研究姜黄素对铅暴露大鼠体内铅负荷的影响,探究姜黄素对铅暴露大鼠体内氧化损伤的影响。
将70只21日龄SD大鼠随机分为7组,一组为正常对照组,予正常饮食饮水;另一组为单纯姜黄素组,正常饮水1个月后予姜黄素;其余5组为铅暴露模型组,给予2 g/L的醋酸铅溶液自由饮水1个月后随机分为铅暴露组,低、中、高浓度姜黄素治疗组及二巯基丁二酸(DMSA)治疗组。采用电感耦合等离子体质谱法测定大鼠体内铅负荷,试剂盒检测各组大鼠血液和海马组织抗氧化酶活力、谷胱甘肽调节酶类含量及过氧化物含量。
铅暴露使大鼠机体铅负荷增加[血铅、海马铅、肝铅、肾铅和骨铅含量分别为(221.76±12.59) μg/L、(1.10±0.11) μg/g、(1.40±0.12) μg/g、(8.26±0.47) μg/g、(57.58±6.09) μg/g],姜黄素治疗后能降低大鼠体内铅负荷,其中血铅、海马铅、肝铅、肾铅与铅暴露组比较均明显下降,差异均有统计学意义(F=90.67、39.07、27.34、86.04,均P=0.000),但各治疗组骨铅含量下降不明显(F=5.65,P=0.230)。铅暴露不仅显著提高大鼠体内脂质过氧化物水平,还降低抗氧化酶活力。姜黄素治疗后大鼠体内脂质过氧化物水平明显降低,与铅暴露组比较差异有统计学意义[血清(F=58.03、19.25、32.27、24.83,均P=0.000),海马(F=28.18、33.71、38.95、32.11,均P=0.000)];抗氧化物酶活力明显提高[血清(F=18.24、78.65,均P=0.000),海马(F=13.68、17.04,均P=0.000)],其中以高剂量姜黄素的作用最为明显,且优于传统的螯合剂DMSA,高剂量姜黄素与DMSA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
姜黄素能降低大鼠血液及脑、肝和肾组织铅含量;姜黄素可以提高机体抗氧化能力,缓解铅诱导的机体氧化损伤。
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铅中毒仍是危害儿童智力和神经系统发育的"第一杀手"。氧化应激参与铅中毒的病理学过程,但其具体机制未明。临床上利用螯合剂如二巯基丁二酸(DMSA)等促进体内铅的排出,而传统的驱铅药物主要应用于治疗急性铅中毒,并不能修复铅中毒所引起的组织损伤,因此不适用于低铅暴露的儿童。
研究发现,姜黄素能够通过螯合清除自由基来缓解重金属中毒引起的机体毒性[1,2]。Benammi等[3]发现姜黄素的二酮结构能够与铅螯合形成复合物后加快铅的排出。Hosseinzadeh等[4]发现姜黄素可提高小鼠大脑中谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性,从而降低铅的神经毒性。Candan和Tuzmen[5]发现姜黄素能显著抑制铅和铝诱发的脑组织中脂质过氧化物的增加,以上研究均表明,姜黄素对神经系统有一定的保护作用。本研究探究姜黄素对铅暴露大鼠氧化应激系统的影响,为铅中毒儿童的临床治疗提供新的诊疗思路和理论依据。
21日龄雄性SD大鼠70只,50~80 g,无特定病原体(SPF)级。由上海市实验动物资源中心提供[动物批准号:SYXK(沪)2013-0106],动物实验和分子生物学实验分别在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心和科研中心进行。
醋酸铅粉末、姜黄素粉末(Sigma公司,美国);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢(H2O2)及二奎啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。姜黄素分子式C21H20O6,分子量为368.37 。
石墨炉原子吸收光谱仪(Perkinelmer公司,美国),7700型电感耦合等离子体质谱仪(安捷伦公司,美国)。
SD大鼠适应性饲养1周后应用随机数字表法分组。正常对照组(10只)与单纯姜黄素组(10只),予正常饮水,标准饲料饲养;其余5组共50只大鼠为铅暴露模型,给予2 g/L的醋酸铅溶液自由饮水,标准饲料饲养,连续造模1个月后停止给铅,并将50只大鼠应用随机数字表法分为5个组,每组10只,分别为铅暴露组,低、中、高剂量姜黄素治疗组(姜黄素分别为25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg)和DMSA组(100 mg/kg),治疗1个月。与铅暴露组时间窗同步,正常对照组继续正常喂养,单纯姜黄素组给予高剂量姜黄素(100 mg/kg)。由于姜黄素难溶于水,用玉米油配成7.5 mg/mL悬浊液后行腹腔注射,每周注射3次,为1个疗程,共4周;DMSA亦难溶于水,亦用玉米油配成10 mg/mL DMSA悬浊液,每天腹腔注射1次,连续腹腔注射4 d停3 d为1个疗程,共4个疗程。
将各组大鼠心脏取血,其中2 mL全血用于检测血铅,剩余8 mL全血以3 000 r/min(离心半径为10 cm)离心10 min,吸取上清液存入冻存管待测。
