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• 实验研究 •
功能性便秘患儿肠道菌群对大鼠酸敏感离子通道3表达的影响及在肠道动力中的作用
中华实用儿科临床杂志, 2019,34(19) : 1485-1489. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2019.19.012
摘要
目的

探讨功能性便秘(FC)患儿肠道菌群对大鼠体内酸敏感离子通道3(ASIC3)表达的影响，并探讨其在肠道动力中的调控作用。

方法

收集安徽医科大学第一附属医院2017年12月至2018年6月符合罗马Ⅳ诊断标准的FC患儿和健康儿童的粪便制成粪菌液。构建伪无菌大鼠模型，按照随机数字表法将大鼠随机分为处理组和对照组，每组12只，处理组予FC患儿粪菌液，对照组予健康儿童粪菌液灌胃处理，腹部回撤反射(AWR)法测定大鼠内脏敏感性，计算小肠推进率，16SrDNA高通量测序法测定大鼠和FC患儿的肠道微生物，荧光定量PCR及Western blot法测定肠道ASIC3 mRNA和蛋白质的表达。

结果

FC患儿及FC粪菌植入伪无菌大鼠均有肠道菌群种类和数量减少(均P<0.05)，以厚壁菌门、拟杆菌门为主；与对照组比较，处理组大鼠小肠推进率(52%比74%)及内脏敏感性(78 mmHg比63 mmHg)均明显降低(均P<0.05)；处理组大鼠小肠ASIC3 mRNA(0.003 1±0.000 8比0.012 4±0.002 5)和蛋白质(0.013 2±0.001 9比0.072 1±0.008 7)表达均明显下调(均P<0.05)，结肠组织中ASIC3 mRNA(0.002 8±0.000 7比0.009 4±0.001 1)和蛋白质(0.038 2±0.004 5比0.089 7±0.009 4)表达均明显表达下调(均P<0.05)。

结论

FC患儿存在肠道菌群紊乱，且FC患儿肠道菌群可能通过下调大鼠肠道ASIC3的表达，影响肠道动力。

引用本文: 赵军梅, 蔡洁, 朱克然, 等.  功能性便秘患儿肠道菌群对大鼠酸敏感离子通道3表达的影响及在肠道动力中的作用 [J] . 中华实用儿科临床杂志,2019,34 (19): 1485-1489. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2019.19.012
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功能性便秘(functional constipation，FC)是小儿常见的一种功能性胃肠病，研究已证实FC的产生可能与肠道微生物改变、肠动力学异常及精神心理因素等相关[1]。目前认为，肠道菌群失调与肠道动力异常关系密切，并在FC发病中发挥重要的作[2]。但肠道菌群参与肠动力异常的机制尚未完全明确。酸敏感离子通道(acid－sensing ion channels，ASICs)是一类由细胞外酸化所激活的阳离子通道，在胃肠道广泛分布，对维持胃肠道环境和功能起重要作用[3]。研究发现，ASIC3作为化学感受器及机械感受器在胃肠道信息处理过程中发挥重要作用[4]。但ASIC3与肠道菌群的关系及其在功能性胃肠病发生中的调控作用国内外尚未见报道。本研究采用FC患儿的肠道菌群植入大鼠，观察肠道菌群与ASIC3表达的关系及在调节肠道动力中的作用，为明确FC的发病机制并为其防治提供实验依据。

1　材料与方法
1.1　实验动物及主要实验材料
1.1.1　实验动物

24只SD大鼠购自安徽省动物实验中心，动物许可证号SCXK-2017-001，体质量为120～140 g，正常摄食、饮水，饲养于安徽医科大学无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房。

1.1.2　粪菌液的来源及制备

收集2017年12月至2018年6月安徽医科大学第一附属医院粪菌移植供体，6例健康志愿者粪便。其中男3例，女3例；年龄8～12岁；完全自发排便6～7次/周。以及儿科门诊符合罗马Ⅳ诊断标准的FC患儿的粪便，其中男3例，女3例；年龄8～12岁。参照文献[5]制备粪菌液，并置于－80 ℃冰箱保存备用。

