探讨转录因子GATA-6在单纯性圆锥动脉干畸形中的分子遗传机制,旨在为单纯性圆锥动脉干畸形的早期预防及遗传咨询提供支持。
选取32例散发单纯性圆锥动脉干畸形患儿及100例健康者,应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增转录因子GATA-6基因的7个外显子编码区及两侧部分内含子区,PCR产物纯化后ABI Genetic Analyzer 3100型DNA测序仪自动测序,所得结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中GATA-6基因序列进行比对,并且与健康对照组比较,观察转录因子GATA-6基因突变情况;以野生型pcDNA3.1-GATA-6为模板,用基因定点突变方法构建突变基因型真核表达载体GATA-6-G245R;野生型GATA-6、GATA-6-G245R和心房利钠因子荧光素酶(ANF luciferase)报告质粒共转染HEK 293T细胞,并以共转染的CMV-LacZ为内参,荧光素酶和半乳糖苷酶活性在转染24 h后用发光计测定并检测下游ANF-Luciferase报告基因的活性。
在1例右心室双出口患儿中发现了转录因子GATA-6的错义突变,突变位于GATA-6基因第2外显子区c.733G>C,突变使第245位的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)取代(p.Gly245Arg,G245R)。pcDNA3.1(+)-GATA-6突变体真核表达质粒经酶切及正反2个方向测序验证构建成功;通过对luciferase荧光素酶报告基因活性的检测发现相比较野生型GATA-6和GATA-6-G245R突变基因转录活性下降。GATA-6-G245R与野生型GATA-6比较下降41.3%,二者比较差异有统计学意义(P<0.001)。
转录因子GATA-6突变与单纯性圆锥动脉干畸形发生相关,转录因子GATA-6基因可能是单纯性心脏圆锥动脉干畸形患者的易感基因。
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圆锥动脉干畸形是先天性心脏病(先心病)的一种类型,其是心脏圆锥动脉干即心脏流出道胚胎发育异常的一类复杂型先天性心脏结构畸形,占发绀型先心病的70%,是导致婴幼儿复杂心脏结构畸形和高死亡率的主要原因[1],严重危害婴幼儿的健康。遗传因素在圆锥动脉干畸形的发生机制中起重要作用,但其遗传方式不清楚,易感基因也尚未明确。动物模型研究证实,GATA-6基因在圆锥动脉干的发育中起重要作用,本研究对单纯性圆锥动脉干畸形患儿进行GATA-6基因的突变检测和突变基因的功能研究,为先心病发生机制提供分子水平理论依据,为先心病的早期诊断、遗传咨询和治疗提供帮助。
2015年12月至2017年12月在贵州省人民医院明确诊断的32例散发单纯性圆锥动脉干畸形患儿作为病例组。排除标准:伴其他系统异常,染色体核型分析异常者。患儿年龄1个月~3岁[(1.45±1.08)岁];男18例,女14例。32例单纯性圆锥动脉干畸形患儿病种如下:法洛四联症15例,右心室双出口5例,肺动脉闭锁伴室间隔缺损5例,完全性大动脉转位4例,主动脉弓中断3例。健康对照组100例,其中男58例,女42例;年龄1~14岁[(4.53±4.42)岁],健康对照组均经门诊体检健康。患儿监护人均知情同意,并签署知情同意书,本研究通过贵州省人民医院医学伦理委员会批准(批准文号:2016055)。
抽取病例组和健康对照组儿童外周血3 mL置枸橼酸钠(EDTA)抗凝管中,置-20 ℃冰箱备用。使用血基因组DNA试剂盒(Qiagen公司,德国)抽提外周血基因组DNA,将DNA标本置-20 ℃冰箱。
(1)根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中人类转录因子GATA-6的基因组序列(编号:NC-00018),采用primer express(3.0版)软件设计引物扩增GATA-6基因7个外显子编码区域和两侧部分内含子序列,见表1。
