对确诊的6例原发性远端肾小管酸中毒(dRTA)的病例行基因型及临床表型的相关性分析。
对2017年11月至2019年8月确诊于华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院的6例dRTA患儿行病史资料采集及相关辅助检查，评估其生长发育情况，留取静脉全血进行Trio全外显子高通量测序，经全谱遗传病精准诊断云平台系统分析筛选和数据分析，对可疑突变进行Sanger测序验证，后应用蛋白预测软件进行蛋白功能预测。
6例患儿的临床症状、体征和辅助检查均符合dRTA的诊断，均表现为生长发育落后，1例患儿出现X型腿，1例患儿出现骨质疏松。辅助检查均提示低钾血症、代谢性酸中毒、碱性尿，3例患儿出现肾脏钙质沉着，2例患儿出现肾脏结石，所有患儿的父母亲均无临床表型。1例患儿为SLC4A1基因纯合突变[c.2102 (exon17) G>A，p.G701D]，为既往报道的常染色体隐性遗传高频突变位点，该患儿同时合并dRTA及溶血性贫血；3例为SLC4A1基因杂合突变，均为De novo突变[c.1766(exon14) G>A，p.R589H，c.1765 (exon14) C>T，p.R589C]，为既往报道的常染色体显性遗传高频突变位点，确诊年龄与肾脏影像学异常存在相关性。1例为ATP6V1B1基因复合杂合突变[c.806 (exon9) C >T，p.P269L；c.1153(exon12 ) C>A，p.P385T]，均为未见文献报道的新突变位点。1例为ATP6V0A4基因纯合无义突变[c.1899C>A，p.Y633X，208]，为未见文献报道的新突变位点。
SLC4A1、ATP6V1B1、ATP6V0A4是目前已明确的dRTA的主要致病基因，其突变特点及遗传方式与临床表型相关。基因检测可以对可疑的dRTA患者行早期分子诊断，有助于临床表型的筛查及个体化治疗。
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肾小管酸中毒(RTA)是一类由于近端肾小管HCO3-重吸收和/或远端肾小管泌H＋功能障碍所致的临床综合征。生化特点是血阴离子间隙正常的高血氯性代谢性酸中毒、反常性碱性尿和肾性钙质沉积[1]。RTA可分为原发性及继发性，儿童以原发性多见，成人以继发性更多见，多继发于结缔组织疾病或遗传代谢性疾病[2]。原发性RTA多见于儿童，分为4型：Ⅰ型(远端型)、Ⅱ型(近端型)、Ⅲ型(混合型)、Ⅳ型(高钾型)。Ⅰ型RTA[也称为远端肾小管酸中毒(dRTA)]由远端肾小管泌H＋障碍，尿NH4＋及可滴定酸排出减少引起，其临床表现为畏食、呕吐、腹泻、多饮多尿、生长发育迟缓，高氯低钾性阴离子间隙正常型代谢性酸中毒，酸中毒时尿pH值不低于5.5，代谢性骨病及肾结石、肾钙化[1]。该病的病因较复杂，临床表现多变，缺乏特异性的临床特征和辅助检查，因此临床上较易漏诊及误诊，但该病可累及多个系统及器官，若早期诊断和及时治疗可能会导致较严重的并发症。借助分子诊断技术，可以在早期对临床可疑病例进行诊断，及早干预，改善患者的预后。本研究对6例原发性dRTA患儿进行基因型及临床表型的相关性分析，有助于在临床中早期发现可疑病例，及早进行分子诊断，根据临床表型及基因型对患儿进行个体化管理。
对2017年11月至2019年8月确诊于华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院肾脏内科的6例dRTA患儿行分子诊断及临床相关性分析。本研究通过医院医学伦理委员会审批(批准文号：2017038)，患儿监护人均知情同意。
患儿均有身高、体质量明显落后，入院后辅助检查提示：低钾及代谢性酸中毒、反常性碱性尿；其中5例患儿存在肾脏结石或钙质沉着；除最小的1例患儿外，其余5例均出现尿中小分子蛋白尿β2微球蛋白显著升高，均未出现高钙尿症，未见血尿蛋白尿。患儿1确诊的年龄最大，4岁时在当地医院诊断"溶血性贫血"，后因"矮小症"在上海一家医院接受"生长激素"治疗，确诊时已出现X型腿，智力及听力检查正常，双肾彩超见肾脏结石形成，在后期随访过程中出现肾功能异常。患儿2确诊的年龄为6岁，确诊时下肢长骨片示骨质疏松，骨龄片提示骨龄落后，肾脏彩超见肾脏小结石形成，听力检查无异常，肾功能无异常。患儿3确诊时年龄<1岁，肾功能无异常，双肾彩超未见结石及钙质沉着。患儿4、5、6确诊的年龄均<2岁，肾脏彩超均提示肾脏钙质沉着，肾功能均无异常(表1)。在接受枸橼酸钾口服治疗后，6例患儿血气分析均恢复至正常，血钾基本恢复至正常。
