医院环境与儿童健康重点实验室

周灿灿

200092　上海交通大学医学院附属新华医院环境与儿童健康重点实验室

颜崇淮

200092　上海交通大学医学院附属新华医院环境与儿童健康重点实验室

刘建文

200237　上海，华东理工大学药学院

通信作者

刘建文

200237　上海，华东理工大学药学院

Email：liujian@ecust.edu.cn

关键词

大蒜素; 铅中毒; 海马细胞凋亡; 线粒体凋亡通路; 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族;

基金项目

国家重点基础研究发展计划（2012CB525001）

历史

出版日期：2018-11-05

收稿日期：2018-04-03

本文编辑

廉珍珍

Experimental Studies

Inhibitory effects of Allicin on apoptosis injury in hippocampus of young rats with lead poisoning

Hu Shuang, Gao Zhenyan, Ying Xiaolan, Zhou Cancan, Yan Chonghuai, Liu Jianwen

Published 2018-11-05

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2018,33(21): 1652-1656. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2018.21.012

Abstract

Objective

To investigate the inhibitory effect of Allicin on the apoptosis of hippocampal neurons induced by lead in rats.

Methods

Sixty male Sprague-Dawley rats aged 3 weeks were randomly divided into 6 groups, 10 rats in each group, which were low dose group(A-L), medium-dose group(A-M) and high dose (A-H) Allicin group and lead exposure group(Pb group), dimercaptosuccinic acid (DMSA) group and blank control group.The blank control group animals were treated with ultrapure water, and the other 5 groups received 1.0 g/L lead acetate aqueous solution instead of ultrapure water after 20 days and they were treated them with compounds by oral gavage.The doses of Allicin in group A-L, A-M group and A-H group were 2.7 mg/kg and 5.4 mg/kg, and 10.8 mg/kg, respectively.The DMSA dose was 10.8 mg/kg, and the Pb group was given 9 g/L saline.After the model was established, the rats were sacrificed to collect whole blood and hippocampus.Blood lead and tissue lead concentrations were measured, and the level of apoptosis in hippocampus was observed by TUNEL staining.The levels of cysteine-containing aspartate-specific proteases(caspase)-3, caspase-9, poly adenosine diphosphate-ribose polymerase (PARP) mRNA and caspase-3, caspase-9, PARP activated protein and cytochromes C distribution in the hippocampus cells were detected by using real-time quantitative PCR (qPCR), Western blot, and immunofluorescence staining.

Results

(1)Lead levels in the blood lead and hippocampus of rats in A-L group, A-M group and A-H group [(190.54±11.33) μg/L, (0.28±0.03) μg/L; (159.55±16.94) μg/L, (0.22±0.06) μg/L; (116.62±8.85) μg/L, (0.19±0.01) μg/L] were lower than those in Pb group [(271.34±21.23) μg/L, (0.31±0.04) μg/L], and there were significant differences (all P<0.05). The blood lead and hippocampal lead levels in the DMSA group [(50.12±7.44) μg/L, (0.15±0.03) μg/L] were lower than those in the A-L group, A-M group and A-H group.(2) The results of TUNEL staining showed that the apoptosis levels of hippocampus in A-L group, A-M group and A-H group were lower than that in Pb group [(2.81±0.17)%, (2.08±0.28)%, (1.33±0.08)% vs. (4.23±0.17)%], and there were significant differences (all P<0.05); the apoptosis level of hippocampus in the DMSA group [(2.63±0.32)%] was higher than that in the A-M group and the A-H group, which was lower than that in the Pb group.(3) qPCR results showed that the levels of caspase-3, caspase-9 and PARP mRNA in A-H group were down-regulated compared with Pb group (1.07±0.05, 1.02±0.02, 1.11±0.02 vs.1.34±0.02, 1.26±0.05, 1.93±0.07). The differences were statistically significant (P<0.05). The expression levels of caspase-3 and PARP mRNA in A-L group and A-M group were down-regulated (1.21±0.05, 1.43±0.12, 1.16±0.02, 1.20±0.06 vs.1.34±0.02, 1.93±0.07), and there were significant differences (all P<0.05), and there was no significant change in caspase-9 mRNA; the mRNA levels of caspase-3, caspase-9 and PARP in A-H group (1.07±0.05, 1.02±0.02, 1.11±0.02) were lower than those in DMSA group (1.14±0.02, 1.15±0.08, 1.32±0.05). (4) Western blot results: compared with Pb group, the expression levels of activated caspase-3, caspase-9 and PARP protein in A-H group were down-regulated (A-H group: 0.44±0.15, 0.58±0.25 and 0.31±0.19, 0.23±0.07 vs. Pb group: 0.69±0.13, 0.72±0.22 and 0.55±0.21, 0.43±0.10), the expression of activated caspase-9 protein in A-M group was lower than that in Pb group (A-M group: 0.59±0.18 vs. Pb group: 0.72±0.22), and there were significant differences (all P<0.05); the expression of activated caspase-3 and RARP protein in A-H group was lower than that in DMSA group.(5) Fluorescence staining showed that the expression of cytochrome C in cytoplasm of A-L group, A-M group and A-H group were significantly lower than that of Pb group and DMSA group.

Conclusion

Allicin can inhibit the apoptosis of hippocampus cells in rats with lead poisoning through mitochondrial pathway.The effect of Allicin on apoptosis inhibition may be better than DMSA.

Key words:

Allicin; Lead poisoning; Apoptosis; Mitochondrial pathway; Cysteine-containing aspartate-specific proteases family

Contributor Information

Hu Shuang

School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Gao Zhenyan

MOE-Shanghai Key Laboratory of Children′s Environmental Health, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Ying Xiaolan

MOE-Shanghai Key Laboratory of Children′s Environmental Health, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Zhou Cancan

MOE-Shanghai Key Laboratory of Children′s Environmental Health, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Yan Chonghuai

MOE-Shanghai Key Laboratory of Children′s Environmental Health, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Liu Jianwen

School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

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