对一个临床诊断为少汗性外胚层发育不良患儿的外胚层发育不良候选基因进行二代测序，以期发现致病位点以明确诊断。
对家系中一例患儿的少汗性外胚层发育不良的候选基因进行二代测序，并利用Sanger测序法对筛选出的可疑致病突变进行验证，同时在家系中其他成员和100例无关联健康个体中检测此突变。
在患儿和其弟弟(亦为患者)中发现EDA c．300_301delCC(p.Pro101His fs*11)缺失移码突变，其母亲为该突变的携带者，其父亲和妹妹无突变。同时100例无关联正常个体均无此突变。
EDA基因c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)缺失移码突变可能是该家系中2例患儿罹患少汗性外胚层发育不良的主要原因。
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少汗性外胚层发育不良(HED)又称Christ－Siemens－Touraine综合征，是以汗腺、毛发及牙齿等外胚叶组织发育不全或形态缺陷为主要特征的遗传性皮肤疾病[1]，其典型的临床特点为无汗或少汗、毛发稀疏或全秃、少牙或牙形态异常等三联症[2]，发病率约为1/10万。该病具有较强的遗传异质性，其致病基因有EDA、EDAR、EDARADD和 WNT10A等，遗传方式包括X连锁隐性及常染色体显性或隐性遗传[3]。其中EDA基因变异导致的HED为最常见的一种[4]，为X连锁隐性遗传。EDA基因信号通路在皮肤早期发育中发挥重要作用，其突变会引起外胚层附属物的减少或改变[5]。患者主要为男性半合子，表型明显且多数较重；女性杂合子一般为致病基因携带者，无症状或症状不明显[6]。本研究对一个HED家系中的患儿外胚层发育不良的候选基因进行二代测序，而后采用Sanger测序法对二代测序筛选出的可疑致病位点在患儿和家系其他成员中进行验证，以明确诊断，现报道如下。
患儿，男，8岁，因出生后高热、不出汗就诊。查体：患儿头发稀疏，细软色淡；眉毛缺如，睫毛稀少，汗毛稀疏；前额略突出，皮肤干燥，头面部及躯干部皮肤脱屑，脱皮处皮肤红软，细嫩；无掌跖角化，指/(趾)甲正常；鼻子塌陷呈鞍状，双侧外耳招风状，脊柱无畸形，神经无异常，智力正常。口腔检查：上下颌骨齿槽发育不良，上颌仅存4枚牙齿，下颌仅存3枚，牙齿呈锥状，下颌骨明显突出。皮肤组织学检查：表皮轻度萎缩，大小汗腺、毛囊、皮脂腺稀少。发汗实验阴性。患儿之弟表型与患儿相似，发汗实验亦为阴性，皮肤组织学检查显示汗腺、毛囊、皮脂腺稀少。患儿之父母和患儿之妹外观表型正常，头发黑，头发密度中等。患儿父亲方无家族史，患儿之姥姥头发偏稀少，其他不详。患儿父母否认怀孕前后有用药史，体健，非近亲。本研究经本院医学伦理委员会批准，并获患儿监护人知情同意及签署知情同意书。
根据知情同意原则，抽取家系成员静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用DNA提取试剂盒进行DNA抽提(DNeasy Tissue Kit DNA，Qiagen公司提供)。另随机数字法抽提100例无关联健康人的外周血基因组DNA作为对照。
(1)文库构建：采用Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0(Catalog No.4480441；美国Life Technologies公司)进行文库构建，为样品加上序列标签及测序接头。(2)乳液PCR和ISPs富集：采用Ion PGM Hi－Q View OT2 200 Template Kit(Catalog No.A27742；美国Life Technologies公司)在Ion OneTouch(美国Life Technologies公司)上进行乳液PCR，对模板阳性磁珠颗粒(Ion Sphere Particles，ISPs)在Ion OneTouch ES(美国Life Technologies公司)上进行富集。(3)Ion To－rrent PGM平台测序：采用Ion PGM Hi－Q View Sequencing 200 Kit v2(Catalog No.A30043；美国Life Technologies公司)及Ion Torrent 318芯片(Catalog No.4488146；美国Life Technologies公司)在Ion Torrent PGM平台上进行测序反应。检测基因包括AX1N2、EDA、EDA2R、EDAR、EDARADD、GJB6、WNT10A、PKP1、PVRL1、PVRL4、WDR35、HOXC13、IFT43、KRT85。