心脏取血后,将大鼠断头处死,剥离海马、肝脏、肾脏以及两侧胫骨,分别称取0.1 g样品并消解,将消解管中的标本用超纯水定容后待测,部分海马组织冰上研磨,制备匀浆液后保存于冰箱中待测。
采用石墨炉原子吸收光谱仪进行血铅检测。采用安捷伦7700型电感耦合等离子体质谱仪进行海马、肝、肾、骨组织铅含量检测。
按照试剂盒说明书操作步骤进行。
应用SPSS 21.0统计软件进行分析处理,计量资料采用±s描述;计量资料的组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD法。P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。
铅暴露组大鼠血铅含量超过200 μg/L,且明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明造模成功。在血铅、海马铅、肝脏铅和肾脏铅中,中、高剂量姜黄素组均能显著降低铅暴露大鼠体内铅负荷,差异有统计学意义(均P<0.05);同时,低、中、高姜黄素3组的铅负荷显示剂量-效应关系差异,有统计学意义,各铅暴露组骨铅水平比较差异无统计学意义。结果见表1。
组别 | 只数 | 姜黄素剂量(mg/kg) | 血铅(μg/L) | 海马铅(μg/g) | 肝铅(μg/g) | 肾铅(μg/g) | 骨铅(μg/g) |
---|---|---|---|---|---|---|---|
正常对照组 | 10 | - | 20.65±3.24 | 0.19±0.01 | 0.43±0.01 | 0.15±0.04 | 0.15±0.02 |
铅暴露组 | 10 | - | 221.76±12.59a | 1.10±0.11a | 1.40±0.12a | 8.26±0.47a | 57.58±6.09a |
低剂量姜黄素组 | 10 | 25 | 206.85±10.46b | 1.09±0.08 | 1.32±0.11 | 7.89±0.35 | 56.44±2.89a |
中剂量姜黄素组 | 10 | 50 | 160.38±8.91bc | 0.76±0.06bc | 0.97±0.09bc | 6.94±0.26bc | 57.25±3.90a |
高剂量姜黄素组 | 10 | 100 | 110.44±7.95bd | 0.69±0.07bd | 0.62±0.05bd | 3.05±0.15bd | 55.44±3.90a |
DMSA组 | 10 | 100 | 107.08±8.65b | 0.27±0.03be | 0.67±0.06be | 2.89±0.15be | 60.71±5.72a |
单纯姜黄素组 | 10 | 100 | 21.28±3.32 | 0.21±0.02 | 0.45±0.01 | 0.16±0.05 | 0.14±0.04 |
F值 | 90.67 | 39.07 | 27.34 | 86.04 | 50.63 | ||
P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
注:DMSA:二巯基丁二酸;与正常对照组比较,aP<0.05;与铅暴露组比较,bP<0.05;与低剂量姜黄素组比较,cP<0.05;与中剂量姜黄素组比较,dP<0.05;与高剂量姜黄素组比较,eP<0.05 DMSA:Dimercaptosuccinic acid;compared with control group,aP<0.05;compared with lead-exposed group,bP<0.05;compared with low level curcumin treatment group,cP<0.05;compared with middle level curcumin treatment group,dP<0.05;compared with high level curcumin treatment group,eP<0.05
铅降低大鼠血清GSH、SOD、CAT、GPX活力,使H2O2、MDA水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。中、高剂量组能显著提高GSH、SOD、CAT、GPX活力,降低H2O2、MDA水平,且随着姜黄素剂量的升高,呈现剂量-效应关系。DMSA组也能提高GSH、SOD、CAT、GPX活力,降低H2O2、MDA水平。高剂量姜黄素治疗组的效果和DMSA组相比,高剂量姜黄素组在提高GSH、SOD、CAT、GPX活力和降低H2O2、MDA水平方面效果更明显,2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。
组别 | 只数 | 姜黄素剂量(mg/kg) | 谷胱甘肽(U/L×103) | 超氧化物歧化酶(U/L×103) | 过氧化氢酶(U/L×103) | 谷胱甘肽过氧化物酶(U/L×103) | 过氧化氢(U/L×103) | 丙二醛(nmol/L) |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
