分析经SLC26A3基因分析确诊的先天性失氯性腹泻(CLD)患儿的临床及遗传学特征。
回顾性分析2016年12月北京大学第一医院儿科诊治的1例CLD患儿的临床资料，采用Sanger测序进行致病基因分析，并进行文献复习。
患儿，女，因母亲孕期羊水过多经剖宫产出生，于出生10 d出现顽固性腹泻，止泻治疗后缓解不显著，1岁时因"体质量不增伴腹泻1年"就诊于北京大学第一医院儿科，血生化检查示低氯性代谢性碱中毒、低钾血症、低钠血症、高钙血症，符合CLD。SLC26A3基因分析发现c.358G>A(p.G120S)及c.634G>T(p.G212C)复合杂合突变，其中c.634G>T(p.G212C)为未报道的新突变。患儿经氯补充治疗、合理饮水后，电解质紊乱及生长发育情况改善，且患儿腹泻随年龄增长逐渐缓解。经文献复习，c.1631T>A(p.I544N)突变在已报道的中国CLD患儿中占4/14等位基因，故该突变在中国人群中较为常见。
新生儿期出现顽固性腹泻、低氯性代谢性碱中毒及多种电解质紊乱要考虑CLD的可能，SLC26A3基因分析有助于确诊。
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先天性失氯性腹泻(CLD，OMIM# 214700)，是一种罕见的常染色体隐性遗传病，以顽固性腹泻、低氯血症、低钠血症、低钾血症和代谢性碱中毒为主要特征。常出现孕妇羊水过多、胎儿肠管扩张和早产，有时可导致孕期胎儿肠梗阻。CLD若不经及时治疗，长期电解质紊乱及代谢性碱中毒可引发多种并发症，如影响患儿生长发育。由于既往报道较少，临床认识不足，常导致该病的误诊及漏诊，如因相似的生化表征被误诊为巴特综合征(Bartter综合征)[1]，或因误认为婴儿期水样便为尿液而漏诊[2]。本研究对经基因诊断明确的1例中国CLD患儿的诊疗经过、SLC26A3基因突变特点进行研究，并结合文献进行分析，以期为该病的诊治提供依据。
患儿，女，3岁，于1岁时主因"体质量不增伴腹泻1年"于2016年12月就诊于北京大学第一医院儿科。患儿父母健康，无亲缘关系，父母家族中无类似家族史。患儿为第1胎，于胎龄37周因母亲羊水过多行剖宫产出生，出生体质量3 000 g，1 min Apgar评分9分，5 min Apgar评分10分。患儿为母乳喂养，于出生10 d出现腹胀、腹泻，排黄绿色水样便，味酸臭，无黏液、脓血，每日腹泻4～8次，无恶心、呕吐，无发热、盗汗，查血生化示低钠低钾低氯性代谢性碱中毒，粪便细菌培养及轮状病毒检查均阴性。于当地医院予补液、止泻、调节肠道菌群等治疗后有所好转，排便3～5次/d，遂出院。于出生1个月再次因"腹胀、腹泻伴发热3 d"入院，查血常规示白细胞计数18.5×109/L，中性粒细胞比例0.56；C反应蛋白18 mg/L；血生化：钾2.8 mmol/L，钠122 mmol/L，氯89 mmol/L，碳酸氢根(HCO3-)36.1 mmol/L，钙2.8 mmol/L；血气pH 7.59；粪便病原学检查阴性；肝肾功能、血脂、血糖、免疫全项等化验无异常。于当地医院予对症治疗后症状好转，血电解质水平好转，但仍排稀便4～6次/d。患儿1岁时身高67 cm，体质量5.9 kg，迁延性腹泻未见好转。入院查体：患儿神志清楚，精神状态可。体温36.5 ℃，呼吸30次/min，脉搏110次/min，血压95/68 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，营养不良貌，消瘦，皮下脂肪少，无水肿，皮肤松弛，弹性差。全身皮肤、黏膜未见黄染、出血点及皮疹。浅表淋巴结未触及肿大，口唇无发绀，甲状腺无肿大。双肺未闻及干湿性啰音。心界不大，心率110次/min，律齐，未及杂音。腹膨隆，肝肋下1 cm，脾肋下未触及，移动性浊音阴性，肠鸣音亢进。脊柱、四肢未见异常。睡眠一般，大便性状同前，小便未见明显异常。血气：血pH值7.52，动脉血二氧化碳分压[pa(CO2)] 26.9 mmHg，HCO3- 38.6 mmol/L，碱剩余(BE)－17.4 mmol/L；血电解质：钠119 mmol/L，钾2.9 mmol/L，氯72.2 mmol/L，钙2.38 mmol/L，血常规、尿常规、粪便常规、肝肾功能、血糖、血脂等未见明显异常，大便培养阴性。
