探讨补充牛乳铁蛋白(bLF)对早产大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型肠道黏膜组织的保护作用及对炎性因子表达的影响，为补充bLF预防NEC提供理论依据。
SD早产大鼠随机分为4组，每组25只。对照组：单纯人工喂养；模型组：人工喂养＋脂多糖(LPS)灌胃＋缺氧刺激；高剂量bLF干预组：每天给予bLF(7g/L)＋人工喂养＋LPS灌胃＋缺氧刺激；低剂量bLF干预组：每天给予bLF(2 g/L)＋人工喂养＋LPS灌胃＋缺氧刺激。应用HE染色进行组织病理学分析。酶联免疫吸附法(ELISA)检测肠道黏膜组织白细胞介素(IL)-1β和IL-6的表达水平。
(1)形态学观察：模型组大鼠肠壁菲薄，肠腔可见不同程度积气、积液。镜下见肠道组织坏死严重，肠壁绒毛脱落，腺体排列紊乱，上皮细胞水肿明显，固有层和黏膜下层重度水肿、分离，大量炎性细胞浸润。高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组大鼠上述表现减轻，对照组无明显异常。(2)肠道组织炎性因子IL-1β、IL-6的表达：模型组大鼠肠道黏膜组织中IL-1β和IL-6的表达水平[(380.89±20.25) ng/L，(485.12±31.44) ng/L]均高于对照组[(270.69±45.58) ng/L，(212.62±89.46) ng/L]，差异均有统计学意义(q＝9.785、14.030，均P<0.01)。缺氧和LPS刺激大鼠经过bLF喂养，回肠黏膜组织中IL-1β和IL-6的表达被显著抑制，差异均有统计学意义(IL-1β：q＝9.105、8.761，均P<0.01; IL-6：q＝8.175、8.996，均P<0.01)。高剂量bLF干预组与低剂量bLF干预组IL-1β和IL-6的表达差异均无统计学意义(IL-1β：q＝－0.084，P>0.05；IL-6：q＝－1.140，P>0.05)。
经肠道补充bLF可减轻早产SD大鼠NEC模型肠道组织的损伤程度，并抑制肠道组织IL-1β和IL-6炎性因子的表达，对早产SD大鼠肠道组织有一定的保护作用。
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坏死性小肠结肠炎(NEC)是早产儿，特别是极低出生体质量儿(VLBW)和超低出生体质量儿(ELBW)致死或致残的主要疾病之一[1]。同时，NEC也是导致VLBW和ELBW早产儿发生远期神经发育障碍的高危因素[2,3]。尽管在过去几十年中新生儿学方面取得了长足进步，死于肺部原因、发育不成熟、感染和中枢神经系统损伤的早产儿有所减少，但与NEC相关的发病率和病死率并无变化[4,5]。
乳铁蛋白(LF)是母乳中的重要活性成分，具有抗细菌、病毒、真菌，调节肠道菌群和免疫调节等作用，对于防治新生儿败血症和NEC具有很重要的作用[6,7,8,9]。因为牛乳铁蛋白(bLF)与人乳铁蛋白(hLF)的序列同源性高达77%，所以bLF添加至婴儿配方奶中或经肠道补充，可发挥类似hLF的生物活性[10,11]。研究表明，对早产儿肠内补充bLF可降低晚发型脓毒症和NEC的发生率，但仍存在一些争议，如剂量效应和对炎性反应的调节机制等，确切机制尚不完全清楚[9,10,11,12]。为进一步阐明NEC发生发展过程中bLF所扮演的角色，本研究旨在通过制作早产大鼠NEC模型，观察补充不同剂量bLF对肠道促炎因子白细胞介素(IL)-1β和IL-6表达的影响，为补充bLF防治NEC提供理论依据。
本研究已通过解放军总医院第七医学中心(原陆军总医院)动物实验伦理审查(批准文号：2017-065)。选择由维通利华公司提供的清洁级SD大鼠孕鼠，提前1 d进行剖宫产取得新生早产SD大鼠，雌雄不限，体质量为5～8 g。
提前1 d剖宫产获得SD大鼠早产鼠100只，按随机数字表法分成4组。对照组(25只)只进行人工喂养；NEC模型组(25只)进行人工喂养＋脂多糖(LPS)灌胃＋缺氧刺激；高剂量bLF干预组(25只)每天给予bLF(7 g/L)＋人工喂养＋LPS灌胃＋缺氧刺激；低剂量bLF干预组(25只)每天给予bLF(2 g/L)＋人工喂养＋LPS灌胃＋缺氧刺激。
将上述早产SD大鼠分组后，放在新生儿培养箱内，新生儿培养箱保持45%～60%的湿度，温度保持在36～37 ℃。新生早产SD大鼠使用鼠乳替代品灌胃喂养。
参考Auestad等[13]研究进行鼠乳替代品配制，乳鼠替代品的具体配制方法如下：在40 mL蒸馏水中放入10 g蛋白质粉、4.5 g配方奶粉混合均匀，然后加入60 mL中长链脂肪乳C8-24V，即可配成100 mL鼠乳替代品。每次喂养时，经口缓慢插入灌胃针，将鼠乳替代品注入胃内，第1天喂养量为0.1 mL，每4 h喂养1次，第2天喂养量增加至0.2 mL，喂养频率不变，如能耐受喂养，以后每天增加0.1 mL/次，共人工喂养5 d。