外显子 | 上游引物(5′-3′) | 下游引物(5′-3′) | 扩增片段长度(bp) |
---|---|---|---|
1 | CCGTCCCCTCCCCACCCTCTTT | GAGATCGCGCGCGAGGAGGAAGCA | 361 |
2A | TGGAGGCGAGGTAGCGTACAG | CTCGGGTGCGAAGGGGCTCAG | 544 |
2B | CCCGCTCTGCTGCTCAGTT | CCATGGGCGGGCTGGGAGAGT | 591 |
2C | CACCTGCAGGGGTCGGGCAGT | AAACAGGGCCCGAGTGGAGCA | 616 |
3 | CTACTGGGGCGCTCCGGGTGT | AGCGGGTGGGCGTTGGAACAG | 583 |
4 | TGGAGAAGAAACCAGGGATGA | TGCATTCAAATTTTTCACTTGAG | 590 |
5-6 | CGGCGGCCGGGTTCTTTTA | AACCATAAAAAAATGATACCGATCT | 619 |
7 | TGGCCAGGGTCAGGTCAGTGG | GAGTGGCCCAAGCGACCAGTT | 610 |
(2)目的片段的扩增:以基因组DNA为模板,对GATA-6基因全部外显子和部分内含子进行PCR扩增。GATA-6 P1、P2A、P2B、P2C、P3、P7的反应体系如下:双蒸水(ddH2O) 2.74 μL,2×GC Buffer I 5 μL,dNTP 0.2 μL,Primer 1 μL,Taq酶0.06 μL,DNA模板1 μL。反应条件:95 ℃预变性2 min,96 ℃变性10 s,72 ℃退火、延伸4 min,共35个循环,反应终止后置4 ℃保存。GATA-6 P4,P5-6的反应体系:ddH2O 6.54 μL,dNTP 0.2 μL,氯化镁(MgCl2) 0.2 μL,Primer(s) 1 μL,HotTaq 0.06 μL,DNA模板1 μL。
反应条件:95 ℃预变性2 min,94 ℃变性20 s、62 ℃40 s,72 ℃延伸2 min,11个循环(退火温度依次降低0.5 ℃/循环);94 ℃变性20 s、56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,24个循环,共计35个循环,反应终止后置4 ℃冰箱保存。
(3)PCR产物纯化:应用虾碱酶(SAP)和外切酶(Exon-I)纯化PCR产物。筛除PCR产物中的各种离子、脱氧核苷三磷酸和小片段寡聚核苷酸,纯化目的片段;取2 μL PCR纯化产物以琼脂糖凝胶电泳定量,以备测序。
(4)目的片段DNA测序:将GATA-6基因组DNA的PCR纯化产物在ABI Genetic Analyzer 3100型(美国)全自动DNA测序仪中进行测序;将发现突变的样本重复上述PCR扩增、纯化和正反向测序,验证测序结果的可靠性和重复性。
(5)测序结果的分析:应用Chromas 2.21软件观察结果,利用NCBI BLAST程序,将测序结果与GenBank人GATA-6基因组DNA序列对比,分析有无碱基变化。与PubMed文献数据库、SNP数据库及已公布的人GATA-6基因变异位点进行比对、分析,找出基因的突变位点。
(6)突变氨基酸保守性分析:登陆Genbank数据库,获得多物种GATA-6蛋白质氨基酸序列,应用Cluster W软件分析突变氨基酸的保守性。
(1)质粒、菌株野生型pcDNA3.1(+)-hGATA-6质粒由Prof.Hiroyuki Yamagishi(Division of Pediatric Car-diology Department of Pediatrics Keio University School of Medicine)惠赠,pcDNA3.1(+)购自上海酶研生物科技有限公司。
(2)靶基因名称、突变信息和表达载体:靶基因名称和突变信息:hGATA-6;GATA-6-G245R:第733位碱基突变,G→C即p.Gly245àArg,G245R。