采用Ion Torrent Suite v3.0软件进行Ion Torrent数据提取、序列比对及SNVs和Indels提取，得到的SNVs和indels经dbSNP 138数据库、ExAC数据库、千人基因组数据库过滤，去除内含子上突变、同义突变、数据库中频率大于5%的变异，检索HGMD、NCBI等数据库匹配已报道的致病位点。对发现的致病变异和可疑致病突变用Sanger测序法进行验证。
PCR扩增患儿及其家系成员可疑突变位点区域。引物序列扩增位点为EDA基因c.300_301，正向引物为ACAGTAGCCGCCTGTCAGAG，反向引物为TCCCCAGGGAGTCTGGATTA，退火温度为60 ℃，产物长度为685 bp。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后溴化乙啶染色，置于紫外灯下观察条带。采用PCR产物直接进行双向测序的方法，样品纯化和序列分析均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，得出的序列与GenBank中健康人的序列(NG_ 009809.2)进行对比，以期发现突变位点。
使用在线软件mutationtaster(http：//www.mutationtaster.org/)对筛出的可疑变异的致病性进行预测分析。使用PhyloP(http：//compgen.bscb.cornell.edu/phast/)软件预测发生变异的序列的保守性。
二代测序检测到患儿在ChrX：68836452－68836453发生缺失移码突变即NM_001399.4(EDA)：c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)，使第101位氨基酸由脯氨酸变为组氨酸，并第111位氨基酸突变为终止密码子，翻译提前终止，生成了仅有110个氨基酸的截短蛋白。突变位点具体信息见表1。患儿Sanger测序与高通量测序结果一致。检测到患儿和患儿之弟EDA基因c.300_301delCC缺失移码突变。其父亲无此突变，其母亲为该突变携带者，患儿之妹无突变，见图1，图2，图3，图4，图5。
少汗性外胚层发育不良患儿突变位点具体信息
Specific information of mutation site in children with hypohidrotic ectodermal dysplasia
少汗性外胚层发育不良患儿突变位点具体信息
Specific information of mutation site in children with hypohidrotic ectodermal dysplasia
| 基因 | 染色体位置 | 转录本编号 | 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | 千人基因组 | ExAC | 致病性报道 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EDA | chrX：68836451 | NM_001399.4 | c.300_301delCC | p.Pro101His fs*11 | 无 | 无 | 无 |
经在线软件mutationtaster预测，EDA基因c．300_301delCC缺失移码变异有致病的可能性。PhyloP软件显示发生缺失变异的位点的保守性分别为0.72和0.15(数值越大，保守性越强，变异产生的危害越大)。
HED是一种外胚层发育异常导致外胚层衍生组织异常的先天性疾病，患者由于外胚层发育不良，累及发源于外胚层的皮肤及其附属结构如牙和眼，间或波及中枢神经系统[7]，因此，本病的临床表现多样。本研究中2例患儿皮肤发汗实验阴性，牙齿锥状，头发稀疏，且皮肤组织学检查显示汗腺发育不良，均与外胚层发育不良的临床症状相符合，通过二代测序技术对已知的外胚层发育不良的候选基因进行检测，经筛选发现患儿存在EDA基因c．300_301delCC缺失移码突变，在家系成员中验证后，发现患儿之弟亦存在该缺失移码突变，患儿之妹及其父亲无该位点突变，其母为该突变携带者。