远端肾小管酸中毒患儿6例的临床特征、实验室检查结果与基因检测结果
The clinical feature，laboratory finding and genetic mutations in the 6 patients of distal renal tubular acidosis
远端肾小管酸中毒患儿6例的临床特征、实验室检查结果与基因检测结果
The clinical feature，laboratory finding and genetic mutations in the 6 patients of distal renal tubular acidosis
| 指标 | 患儿1 | 患儿2 | 患儿3 | 患儿4 | 患儿5 | 患儿6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄 | 12岁6个月 | 6岁 | 8个月 | 1岁8个月 | 9个月 | 3个月 |
| 性别 | 男 | 男 | 男 | 女 | 女 | 女 |
| 主诉 | 四肢乏力0.5 d | 间断腹痛伴发热6 d | 间断腹泻1个月余 | 呕吐伴腹泻2 d | 间断发热3个月 | 纳差0.5个月 |
| 既往史 | 溶血性贫血 | 无特殊 | 无特殊 | 无特殊 | 无特殊 | 无特殊 |
| 身高(cm) | 140(<第3百分位)a | 111(第3百分位～第10百分位) a | 62(<第3百分位)a | 79(第3百分位～第10百分位) a | 63(<第3百分位)a | 52(<第3百分位)a |
| 体质量(kg) | 36.5(第3百分位～第10百分位) a | 15(<第3百分位)a | 5.0(<第3百分位)a | 8.5(<第3百分位)a | 6.0(<第3百分位)a | 4.9(<第3百分位)a |
| 血pH | 7.20 | 7.24 | 7.29 | 7.36 | 7.36 | 7.31 |
| 血HCO3－ (mmol/L) | 8.3 | 8.0 | 10.0 | 14.0 | 13.0 | 14.1 |
| 尿pH | 7.5 | 7.5 | 7.0 | 7.5 | 7.5 | 7.5 |
| 血清钾(mmol/L) | 1.99 | 3.10 | 3.21 | 3.10 | 3.22 | 2.79 |
| β2微球蛋白(mg/L) | 27.6 | 89.6 | 94.7 | 57.6 | 15.8 | <0.19 |
| 尿钙/肌酐 | 0.52 | 0.91 | 0.59 | 0.59 | 0.05 | 0.10 |
| B超 | 双肾多发性强回声团 | 双肾小结石 | 双肾集合系统分离 | 双肾髓质内细密，点状高回声 | 双肾髓质及肾上腺，高密度钙化影 | 双肾髓质回声增强，并肾髓质钙质沉积 |
| 骨病表现 | X型腿 | 骨质疏松 | 无 | 无 | 无 | 无 |
| 听力筛查 | 无异常 | 无异常 | 未查 | 脑干听觉电位正常 | 未查 | 脑干听觉电位正常 |
| 突变基因 | SLC4A1 | SLC4A1 | SLC4A1 | ATP6V1B1 | SLC4A1 | ATP6V0A4 |
| 突变位点 | c.2102G>A，p.G701D | c.1766G>A，p.R589H | c.1765C>T，p.R589C | c.806C>T，p.P269L；c.1153C>A，p.P385T， | c.1765C>T，p.R589C | c.1899C>A，p.Y633X，208 |
| 遗传方式 | AR | AD | AD | AR | AD | AR |