从早产SD大鼠出生第3天开始，进行缺氧刺激。在自制缺氧箱中充入纯氮气，测氧仪置于缺氧箱出口处，矫正测氧仪后，打开氮气阀门，当缺氧箱氧体积分数为0时，放入早产SD大鼠，待测氧仪再次检测缺氧箱内氧体积分数为0时开始计时，90 s后关闭氮气阀门，其后取出大鼠，将其置于培养箱。
用灭菌注射用水将LPS稀释为10 g/L的储存液，置于4 ℃冰箱内，避光保存。早产SD大鼠出生第3天开始，每日上午8∶00，给早产SD大鼠喂养乳鼠替代品后，立即胃内灌注LPS 4 mg/kg，每日1次，连续3 d。
取2份配制完成的鼠乳替代品10 mL，分别加入70 mg、20 mg乳铁蛋白粉(北京美正生物科技有限公司)，配制成bLF质量浓度分别7 g/L及2 g/L的鼠乳替代品，现配现用。自出生后人工喂养开始，bLF干预组即开始予bLF。
称取早产鼠出生时体质量，且每日定时称取体质量并记录，精确到0.1 g。所有新生早产SD大鼠在造模3 d后空腹12 h，然后采取断颈法处死。处死后立即在冰袋上解剖，留取回肠组织，按标本要求在40 g/L多聚甲醛中固定并置于-80 ℃冰箱中保存。
将留存于40 g/L多聚甲醛中的肠道标本脱水后石蜡包埋，作5 μm连续切片，常规HE染色，在普通光镜4×10倍视野下观察。肠道组织病理及NEC严重程度评分参考文献标准进行双盲法评分[14]，0分：肠道绒毛及上皮完整；1分：轻微黏膜下或固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和/或固有层分离；3分：重度黏膜下和/或固有层分离，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠透壁坏死。病理评分≥2分者视为NEC肠道损伤。
取回肠部分黏膜组织，按照质量∶体积为1∶9的比例加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)，匀浆破碎，4 ℃放置0.5 h后，置入离心管中，4 ℃，10 000×g离心5 min取上清。用ExCall Elisa试剂盒(吉泰依科赛，上海)进行IL-1β(IL-1β ELISA Kit)、IL-6(IL-6 ELISA Kit)的检测。
采用SAS 9.4(SAS Studio Online)进行统计分析。计量资料用
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，通过构建广义线性模型进行组间差异分析及两两比较。计数资料以例数(%)表示，组间采用χ2检验，不符合χ2检验条件的采用Fisher′s精确概率法。有序多分类资料的比较采用秩和检验(Wilcoxon检验法)，P<0.05为差异有统计学意义。
对照组、模型组、高剂量bLF干预组、低剂量bLF干预组在第2天后均不同程度出现精神反应差，活动减少，对刺激反应迟钝等情况；4组早产大鼠第3天后出现不同程度腹胀、皮肤苍白，皮下脂肪减少，皮肤松弛和弹性较差等现象，模型组、高剂量bLF干预组、低剂量bLF干预组甚至出现腹部发绀，排黄绿色稀便情况。研究过程中，各组大鼠均陆续出现死亡。对照组共死亡3只，存活率为88.0%，模型组死亡13只，存活率48.0%，高剂量bLF干预组死亡9只，存活率为64.0%，低剂量bLF干预组死亡11只，存活率56.0%。4组存活率比较差异有统计学意义(χ2＝10.233，P＝0.16)。4组大鼠出生时体质量及造模结束时体质量比较差异无统计意义(均P>0.05)，见表1。
对照组、模型组、高剂量bLF干预组和低bLF干预组早产大鼠体质量比较 (g，
±s)
Comparison of body weight of preterm rats in control group，model group，high dose bLF intervention group and low dose bLF intervention group (g，
±s)
对照组、模型组、高剂量bLF干预组和低bLF干预组早产大鼠体质量比较 (g，±s)
Comparison of body weight of preterm rats in control group，model group，high dose bLF intervention group and low dose bLF intervention group (g，±s)
| 组别 | 只数 | 出生时体质量 | 造模后体质量 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 22 | 6.1±1.5 | 13.4±3.1 |
| 模型组 | 12 | 5.9±1.7 | 12.5±2.8 |