(3)GATA-6-G245R定点突变PCR扩增,将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序并进行序列比对。
(1)载体和细胞株心房利钠因子荧光素酶(ANF-luciferase)报告基因质粒由上海市儿童医院沈捷教授惠赠;CMV-LacZ质粒载体由牛津大学Bhattacharya′s教授馈赠;HEK293T及Hela细胞株购自中科院上海细胞所。
(2)将不同的质粒载体组合(WT+ANF-luciferase和G245R+ANF-luciferase,其中WT/G245R转录剂量为20 ng,ANF-luciferase剂量为100 ng)共转染至HEK293T细胞,并以共转染的CMV-LacZ(20ng)作为内参。通过对下游luciferase荧光素酶活性的检测对比野生型GATA-6基因和G245R 2个突变基因的转录活性。
应用SPSS 21.0软件进行分析。以共转染的CMV-LacZ进行β-半乳糖苷酶活性的检测作为内参,将每孔luciferase的值/Lac Z的值进行标准化处理,实验数据是2次独立实验的平均值。2组间指标比较采用独立样本t检验,P<0.001为差异有统计学意义。
在1例右心室双出口患儿中发现GATA-6基因的错义突变。突变位点:GATA-6基因第2外显子区c.733G>C,突变使第245位的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)取代(p.Gly245Arg,G245R),见图1。
对发现的突变进行GATA-6基因编码氨基酸多物种序列比对。结果显示GATA-6基因第245位甘氨酸在进化上高度保守,见图2。
采用基于GATA-6转录因子结合元件(ANF)驱动下游靶基因表达的检测体系。在该检测系统中,GATA-6作为转录因子结合ANF启动子,促进报告基因(luciferase)的表达,通过检测报告基因产物luciferase荧光素酶活性,反映转录因子转录激活功能。将不同的质粒载体组合(WT+ANF-luciferase和G245R+ANF- luciferase,其中WT/G245R转录剂量为20 ng,ANF-luciferase剂量为100 ng)共转染至HEK293T细胞,并以共转染的CMV-LacZ(20 ng)作为内参。通过对下游luciferase荧光素酶活性的检测发现:对比野生型GATA-6基因和G245R突变基因的转录活性明显下降。GATA-6-G245R比野生型GATA-6下降41.3%,二者比较差异有统计学意义(t=7.75,P<0.001),见图3。
注:对照组pcDNA3.1(+)设为1;WT:野生型;突变型GATA6-G245R与WT比较,aP<0.05 Control pcDNA3.1(+) was set at 1;WT:wild type;mutant GATA6-G245R compared with WT,aP<0.05
先心病是在心脏发育过程中与心脏发育相关的基因发生异常和环境因素的共同作用导致的先天性心脏结构畸形[2,3]。研究表明转录因子在发育的心脏组织中表达,参与和影响心脏的发育[4]。转录因子间通过精确的调控控制心脏的正常发育,任何一个转录因子发生异常均有可能发生心脏畸形。
转录因子GATA-6属于心脏前体细胞,是心脏细胞分化和发育过程中的重要转录因子,是参与心脏圆锥动脉干畸形致病的主要候选基因之一[5,6,7]。人类GATA-6基因位于染色体18q11.1~q11.2,其包括7个外显子,长34 812 bp,编码595个氨基酸。GATA-6与GATA家族基因具有相同的蛋白结构:由转录激活域(transcriptional activation domain,TAD)、N端锌指结构(N-Zinc finger,NZF)、C端锌指结构(C-Zinc finger,CZF)和核定位信号(nuclear localization signal,NLS)3个部分组成。TAD位于氨基末端,其是GATA家族基因转录激活所必需;CZF直接结合DNA,NZF虽然不能结合DNA,但其能影响DNA结合的稳定性、特异性及转录因子的转录活性;核定位信号为核蛋白进入细胞核所必需[8]。CZF可通过与转录因子Hand2、MEF和Nkx2.5相互作用[9,10,11]。GATA-6蛋白结构的NZF定位在389-439位氨基酸,CZF定位在443-494位氨基,核定位信号定位在484-494位氨基酸,而该蛋白的TAD从第147位氨基酸开始编码至381位氨基酸,GATA-4、GATA-5与其具有高度同源结构,不同的是该二者TAD均从第1位氨基酸开始编码。