正常对照组 | 10 | - | 276.15±9.47 | 733.91±8.98 | 16.43±0.18 | 380.71±6.64 | 189.70±14.09 | 8.72±0.21 |
铅暴露组 | 10 | - | 135.51±5.41a | 628.41±8.88a | 9.24±0.14a | 333.38±7.94a | 224.19±10.41a | 15.78±0.33a |
低剂量姜黄素组 | 10 | 25 | 145.28±6.61b | 648.89±9.92b | 10.22±0.15b | 340.46±12.18b | 213.34±12.77b | 15.60±0.21 |
中剂量姜黄素组 | 10 | 50 | 161.72±6.94bc | 661.92±9.77bc | 11.30±0.15bc | 367.79±9.58bc | 199.71±11.75bc | 11.57±0.59bc |
高剂量姜黄素组 | 10 | 100 | 199.21±8.23bd | 715.01±10.32bd | 15.34±0.17bd | 398.53±10.91bd | 190.19±10.58bd | 9.26±0.17bd |
DMSA组 | 10 | 100 | 171.86±6.69be | 686.85±10.66be | 14.75±0.21be | 361.25±11.76be | 198.05±10.07be | 10.78±0.45be |
单纯姜黄素组 | 10 | 100 | 277.94±10.08 | 734.45±8.84 | 16.07±0.16 | 390.56±12.75 | 186.44±13.95 | 9.02±0.18 |
F值 | 58.03 | 19.25 | 32.27 | 24.83 | 18.24 | 78.65 | ||
P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.001 | 0.000 |
注:DMSA:二巯基丁二酸;与正常对照组比较,aP<0.05;与铅暴露组比较,bP<0.05;与低剂量姜黄素组比较,cP<0.05;与中剂量姜黄素组比较,dP<0.05;与高剂量姜黄素组比较,eP<0.05 DMSA:Dimercaptosuccinic acid;compared with control group,aP<0.05; compared with lead-exposed group,bP<0.05; compared with low level curcumin treatment group,cP<0.05;compared with middle level curcumin treatment group,dP<0.05;compared with high level curcumin treatment group,eP<0.05
铅使大鼠海马组织内的GSH、SOD、CAT、GPX活力降低,H2O2、MDA水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);中、高剂量组能显著提高GSH、SOD、CAT、GPX活力,降低H2O2、MDA水平,且随着姜黄素剂量的升高,呈现剂量-效应关系。DMSA组也能提高GSH、SOD、CAT、GPX活力,降低H2O2、MDA水平。与DMSA组比较,高剂量姜黄素组在提高GSH、SOD、CAT、GPX活力和降低H2O2、MDA水平方面,效果更明显,2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表3。
组别 | 只数 | 姜黄素剂量(mg/kg) | 谷胱甘肽(mmol/mgprot) | 超氧化物歧化酶(U/mgprot) | 过氧化氢酶(U/mgprot) | 谷胱甘肽过氧化物酶(U/mgprot) | 过氧化氢(mmol/mgprot) | 丙二醛(nmol/mgprot) |
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正常对照组 | 10 | - | 41.32±2.31 | 51.54±4.17 | 51.98±2.98 | 74.32±1.43 | 45.91±3.43 | 4.27±1.08 |
铅暴露组 | 10 | - | 28.13±2.34a | 35.43±2.87a | 30.98±3.91a | 41.87±2.54a | 63.65±3.23a | 8.65±1.20a |
低剂量姜黄素组 | 10 | 25 | 28.56±2.12 | 36.57±3.65 | 31.12±3.02 | 46.54±1.23b | 52.98±3.13b | 6.59±1.19b |
中剂量姜黄素组 | 10 | 50 | 32.45±2.13bc | 41.37±3.43bc | 37.76±3.11bc | 47.32±1.69b | 49.43±3.87bc | 5.77±1.14b |