1.1.3　主要试剂

兔抗鼠ASIC3一抗及辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司，抗生素(万古霉素、甲硝唑、新霉素)购自上海翰香生物科技公司，常规试剂由安徽医科大学寄生虫教研室提供。

1.2　实验方法
1.2.1　实验分组及处理

将24只SD大鼠随机数字表法分为处理组和对照组，每组12只，编号称重，每只大鼠均予抗生素混合物饮水(万古霉素200 mg/kg、甲硝唑200 mg/kg、新霉素200 mg/kg)，隔天1次，共2周，构建伪无菌鼠模型[6,7]，然后给予粪菌液灌胃处理。(1)处理组：给予FC患儿粪菌液(1.0 mL/100 g)灌胃；(2)对照组：给予健康志愿者粪菌液(1.0 mL/100 g)灌胃。每日1次，连续3 d，以后隔天1次，共7次，第15天收集大鼠粪便，置于无菌冻存管，予液氮中保存，进行16SrDNA高通量测序。后处死大鼠，留取小肠及结肠组织，分别进行ASIC3 mRNA及蛋白质测定。

1.2.2　24 h排便量及粪便含水量

2组大鼠各取6只，每只大鼠单独放于鼠笼中，每隔1 h收集笼中粪便，记录颗粒数并称重，将称重过后的粪便置于60 ℃烘箱中，12 h后再次称重，粪便含水量＝(湿粪质量－干粪质量)/湿粪质量×100%。

1.2.3　小肠推进率

上述大鼠禁食不禁水16 h后，分别给予活性炭灌胃(1.0 mL/100 g)，准确计时，20 min后水合氯醛麻醉，迅速打开腹腔，仔细分离肠系膜，剪取上端自幽门，下至回盲部的肠管，将肠管不加牵引平铺于玻璃板上。用刻度尺测量小肠推进的距离，计算小肠推进率，小肠推进率%＝活性炭推进距离(cm)/小肠总长度(cm)×100%。

1.2.4　结肠动力

另取6只大鼠，禁食不禁水16 h后，乙醚轻度麻醉后，将直径约3 mm的彩色塑料小珠经光滑的塑料棒经肛门推入大鼠远端结肠(距肛门约3 cm)，然后将大鼠单独放置于垫有白纸的笼中，记录从放入到排出小珠的时间，重复3次，取平均值。

1.2.5　腹部回撤反射(AWR)评估大鼠的肠道敏感性[8]

大鼠经上述处理第15天，分别取各组大鼠6只，乙醚麻醉大鼠后，将8F导尿管一端用三通阀连接水银血压计，检查无漏气后，用石蜡油润滑气囊并缓慢插入大鼠肛门，气囊末端距离肛门1 cm，用胶带将导管固定在尾根部，将其置于透明塑料盒(20 cm×8 cm×6 cm)中，大鼠只能前后活动，不能转身，30 min后待大鼠苏醒并充分适应环境，用注射器缓慢向气囊内注气使压力上升，加压速率为5 mmHg/s(1 mmHg＝0.133 kPa)。分别在20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg压力下进行AWR评分，并记录痛阈(AWR评分为3分时的压力)。

1.2.6　肠道菌群分析

按照QIAamp Stool Mini试剂盒提取FC患儿及大鼠粪便中DNA，所有样本的DNA产物送至武汉塞维尔生物科技有限公司进行文库构建及Illumina Miseq平台高通量测序，对原始数据进行拼接和低质量过滤处理，得到有效序列后进行聚类分析每一个聚类称为一个分类操作单元(OTU)，通过OTU聚类分析，可以得到不同样品中OTU的丰度，从而评估每个样品中微生物的多样性，包括对样品中含有OTU的数目(丰富度)和群落结构的稳定性(均匀度)计算和评估。通过OTU稀释曲线分析，评估测序量是否达标。此外，还可根据OTU丰度表计算不同样品间的物种组成结构差异，从而研究不同样品(分组)物种组成异同。Alpha多样性包括Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon、Simpson指数，Chao1、Observed_species指数主要关心样本的物种丰富度信息；Goods _coverage反映样本的低丰度OTU覆盖情况；Simpson/Shannon主要综合体现物种的丰富度和均匀度。