转录因子GATA-6对胚胎心脏圆锥动脉干的发育至关重要,通过动物模型的原位杂交技术证实,在胚胎发育中GATA-6基因大量表达于心脏神经嵴,其不仅调节心脏神经嵴平滑肌细胞的分化,并且通过信号转导与神经嵴来源的细胞相互作用,调节主肺动脉分隔的发育[12]。在野生型胚胎中,孕9.5 d时GATA-6 mRNA最早发现在心脏流出道,同时在心房、心室心肌细胞也有表达;孕11.5 d时,GATA-6在升主动脉、肺动脉平滑肌的板层细胞和发育成流出道圆锥动脉干的心内膜垫有表达;孕12.5 d时,在主动脉、肺动脉、动脉导管的血管平滑肌细胞、心房、心室心肌细胞及圆锥动脉干的心内膜垫均有大量发现[13,14]。多项研究结果表明,GATA-6的调节分化影响到心脏圆锥动脉干的发育,GATA-6基因敲除纯合子小鼠导致内、外胚层发育缺陷而致小鼠胚胎死亡[15,16],而在血管平滑肌和心脏神经嵴细胞部分失活GATA-6基因则导致圆锥动脉干发育异常,小鼠胚胎心脏可发生永存动脉干、主动脉弓中断、右心室双出口[12]。
本研究对32例单纯性圆锥动脉干畸形患儿进行了GATA-6基因的突变筛查,结果在1例右心室双出口患儿中发现1个错义突变,突变使转录因子蛋白第245位的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)取代(p.Gly245Arg,G245R)。GATA-6-G245R位于TAD,突变导致了氨基酸从非极性、疏水性氨基酸到碱性氨基酸改变,推测其可能影响蛋白质分子空间结构中盐键、空间位阻和构象的变化,进而影响其转录激活功能。在体外转录激活功能的检测功能研究显示,GATA-6-G245R突变降低了下游靶基因ANF luciferase的转录活性,使其基因产物转录激活功能明显下降,转录因子GATA-6作为核内的转录因子,与下游靶基因的GATA结合位点结合调控靶基因的表达,GATA-6亦与其他转录因子相互作用,调控下游基因ANF、BNP等的表达[17]。同时,转录因子GATA-6也可通过Sema3C/Plxn2、BMP/Smad等信号通路来调控胚胎期心脏流出道的发育[18]。Kodo等[6]研究发现永存动脉干患者转录因子GATA-6在锌指结构和核定位信号区域的突变(N466H和E486del),研究表明GATA-6基因突变使其不能转录其下游基因,直接破坏了Sema3C/Plxn2信号的调节过程,最终发生了心脏流出道畸形,同时研究证实了动物模型中GATA-6下游基因Sema3C被GATA-6调节,从而最终导致心脏流出道发育畸形。Lin等[19]分别在1例房间隔缺损和1例法洛四联症患者发现GATA-6基因TAD相同位点的S184N突变,研究显示该位点突变导致GATA-6基因转录活性减低,影响了其下游基因ANF的转录。Maitra等[20]在1例法洛四联症患者和1例房室间隔缺损患者中亦发现了2个新的错义突变,即A178V和L198V,并证实了A178V的突变导致了GATA-6基因转录活性增强。结合本研究结果提示了转录因子GATA-6-G245R突变使基因产物转录激活作用明显下降,从而影响了GATA-6基因产物的生物功能。
综上,本研究在单纯性圆锥动脉干畸形患儿中进行GATA-6基因突变筛查,发现右心室双出口患儿GATA-6 c.733G>C(p.G245R)突变。通过对GATA-6-G245R突变基因的转录活性检测,发现其突变使基因产物转录激活作用明显下降,从而影响了GATA-6基因产物的生物功能,推测转录因子GATA-6突变与单纯性圆锥动脉干畸形发生相关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突