高剂量姜黄素组 | 10 | 100 | 38.34±2.14bd | 49.32±4.09bd | 50.23±3.36bd | 67.91±2.87bd | 46.34±3.45bd | 4.36±1.31bd |
DMSA组 | 10 | 100 | 34.32±1.4be | 46.63±3.15be | 49.17±3.27be | 55.32±2.31be | 48.32±2.76be | 5.85±1.43be |
单纯姜黄素组 | 10 | 100 | 42.13±1.34 | 52.54±3.98 | 52.36±3.08 | 61.43±2.28 | 45.87±3.32 | 4.19±1.28 |
F值 | 28.18 | 33.71 | 38.95 | 32.11 | 13.68 | 17.04 | ||
P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.003 | 0.000 |
注:DMSA:二巯基丁二酸;与正常对照组比较,aP<0.05;与铅暴露组比较,bP<0.05;与低剂量姜黄素组比较,cP<0.05;与中剂量姜黄素组比较,dP<0.05;与高剂量姜黄素组比较,eP<0.05 DMSA:Dimercaptosuccinic acid;compared with control group,aP<0.05;compared with lead-exposed group,bP<0.05;compared with low level curcumin treatment group,cP<0.05;compared with middle level curcumin treatment group,dP<0.05;compared with high level curcumin treatment group,eP<0.05
目前传统铅螯合剂是治疗铅中毒的主要药物,虽然经典鳌合剂排铅作用强,但是长期用药有其不良反应。研究证实,大剂量DMSA治疗铅中毒后使血尿素氮、肌酐等水平显著升高[6,7],提示对肝、肾都有毒性作用,这些不良反应使螯合剂的安全性受到了质疑。同时铅在体内积聚会破坏"氧化-抗氧化"动态平衡[8,9],而传统螯合剂不能修复铅造成的损失。近年来发现一些天然的抗氧化剂,既能螯合铅同时又能消耗自由基,其中姜黄素是从植物姜黄中提取的一种植物化学物,具有抗氧化、抗炎、清除氧自由基等多种药理活性。
本研究结果显示,姜黄素治疗组能降低大鼠体内铅负荷,且随着姜黄素剂量增加,下降趋势更加明显,呈明显的剂量-效应关系。高剂量姜黄素治疗组与DMSA组比较差异无统计学意义,说明姜黄素的驱铅效果与传统经典药物DMSA无明显差异。但各铅暴露组的骨铅含量在姜黄素治疗并无明显下降,说明姜黄素和传统螯合剂一样,不能有效降低沉积在骨骼内的铅,或因为本实验姜黄素治疗疗程短,未观察到骨铅含量的下降,不排除延长姜黄素的疗程后,有降低骨铅的可能性,这需要进一步的实验来研究证实。
姜黄素是有效的纯天然植物抗氧化剂[10,11],这在姜黄素拮抗重金属的相关研究中得到充分体现。Schmitz等[12]发现姜黄素能够明显改善镉导致的大鼠肝、肾等组织脂质过氧化状态,保护大鼠免受氧化应激损伤。本研究结果与其他研究结果相似,均显示SOD、CAT等抗氧化酶在铅染毒时活性受到抑制[13,14],铅暴露大鼠血清和海马抗氧化酶活力下降,而氧化酶含量增高,说明铅暴露后大鼠抗氧化能力及清除氧自由基能力下降。本研究结果显示,在使用姜黄素治疗后,姜黄素治疗组大鼠机体内抗氧化酶活性增加,同时氧化酶含量减少,提示姜黄素能够增强铅暴露大鼠的抗氧化损伤能力,且随着姜黄素剂量的增长而出现一定的剂量效应关系,其中高剂量姜黄素治疗的疗效与传统经典药物DMSA组比较,在抗氧化损伤方面效果更显著,且差异有统计学意义,这说明姜黄素作为外源性的抗氧剂能够有效缓解铅毒性诱导的机体损伤,对铅暴露后受损的机体有一定修复作用,这一点是传统的经典螯合剂不具备的。
姜黄素的化学结构式中有1个二酮结构,在pH值>8碱性条件时,可以变成烯醇式,而烯醇式中的羟基可以与重金属络合形成络合物,从而排出机体。研究显示,槲皮素与姜黄素结构类似,且同为黄酮类抗氧化剂,槲皮素分子内的儿茶酚功能位点对于二价铅离子有极强的络合作用[15,16,17],由此推测姜黄素与铅结合的可能位点或许不止一个。但是这些假说均需要更多的结构化学方面的实验来证实。
铅暴露是一个世界性的公共卫生问题,实际上,要将已经进入机体内的铅完全从体内排除是不现实的,因此,国内外诸多研究旨在减少铅暴露对机体产生的毒副作用,有效保护机体不受铅毒性损伤,尤其是处于发育期的儿童,而目前广泛应用于临床的一些经典螯合药物长期使用普遍存在一定的不良反应,抗氧化剂姜黄素是一类天然、安全的植物化合物,从以往及目前的研究来看,姜黄素在治疗铅毒方面有着更加优良的前景。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突