EDA基因定位于Xq12－13.1，于1996年由Kere等克隆成功，共包括9个外显子，由于第2个外显子在RNA剪切过程中被剪切掉，故第2外显子不参与编码氨基酸[8]。EDA基因共有8种拼接体，结合EDAR的EDA－A1和XEDAR的EDA－A2是最常见的2种[9]。EDA基因编码产物为ectodysplasin－A蛋白，是一种Ⅲ型跨膜蛋白，被认为是肿瘤坏死因子超家族配体的成员之一[10,11]。该蛋白通过与受体EDAR结合，激活细胞内受体EDARADD，通过NF－κB信号通路对细胞进行调控。因此，EDA基因的突变可造成ectodysplasin－A蛋白缺陷，影响其与受体的结合，从而造成外胚层起源的器官发生缺陷。Ectodysplasin－A蛋白具有1个大的细胞外结构域、1个单一跨膜结构域和1个短小的细胞内结构域[12]。经检索HGMD数据库，已公布的与发病相关的各种EDA基因突变达237余种，其中95%的突变发生在第1，3，5，8，9外显子上[13]，它们主要位于蛋白结构的以下4个功能区域：(1)跨膜区与细胞外交界处；(2)酶裂解识别位点处，可能影响到ectodysplasin－A裂解；(3)胶原样三聚体区域；(4)肿瘤坏死因子(TNF)同源区域。
本研究中2例患儿均在EDA基因第1外显子上存在c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)缺失移码突变。该突变导致EDA基因编码的第101及第101位以后的氨基酸发生变异，使第111位氨基酸突变为终止密码子，导致编码提前终止，生成了110个氨基酸的截短蛋白。经检索HGMD、NCBI和ExAC数据库，暂无该变异报道。同时对100例无关联健康人进行该位点的检测，均未发现此突变。经mutationtaster预测，该缺失移码变异有致病的可能性。该患儿的EDA基因c.300_301delCC缺失移码突变位于第1外显子上，生成仅有110个氨基酸的截短蛋白。该移码突变不仅使第1外显子编码的第101位后的氨基酸性质发生改变，同时造成第1外显子后所有的氨基酸丢失，丢失的区域包括蛋白的很多重要功能区域，如胶原结构域、TNF同源结构域、碱性磷酸酶识别位点等。胶原结构域和TNF同源结构域的突变可破坏成对碱性氨基酸蛋白酶的共有序列，从而引起伴X染色体的HED[14]；胶原结构域的缺失会导致EDA的热稳定性降低，其临床表现为多种外胚层衍生结构数量的减少和功能的降低[15]。Callea等[4]报道EDA基因c.358G>A突变可导致外胚层发育不良，该变异导致第120密码子突变为终止密码子，造成翻译提前终止，生成仅有119个氨基酸的截短蛋白。Vasiliadis等[7]报道EDA基因c.394C>A突变亦为致病性突变，该变异导致翻译提前终止，生成仅有131个氨基酸的截短蛋白。以上生成119个和131个氨基酸的截短蛋白的变异均可导致外胚层发育不良的发生，亦可侧面的说明生成110个氨基酸的EDA基因c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)变异亦极大可能导致外胚层发育不良的发生。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的遗传变异分类标准与指南中的致病变异分级标准，EDA基因c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)无义突变属于非常强的致病性证据(PVS1)；经检索ExAC及千人基因组数据库中健康人群中均未发现该变异，属于中等致病性证据(PM2)；家系中存在EDA基因c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)变异的患者表型高度符合HED，属于支持证据(PP4)；根据遗传变异分类联合标准规则，1个PVS1和1个PM2和1个PP4，该变异可被认为是致病性的。EDA基因是X连锁隐性遗传，患儿母亲表型正常，为该突变携带者，患儿父亲和妹妹基因型正常，符合X连锁隐性遗传规律。经询问，患儿姥姥头发偏稀疏，其他无异常，因此推测患儿姥姥亦为以上变异的携带者。
本次研究中检出患儿EDA基因c.300_301delCC缺失移码突变，可能是该家系中2例患儿罹患HED的主要原因。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