1.2.7　实时荧光定量PCR测定大鼠小肠及结肠组织中ASIC3 mRNA表达

分别取大鼠幽门下5 cm处小肠及直肠上2 cm处结肠组织各100 mg，采用Trizol法提取组织中总RNA，按照试剂盒说明书进行反转录(RT)，实时荧光定量PCR法测定各组织中ASIC3 mRNA表达。大鼠ASIC3序列：上游5′-TTTGACATGGCACAAC-TCTACGC-3′，下游5′-TGTCCTTCCAGATGGGCAGATA-3′；β-actin序列：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，下游5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。通过RT合成的cDNA 2 μL进行RT-PCR扩增。RT-PCR反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s循环扩增。采用ABI Prism 7300 SDS(美国ABI公司)仪器分析数据。

1.2.8　Western blot法测定小肠及结肠组织中ASIC3蛋白质表达

分别提取小肠及结肠组织中总蛋白质，灌胶上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法将蛋白转移于转移至硝酸纤维素膜，采用丽春红染色观察转印是否成功，50 g/L脱脂奶粉的Tris缓冲液4 ℃过夜封闭，洗膜后加入兔抗鼠ASIC3(1∶400)一抗溶液，4 ℃杂交过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗杂交1 h后冲洗，电化学发光(ECL)显色发光，并用Image J．1.46软件分析灰度值。

1.3　统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件处理，正态分计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　FC患儿肠道菌群植入对大鼠肠道动力和内脏敏感性的影响
2.1.1　大鼠粪便质量

与对照组比较，处理组大鼠24 h排便量显著降低，且粪便含水量较对照组明显减少，差异均有统计学意义，见表1。

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表1

粪菌植入对对照组和处理组大鼠粪便质量的影响

Table 1

Effect of fecal bacteria implantation on fecal and stool quality of rats between the control group and the treatment group

表1

粪菌植入对对照组和处理组大鼠粪便质量的影响

Table 1

Effect of fecal bacteria implantation on fecal and stool quality of rats between the control group and the treatment group

组别数量粪便质量
排便量(粒)粪便含水量(%)
对照组66351
处理组64233
t值 3.755.98
P值 0.0330.028
2.1.2　FC患儿肠道菌群植入对大鼠小肠推进率及结肠动力的影响

处理组大鼠的小肠推进率较对照组明显降低，差异有统计学意义；处理组大鼠结肠传输时间较对照组明显增加，差异有统计学意义，见表2。

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表2

粪菌植入对对照组和处理组大鼠肠道动力的影响

Table 2

Effect of fecal bacteria implantation on intestinal motility in rats between the control group and the treatment group

表2

粪菌植入对对照组和处理组大鼠肠道动力的影响

Table 2

Effect of fecal bacteria implantation on intestinal motility in rats between the control group and the treatment group

组别数量肠道动力
小肠推进率(%)结肠传输时间(min)
对照组652174
处理组674223
t值 6.879.16
P值 0.0170.005
2.1.3　FC患儿肠道菌群植入对大鼠内脏敏感性的影响

在20 mmHg压力下对大鼠进行结肠扩张，处理组大鼠的AWR评分略低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg压力下分别对大鼠进行结肠扩张，处理组大鼠的AWR评分(0.87、0.128、2.46)均显著低于对照组(1.12、1.79、3.01)，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图1A；且使大鼠AWR评分达到3分时处理组所需的压力(78 mmHg)较对照组(63 mmHg)增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B。

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图1
粪菌植入对大鼠内脏敏感性的影响　A：2组大鼠在不同压力扩张下的AWR评分；B：2组大鼠在AWR为3分时所需要的压力
Figure 1
Effect of fecal bacteria implantation on visceral sensitivity of rats　A：AWR score of rats in group 2 under different pressure dilation；B：pressure needed by rats in group 2 when AWR is 3 points
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注：AWR：腹部回撤反射；1 mmHg＝0.133 kPa　AWR：abdominal with drawal reflex；1 mmHg＝0.133 kPa