采集3名家庭成员外周静脉血2～3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置4 ℃冰箱备用。使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，离心柱型)提取患儿及父母外周血白细胞DNA。由美国国家生物信息中心(NCBI)网站下载SLC26A3基因DNA全序列(NM_000111)。采用Primer5软件设计聚合酶链反应引物进行扩增。胶回收及纯化后，采用双向测序法进行基因序列分析，然后与标准序列进行比对分析。检索千人基因组计划资料库(http：//www.1000genomes.org)及NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，对照患儿基因突变，滤过不致病的多态性位点。利用NCBI蛋白数据库和Bioedit软件进行人类和不同物种的SLC26A3蛋白同源序列比较，并运用Mutationtaster软件(http：//www.mutationtaster.org)及Polyphen-2软件(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2)进行新突变的致病性预测。本研究通过北京大学第一医院医学伦理委员会批准(批准文号：2017-217)，患儿监护人均知情同意，并签署知情同意书。
患儿临床及生化特征典型，明确"CLD、低氯性代谢性碱中毒、电解质紊乱、生长发育落后"诊断。确诊后，予氯补充治疗(NaClKCl＝31)，Cl－ 6 mmol/(kg·d)口服1周后患儿血电解质水平恢复正常，精神反应好，但腹泻未见显著好转，予出院。出院后仍予电解质补充治疗，予合理饮水建议，并嘱患儿定期复查。患儿3岁时体质量13.4 kg，身高92 cm，智力运动发育良好，血电解质水平正常或血氯低于正常值下限，每日排便2～4次，现Cl－ 3 mmol/(kg·d)持续补充治疗，仍在随访中。
患儿存在SLC26A3基因c.358G>A(p.G120S)及c.634G>T(p.G212C)复合杂合突变(图1)，家系分析示突变源于患儿父母，符合CLD诊断。c.358G>A为已报道突变，c.634G>T为新突变，c.358G>A在千人基因组计划资料库(www.1000genomes.org)检出，为rs386833479。上述突变经MutationTaster和Polyphen-2软件致病性预测为"可能致病"，经多物种同源性分析示p.G212在多物种间高度保守(表1)，考虑c.634G>T致病的可能性大。
SLC26A3蛋白同源序列对比
Amino acid alignment in SLC26A3 subunits
SLC26A3蛋白同源序列对比
Amino acid alignment in SLC26A3 subunits
| 物种 | SLC26A3蛋白63位氨基酸(G) |
|---|---|
| 人类 | YLSESLISGFTTAAA |
| 黑猩猩 | YLSESLISGFTTAAA |
| 小鼠 | YLSESLISGFTTAAA |
| 红鳍东方鲀 | YLSDTLVSGFTTAAA |
| 斑马鱼 | YLSEPYISGFTTAAA |
| 杆线虫 | YLSDPLINGFTTAAA |
既往已报道10例中国CLD患儿(表2)，其中3例为兄妹(例6、7、8)。10例患儿中8例行基因检测，并检出相关致病突变。作者未提供3例患儿临床资料，其余7例患儿于出生后1～57 d起病，其中6例并孕期羊水增多，3例存在肠管扩张，CLD症状典型。部分患儿存在全身症状，如发育落后、营养不良及基底核损害。其中1例患儿生化检查类似Bartter综合征样改变(例3)。经氯补充治疗后预后良好，智力运动及生长发育正常，腹泻随着年龄的增长得以改善。8例行基因检测并获得确诊，发现SLC26A3基因7个致病突变，包括本研究SLC26A3基因c.358G>A(p.G120S)及c.634G>T(p.G212C)突变，故共有9个突变在中国患儿中检出(图2)。
中国人群SLC26A3基因突变导致10例低氯性腹泻临床资料及基因检测结果
The clinical data and the genetic results of ten Chinese patients with congenital chloride diarrhea