| 高剂量bLF干预组 | 16 | 5.7±1.9 | 12.9±3.3 |
| 低剂量bLF干预组 | 14 | 6.0±1.3 | 13.2±3.4 |
| F值 | 0.201 | 0.232 | |
| P值 | 0.896 | 0.874 |
对照组早产SD大鼠空肠为白色，回肠为黄色，肠壁薄，弹性稍差，无明显积气、积液出现。模型组早产大鼠胃潴留明显，空肠为黄白色，回肠为黄黑色，肠壁菲薄，肠腔可见不同程度的积气、积液，严重者可呈串珠样，部分可见腹腔积液。高剂量bLF干预组、低剂量bLF干预组早产SD大鼠可见轻度胃潴留，空肠为黄色，结肠部分可见红黑，肠壁薄，弹性差，未见明显积气、积液。
对照组早产大鼠回肠肠道黏膜组织结构清晰，绒毛高耸，上皮细胞无水肿或轻度水肿，腺体排列规则，固有层和黏膜下层无水肿或轻度水肿(图1A)。模型组早产大鼠回肠肠道组织坏死程度重，肠绒毛普遍较短，严重的可出现脱落、消失，上皮细胞水肿明显，隐窝排列紊乱消失，肌层变薄，固有层和黏膜下层重度水肿、分离，大量炎性细胞浸润(图1B)。高剂量bLF干预组、低剂量bLF干预组早产大鼠回肠肠道黏膜组织部分坏死，肠壁绒毛充血、水肿、脱落较轻，腺体排列稍紊乱，固有层和黏膜下层中度水肿，可见炎性细胞浸润(图1C、图1D)。病理学评分统计结果显示，模型组、高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组的评分均高于对照组，差异均有统计学意义(Z＝5.002、4.102、4.706，均P<0.01)。高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组的评分均低于模型组，差异均有统计学意义(Z＝3.361、2.525，均P<0.05)。高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组的病例评分比较差异无统计学意义(Z＝1.064，P>0.05)，见图2。
在缺氧和LPS刺激3 d后，4组IL-1β和IL-6表达水平比较差异均有统计意义(均P<0.01)。模型组早产大鼠肠道组织中IL-1β和IL-6的表达高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。无论是高剂量bLF干预组还是低剂量bLF干预组，早产大鼠回肠肠道黏膜组织中IL-1β和IL-6的表达被显著抑制，明显低于模型组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组早产大鼠的L-1β表达水平与对照组比较，差异均无统计学意义(q＝0.105、0.190，均P>0.05)。尽管高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组早产大鼠较模型组IL-6的表达水平低，但仍高于对照组，差异均有统计学意义(q＝5.823、4.376，均P<0.05)。高剂量bLF干预组与低剂量bLF干预组IL-1β和IL-6的表达比较差异均无统计学意义(IL-1β：q＝－0.084，P>0.05；IL-6：q＝－1.140，P>0.05)，见表2。
对照组、模型组、高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组大鼠肠道炎性因子表达水平比较 (ng/L，
±s)
Comparison of intestinal inflammatory factors in rats in control group，model group，high dose bLF intervention group and low dose bLF intervention group (ng/L，
±s)
对照组、模型组、高剂量bLF干预组和低剂量bLF干预组大鼠肠道炎性因子表达水平比较 (ng/L，±s)
Comparison of intestinal inflammatory factors in rats in control group，model group，high dose bLF intervention group and low dose bLF intervention group (ng/L，±s)
| 组别 | 只数 | IL-1β | IL-6 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 22 | 270.69±45.58 | 212.62±89.46 |
| 模型组 | 12 | 380.89±20.25a | 485.12±31.44a |
| 高剂量bLF干预组 | 16 | 271.77±40.21b | 316.16±82.31ab |
| 低剂量bLF干预组 | 14 | 272.73±59.35b | 293.59±73.86ab |