图1
粪菌植入对大鼠内脏敏感性的影响　A：2组大鼠在不同压力扩张下的AWR评分；B：2组大鼠在AWR为3分时所需要的压力
Figure 1
Effect of fecal bacteria implantation on visceral sensitivity of rats　A：AWR score of rats in group 2 under different pressure dilation；B：pressure needed by rats in group 2 when AWR is 3 points
2.2　人和大鼠的肠道内容物16SrDNA高通量测序分析
2.2.1　OTU及Alpha多样性

采用t检验对所有研究对象的有效序列的多样性指数(Chao1、observed-species、shannon、simpson指数)进行分析比较，用来描述物种的数目的chao1、observed_species指数在处理组略高于对照组，但2组之间差异无统计学意义；而反映菌群多样性的shannon、simpson指数在处理组显著低于对照组见图2A、表3；而同样的，FC患儿的Chao1、observed_species指数略高于健康儿童，但2组间差异无统计学意义；而shannon、simpson指数在FC组显著低于健康儿童，见图2B、表4，且Shannon指数曲线随测序深度的增加趋向于平坦，表明测序数据足够大，足以反映各组微生物信息。

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表3

对照组和处理组大鼠的肠道菌群多样性比较　(±s)

Table 3

Comparison of intestinal flora diversity between the control group the and treatment group　(±s)

表3

对照组和处理组大鼠的肠道菌群多样性比较　(±s)

Table 3

Comparison of intestinal flora diversity between the control group the and treatment group　(±s)

组别数量OTUAlpha多样性
Chao1observed-speciesshannonsimpson
对照组6784±94759.93±152.00406.47±98.008.35±1.210.94±0.11
处理组6617±79834.56±196.00435.94±121.007.09±0.810.67±0.09
t值 2.346.541.234.315.78
P值 0.0450.3240.0970.0140.032

注：OTU：分类操作单元　OTU：operational taxonomic unit

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表4

健康对照组儿童和FC患儿的肠道菌群多样性比较　(±s)

Table 4

Comparison of intestinal flora diversity between healthy children and children with FC　(±s)

表4

健康对照组儿童和FC患儿的肠道菌群多样性比较　(±s)

Table 4

Comparison of intestinal flora diversity between healthy children and children with FC　(±s)

组别例数OTUAlpha多样性
Chao1observed_speciesshannonsimpson
健康对照组6296±73395.65±97.00216.74±59.005.72±0.680.89±0.13
FC组6198±65432.78±112.00265.32±78.004.09±0.510.47±0.08
t值 1.763.252.413.563.21
P值 0.0230.1090.0890.0320.009

注：FC：功能性便秘；OTU：分类操作单元　FC：functional constipation；OTU：operational taxonomic unit

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图2
2组大鼠及其相应供体肠道菌群shannon指数值与样品深度的关系　A：大鼠的shannon指数曲线；B：FC患儿的shannon指数曲线
Figure 2
Relationship between shannon index values of intestinal flora and sample depth of 2 groups of rats and their corresponding donors　A：shannon index curve of rats；B：shannon index curve of FC children
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注：FC：功能性便秘　FC：fanctional constipation

图2
2组大鼠及其相应供体肠道菌群shannon指数值与样品深度的关系　A：大鼠的shannon指数曲线；B：FC患儿的shannon指数曲线
Figure 2
Relationship between shannon index values of intestinal flora and sample depth of 2 groups of rats and their corresponding donors　A：shannon index curve of rats；B：shannon index curve of FC children
2.2.2　OTU交叠Venn图

2组大鼠OTU总数为8 764个，有2 178个OTU为2组所共有，有1 542个OTU为实验组大鼠所独有，有2 531个OTU为对照组大鼠所独有，见图3A；相应的在供体中，FC患儿和健康儿童OTU总数为3 139个，其中有803个OTU为2组共有，有386个OTU为FC患儿所独有，有975个OTU为健康儿童所独有，见图3B。无论是大鼠还是人类，2组间样本物种分布均具有差异性，见表3、表4，且对照组大鼠肠道菌群更加丰富。