中国人群SLC26A3基因突变导致10例低氯性腹泻临床资料及基因检测结果
The clinical data and the genetic results of ten Chinese patients with congenital chloride diarrhea
| 病例 | 性别 | 起病年龄 | 起病症状 | 孕期羊水增多 | 肠管扩张 | 全身症状 | SLC26A3基因突变 | 预后 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 例1[3] | 男 | 36 d | 发绀 | ＋ | － | 发育落后 | 纯合c.1631T>A | 良好 |
| 例2[4] | 男 | 3 d | 腹泻 | ＋ | ＋ | － | 纯合c.239G>A | 良好 |
| 例3[1] | 女 | 3个月 | 腹泻 | － | － | － | 复合杂合c.270_271insAA及c.2048T>A | 无随访数据 |
| 例4[5] | 女 | 7 d | 腹泻 | ＋ | － | － | 纯合c.1631T>A | 良好 |
| 例5[6] | 男 | 1 d | 腹泻 | ＋ | － | 营养不良 | 复合杂合c.1387C>T及c.1483C>A | 良好 |
| 例6/7/8[7] | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | 复合杂合c.270_271insAA及c.1487T>G | N/A |
| 例9[8] | 女 | 1 d | 腹泻 | ＋ | ＋ | 基底核损害 | N/A | 良好 |
| 例10[9] | 男 | 1 d | 腹泻 | ＋ | ＋ | － | N/A | 无随访数据 |
注：N/A：文献中未描述 N/A：Not described in the literature
注：11例患儿中共检出9个SLC26A3基因突变，分别位于3、4、6、12、13、15及18号外显子 9 mutations locate in exons 3，4，6，12，15 and 18 were identified
CLD的发病率存在地区差异，在芬兰、波兰或阿拉伯国家发病率较高，为1/3万～1/4万[7]。因目前东亚人种中仅有数十例CLD报道[1,3,4,5,9,10,11]，在中国人群中仅有10例报道，故该病在中国人群甚至东亚人群的发病率仍未知。因为CLD较为罕见，且CLD患儿临床表征易与先天性失钠性腹泻、新生儿肠梗阻、炎症性肠病等疾病混淆，生化指标易与Bartter综合征等疾病混淆，所以CLD患儿常被误诊及漏诊[1,12]。若未经早期诊断及氯补充治疗，患儿电解质紊乱及长期腹泻可导致营养不良、脱水、肾损害甚至死亡。
SLC26A3基因位于7号染色体上，与SLC26A4基因首尾相连，可能与古老的基因重复相关[13,14]。SLC26A3基因编码764个氨基酸的SLC26A4蛋白，主要表达于肠上皮细胞，特别是正常回肠和结肠的刷状缘细胞，主要负责Cl－/HCO3-交换。SLC26A4蛋白缺陷可造成Cl－/HCO3-交换缺陷，引发Cl－吸收障碍，血液中大量丢失Cl－，在低氯血症的同时存在大便高氯。因Cl－/HCO3-和Na＋/H＋的离子转运通道偶联，Cl－/HCO3-交换障碍可进一步引发血钠降低。另外，Cl－/HCO3-交换障碍使结肠内容物酸化和HCO3-蓄积，从而引发代谢性碱中毒。而且，由于患儿低氯低钠并脱水，可引发肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，进一步促进钠的重吸收，高醛固酮水平可加重排钾，引发低钾血症，进一步加重代谢性碱中毒，代谢性碱中毒可进而引起代偿性高钙血症[13,14]。
CLD以迁延性腹泻为最主要临床表现，首发症状可于胎儿期发作，表现为孕期羊水过多及胎儿肠管扩张，且常发生早产。大部分患儿于出生后最初几天即开始腹泻，以稀水样便为主，每天可达10余次，若不经治疗，患儿可因脱水及电解质紊乱死亡。可伴回肠充气扩张，可有肠扭转。新生儿患者的腹胀和胎粪未排可能被误诊为肠梗阻，同时，腹泻可被误认为尿液排出从而延误诊断。男性患儿可能存在生育力低下、肾相关并发症，如肾钙质沉着、肾发育不全、先天性肾病综合征及慢性脱水所致肾功能下降。患儿腹泻常为终身性，且使用抗生素、肠道微生物制剂及黏膜保护剂等治疗无效或效果不佳[7,14,15]。本例患儿症状典型，孕期即存在羊水过多，出生后以顽固性腹泻起病，且因营养吸收障碍引起发育落后。患儿经止泻治疗后好转不显著，予氯补充治疗后好转。