| F值 | 19.72 | 33.03 | |
| P值 | <0.01 | 0.00 |
注：IL：白细胞介素；a与对照组比较，q＝9.785、14.030、5.823、4.376，均P<0.01；b与模型组比较，q＝9.105、8.175、8.761、8.996，均P<0.01 IL：interleukin；acompared with control group，q＝9.785，14.030，5.823，4.376，all P<0.01；bcompared with model group，q＝9.105，8.175，8.761，8.996，all P<0.01
既往研究表明新生大鼠是较理想的制作NEC模型的实验动物之一，具有易出现腹胀、血便及回肠和结肠易受累等特点，与NEC临床表现相似[15]。本研究在人工喂养的基础上，采用缺氧和LPS灌注来诱导早产大鼠NEC，包括了NEC的发病危险因素，如早产、缺氧缺血、配方奶喂养和感染等，动物临床症状和肠道组织病理学改变接近NEC。结果表明，对照组采用人工喂养，大鼠也出现精神状态不佳、反应差和腹胀等情况，可能与人工喂养时每3 h通过中心静脉导管经食管插入胃中的喂养方式有关，这种喂养方式对小鼠产生一定程度刺激，侵入性的操作易导致口腔出血、误入气管和食管穿孔，对小鼠造成损伤[16]。而经过缺氧刺激和LPS灌胃的小鼠还出现腹部发绀和腹泻等情况，且有明显组织学异常。
本研究结果表明，补充bLF可抑制缺氧刺激、LPS灌胃诱导的NEC时IL-1β、IL-6的活化，且高剂量bLF与低剂量bLF的添加对于缺氧刺激、LPS灌胃早产大鼠的IL-1β、IL-6表达水平差异无统计学意义。本研究结果显示，补充bLF似乎对IL-1β的调节作用更加明显，因为bLF的补充使得缺氧刺激、LPS灌胃的大鼠IL-1β的组织浓度与对照组比较差异无统计学意义。既往研究也证实LF对小肠炎症的调节作用。据报道，不同来源的LF均可因其铁螯合活性而发挥抑菌作用，结合并中和革兰阴性菌细胞壁中的LPS，或与革兰阳性菌中的磷壁酸相互作用，这些相互作用导致膜损伤和细菌死亡，从而降低其促炎作用[10,17,18,19,20,21]。如重组人LF(r-hLF)和天然bLF的抗炎活性已在家兔福氏志贺菌感染模型和易感BALB/c小鼠中的鼠伤寒沙门菌模型中得到证实[20,21]。本研究中，bLF在缺氧刺激和LPS灌胃的大鼠中起到降低促炎因子IL-1β和IL-6的作用，可能与bLF和LPS结合，减少了LPS导致的炎症反应有关。
本研究表明，补充高剂量(7 g/L)bLF和低剂量(2 g/L)bLF对于IL-1β和IL-6的表达无明显影响。但是，Nguyen等[10]的体外细胞实验表明，低剂量的bLF(0.1～1.0 g/L)通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)促进细胞增殖，并抑制IL-8分泌和缺氧诱导因子(HIF-1α)的激活，提示了其抗炎作用；而高剂量的bLF(10 g/L)则表现为抑制细胞增殖、刺激IL-8释放，并且增加了HIF-1α的活性，与本研究并不完全一致。此外，bLF在体内和体外研究中及在不同的模型中对于炎性因子的表达，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6的调节作用也出现相互矛盾的结果，提示口服补充bLF在体内参与炎症调节的机制是复杂的，不仅仅是参与炎症调节的过程[18,22,23,24]。有研究表明，口服LF可通过胃中的胃蛋白酶和小肠中的胰蛋白酶进行酶促切割，LF在胃和小肠中经酶促切割后释放LF肽(LFcin)，对于细菌、真菌、病毒和寄生病原体也起到一定的抑制作用[25]。而值得一提的是，婴儿尤其是早产儿的消化道具有相对较高的pH值且分泌的胃蛋白酶水平较低，这使得hLF和bLF能完整地转运到上皮细胞中[26,27]。可见，对于早产儿、足月儿及成年人来说，LF经口服后可能会经历不同的变化过程，其抑制病原体、参与炎症调控的过程值得更深入的研究。本研究中，早产大鼠口服bLF后，bLF究竟在体内发生了怎样的变化，又是如何对于胃肠道内的病原体起作用的、怎样参与炎症调节机制，其对炎症过程的调节是否与剂量有关，仍需要进一步深入和细致的研究，LF在临床上的应用需要更加全面谨慎的考虑。
总之，通过人工喂养、LPS灌胃-缺氧方法可诱导早产SD大鼠肠组织发生接近早产儿NEC病理改变。经肠道补充bLF可减轻早产SD大鼠NEC模型肠道组织的损伤程度，并抑制肠道组织IL-1β和IL-6炎性因子的表达，对肠道组织有一定的保护作用。本研究所使用的高剂量bLF和低剂量bLF对于炎性因子IL-1β和IL-6炎性因子的表达无明显影响。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