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图3
2组大鼠及相应供体肠道菌群OTU交叠Venn图　A：大鼠肠道菌群；B：FC患儿肠道菌群
Figure 3
OTU overlapping Venn diagram of intestinal flora of the 2 groups of rats and corresponding donors　A：intestinal flora of rats；B：intestinal flora of FC children
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注：OTU：分类操作单元；FC：功能性便秘　OTU：operational taxonomic unit；FC：functional constipation

图3
2组大鼠及相应供体肠道菌群OTU交叠Venn图　A：大鼠肠道菌群；B：FC患儿肠道菌群
Figure 3
OTU overlapping Venn diagram of intestinal flora of the 2 groups of rats and corresponding donors　A：intestinal flora of rats；B：intestinal flora of FC children
2.2.3　结构差异分析

在门水平，2组大鼠均以厚壁菌门、拟杆菌门为主要优势菌群，但实验组大鼠变形杆菌门比例较高，见图4A；在科水平，2组大鼠均以瘤胃菌科、毛螺菌科、拟杆菌有较高的丰度，见图5A。FC患儿肠道菌群在门水平也是以厚壁菌门、拟杆菌门为主要优势菌群，见图4B；在科水平以瘤胃菌科、毛螺菌科、拟杆菌科、肠杆菌科为主要优势菌群，见图5B。

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图4
2组大鼠及FC患儿肠道菌群门水平分布　A：大鼠肠道菌群构成；B：FC患儿的肠道菌群构成
Figure 4
Horizontal distribution of intestinal flora in the 2 groups of rats and FC children　A：composition of intestinal flora in rats；B：composition of intestinal flora in FC children
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注：FC：功能性便秘　FC：functional constipation

图4
2组大鼠及FC患儿肠道菌群门水平分布　A：大鼠肠道菌群构成；B：FC患儿的肠道菌群构成
Figure 4
Horizontal distribution of intestinal flora in the 2 groups of rats and FC children　A：composition of intestinal flora in rats；B：composition of intestinal flora in FC children
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图5
2组大鼠及其相应供体的肠道菌群科水平分布　A：大鼠肠道菌群构成；B：FC患儿肠道菌群构成
Figure 5
Horizontal distribution of intestinal flora of the 2 groups of rats and their corresponding donors　A：composition of intestinal flora in rats；B：composition of intestinal flora in FC children
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注：FC：功能性便秘　FC：functional constipation

图5
2组大鼠及其相应供体的肠道菌群科水平分布　A：大鼠肠道菌群构成；B：FC患儿肠道菌群构成
Figure 5
Horizontal distribution of intestinal flora of the 2 groups of rats and their corresponding donors　A：composition of intestinal flora in rats；B：composition of intestinal flora in FC children
2.3　FC患儿肠道菌群植入对大鼠小肠及结肠中ASIC3 mRNA和蛋白的表达

ASIC3 mRNA和蛋白质均在对照组大鼠小肠及结肠组织中表达，而处理组大鼠小肠及结肠组织中ASIC3 mRNA和蛋白质表达水平较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5、图6。

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表5

FC患儿肠道菌群对大鼠小肠及结肠组织中ASIC3 mRNA及蛋白质表达的影响

Table 5

Effect of intestinal flora in FC children on ASIC3 mRNA and protein expression in small intestine and colon of rats

表5

FC患儿肠道菌群对大鼠小肠及结肠组织中ASIC3 mRNA及蛋白质表达的影响

Table 5

Effect of intestinal flora in FC children on ASIC3 mRNA and protein expression in small intestine and colon of rats