CLD可依据典型临床症状、生化及影像学异常、遗传学缺陷进行诊断，特异性的电解质异常、血气异常及大便氯异常可协助CLD与先天性失钠性腹泻、炎症性肠病、乳糖不耐等疾病进行鉴别诊断。SLC26A3基因检测是CLD确诊及协助下一胎产前诊断的关键技术[2]，SLC26A3基因位于7q31，包含21个外显子，编码764个氨基酸组成的膜蛋白[16]。迄今为止，世界范围共报道了89种SLC26A3基因的致病突变，在波兰等CLD高发国家，已发现p.V317del等热点突变[17]。研究认为c.2063-1G>T是韩国的奠基者突变基因[10]。通过文献检索，共发现10例中国CLD患儿的报道，其中3例为兄妹[1,3,4,5,7,9,16,17]，8例行基因检测并获得确诊，发现SLC26A3基因7个致病突变，包括c.239G>A、c.270_271insAA、c.1387C>T、c.1483C>A、1487T>G、c.1631T>A及c.2048T>A。本研究家系中发现SLC26A3基因c.358G>A(p.G120S)及c.634G>T(p.G212C)突变，故共有9个基因突变在中国患儿中检出。9个突变位于7个外显子中，较为分散，并无突变高发的外显子或区域。本研究发现的突变中，c.634G>T为未被报道的新突变。c.634G>T在物种间保守，且经致病性预测软件预测致病，故致病可能性较高。c.358G>A突变曾在多种族的CLD患儿中检出，包括波兰、瑞典和挪威[18]。该突变的致病机制可能与胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的甲基化相关[19]。在14个等位基因中(既往报道12个，本研究报道2个)c.1631T>A突变占4/14等位基因，不除外其在中国人群中较为常见的可能。该突变曾在越南患儿中首次检出(纯合)[20]，位于硫酸盐转运蛋白抗σ因子结构域的N末端部分，该突变与STAS结构域错误折叠无关，但可能通过影响蛋白折叠和/或转运而致病[21,22]。
对于CLD患儿，早期诊断和治疗可显著改善患儿病情[23]。治疗主要为对症治疗，包括补充氯化钾、氯化钠的补充性治疗及补液治疗，可在补充Cl－的同时，抑制Cl－的分泌和预防脱水。早期治疗可预防因脱水及电解质紊乱可能导致的精神运动损伤、生长发育障碍及肾损害的发生，从而显著改善患儿预后[23,24]。质子泵抑制剂通过减少胃黏膜中Cl－的分泌，减少肠道氯化物丢失，从而改善患儿电解质水平并缓解腹泻。另外，丁酸盐对肠道氯化钠具有强大的促吸收作用，且具有抗分泌Cl－的作用[25]，对CLD患儿进行丁酸盐治疗后，部分患儿肠蠕动亢进程度、粪便黏稠度、大便次数均得以缓解，且大便及血电解质水平得以改善[5]。丁酸盐治疗效果可能与基因型相关，部分患儿无效，且腹泻可加重[26]。另外，升短链脂肪酸饮食可用于CLD的治疗。抗性淀粉是淀粉和进入大肠的小肠消化产物，人结肠细菌将抗性淀粉和非淀粉多糖(膳食纤维的主要成分)通过肠道微生物群发酵成短链脂肪酸，包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐，短链脂肪酸可进一步促进肠内水分和电解质吸收[27]，从而起到缓解病情的作用。本例患儿予氯盐补充治疗及合理饮水建议，疗效良好，多次血电解质及血气检查均正常或血Cl－稍低于正常值下限。现患儿3岁，身高体质量均正常，腹泻次数降低至3～4次/d，治疗有效。
综上，本研究报道1例CLD患儿，以迁延性腹泻及体质量不增为主要表现，发现一个SLC26A3基因新突变，并发现一个疑似中国患儿的热点突变。CLD易误诊为其他非感染性腹泻，基因检测及血便电解质检测在CLD诊断及鉴别诊断中具有决定性作用。建议对不明原因的腹泻患儿，尤其并母亲孕期羊水过多，低氯性代谢性碱中毒患儿，应结合临床特征、血液生化等鉴别诊断，争取基因分析协助确诊。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