组别数量小肠结肠
mRNA水平蛋白质水平mRNA水平蛋白质水平
对照组60.012 4±0.002 50.072 1±0.008 70.009 4±0.001 10.089 7±0.009 4
处理组60.003 1±0.000 80.013 2±0.001 90.002 8±0.000 70.038 2±0.004 5
t值 4.621.242.137.64
P值 0.0360.0250.0130.031
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图6
FC患儿肠道菌群对大鼠小肠及结肠组织中ASIC3蛋白质表达的影响　A：小肠中ASIC3蛋白质的表达；B：结肠中ASIC3蛋白质的表达
Figure 6
Effect of intestinal flora on ASIC3 protein expression in small intestine and colon of rats with FC　A：ASIC3 protein expression in small intestine；B：ASIC3 protein expression in colon
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注：FC：功能性便秘；ASIC3：酸敏感离子通道3　FC：functional constipation；ASIC3：acid－sensitive ion channel 3

图6
FC患儿肠道菌群对大鼠小肠及结肠组织中ASIC3蛋白质表达的影响　A：小肠中ASIC3蛋白质的表达；B：结肠中ASIC3蛋白质的表达
Figure 6
Effect of intestinal flora on ASIC3 protein expression in small intestine and colon of rats with FC　A：ASIC3 protein expression in small intestine；B：ASIC3 protein expression in colon
3　讨论

FC是影响小儿健康和生活质量的一种常见功能性胃肠疾病，可见于各年龄儿童[9]。现已明确FC患儿存在肠道菌群紊乱，且参与了FC的发生发展。本研究显示FC患儿粪便中细菌与健康儿童相比在门水平厚壁菌门、拟杆菌门含量增加；在科水平以瘤胃菌科、毛螺菌科、拟杆菌科、肠杆菌科为主。将FC患儿肠道菌群植入伪无菌大鼠，大鼠粪便中肠道菌群出现与FC患儿肠道菌群类似改变，这与相关的研究[10,11]结果一致。研究亦发现FC肠道菌群植入的伪无菌大鼠出现便秘症状，其内脏敏感性降低，大鼠肠道传输时间明显延长，提示FC存在肠道菌群紊乱，且肠道菌群紊乱与肠道动力之间存在紧密联系。

研究证实肠道微生物通过其代谢产物影响大便性状，FC患者粪便中短链脂肪酸减少，肠道短链脂肪酸吸收增加，协同Na＋、K＋、H2O吸收增加，可降低粪便含水量，导致粪便干结[12]。研究还发现肠道微生物本身异常可能导致相关信号通路改变，导致肠道细胞膜上离子通道开放，引起结肠平滑肌、肠神经系统、Cajal间质细胞等的变化，影响肠道动力，最终引起便秘[13]。

ASICs是细胞膜上H＋门控、Na＋高通透性的阳离子通道，参与了触觉、痛觉、酸味觉的形成、学习记忆及某些病理反应，如缺血缺氧、癫痫等，在组织中具有广泛的分布。研究证实ASIC3在投射胃的82%的脊髓背根神经节(DRG)神经元中有表达[14]，且胃肠道存在ASIC3表达和分布。在实验性胃溃疡大鼠中DRG和迷走神经节神经元中的ASIC样电流发生改变；炎症性肠病患者的肠黏膜中ASIC3表达增加[15]；ASIC3敲除可减少胃肠道的机械敏感性，延缓胃排空[4]。因此，ASIC3在胃肠道信息传递过程中起重要作用。本研究中发现FC患儿肠道菌群可以下调大鼠小肠及结肠组织中ASIC3 mRNA和ASIC3蛋白质的表达，推测FC患儿肠道菌群可能通过抑制ASIC3通道的开放，减弱肠道平滑肌等收缩功能，降低大鼠排便功能。

综上所述，FC患儿肠道菌群可以影响肠道ASIC3表达，降低肠道动力，提示肠道菌群改变在FC的发生发展中发挥重要作用。但FC患儿肠道菌群比较复杂，有哪些具体细菌参与调节肠道ASIC3的表达，肠道细菌是如何调节ASIC表达，需要进一步精准研究，肠道菌群参与FC发生的确切分子机制仍需要深入探讨。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献
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酸敏感离子通道
肠道菌群
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功能性便秘