注：a为根据中国儿童青少年身高体质量百分数值表取值；AD：常染色体显性遗传；AR：常染色体隐性遗传 a the value is taken according to the percentage value table of body height and body mass of Chinese children and adolescents；AD：autosomal dominant inheritance；AR：autosomal recessive inheritance
征得患儿监护人同意后，经医院伦理委员会审批同意后抽取患儿及其父母静脉血行Trio全外显子基因测序，所有患儿基因检测均外送北京智因东方转化医学研究中心。全外显子组基因测序采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外显子捕获芯片进行高通量测序，经Illumina NovaSeq 6000系列测序仪测序完成(目标序列测序覆盖度不低于99%)，经全谱遗传病精准诊断云平台系统分析筛选，结合OMIN，MedGen数据库、健康人基因组数据库、已知4 000种遗传病临床特征数据库等数据库和根据ACMG基因变异分级体系进行数据分析，得到可疑突变，对目标序列进行PCR扩增后，经ABI3730测序仪进行Sanger测序验证，并经序列分析软件得到验证结果，后应用蛋白预测软件进行功能预测。
6例患儿的基因检测结果均为阳性(家系图及基因测序图见图1)，患儿1在SLC4A1基因的第17号外显子上发现了1个错义突变(c.2102G>A，p.G701D )，即第2 102号碱基由G突变为A，导致第701号位置氨基酸残基由甘氨酸突变为天冬氨酸，为常染色体隐性遗传(AR)纯合突变，其父母亲均为杂合突变，无临床表型，符合家系共分离的特点。
患儿2在SLC4A1基因的第14号外显子上发现了1个错义突变(c.1 766G>A，p.R589H)，即第1766号碱基由G突变为A，导致第589号位置氨基酸残基由精氨酸突变为组氨酸。患儿3及患儿5在与患儿2相同的位置上发现了1个错义突变(c.1765C>T，p.R589C)，即第1 765号碱基由C突变为T，同样导致第589号位置氨基酸残基的改变，由精氨酸突变为半胱氨酸，为常染色体显性遗传(AD)的高频突变位点，此3例患儿均为De novo突变，父母亲为野生型，无临床表型，符合家系共分离的特点。
患儿4在ATP6V1B1基因的第8号外显子上发现了1个错义突变(c.806C>T，p.P269L)，即第806号碱基由C突变为T，导致第269号位置氨基酸残基由脯氨酸突变为亮氨酸，其母亲该位点为杂合型；第12号外显子上发现了1个错义突变(c.1153C >A，p.P385T)，即第1 153号碱基由C突变为A，导致第385号位置氨基酸残基由脯氨酸突变为苏氨酸，其父亲该位点为杂合型，此2个位点均为未见报道的新发突变位点，突变位点位于深入研究的无良性变异的外显子功能域，千人基因组、dbSNP数据库、ExAC、ExAC东亚等数据库均未见收录，保守性及通过SIFT、Provean、polyphen2-HDIV等蛋白危害性预测软件预测为有害突变，健康人群基因组(MAF)数据库该突变为低频突变，结合患儿典型的临床表型及AR复合杂合遗传方式，推测该突变为致病突变位点。患儿为AR复合杂合突变，经家系验证，其父母亲均为杂合突变，无临床表型，符合家系共分离的特点。
患儿6在ATP6V0A4基因的第17号外显子上发现了1个无义突变(c.1899C>A，p.Y633X，208)，即第1 899号碱基由C突变为A，导致第633号位置氨基酸残基由酪氨酸突变为终止密码子，提前终止蛋白质的转录。该突变未见文献报道，但突变可导致基因功能的缺失，具有超强致病性，MAF<0.005为低频突变，保守性及蛋白致病软件预测为有害突变。该患儿为AR纯合突变，父母亲均为杂合突变，无临床表型，符合家系共分离的特点。
目前研究证实在肾小管的α-闰细胞中，胞质碳酸酐酶(CAⅡ)使二氧化碳分解为HCO3－及H＋，H＋通过顶膜上的H＋-ATP酶分泌至肾小管管腔中，HCO3－通过基底外侧膜上的离子转运体1(anion exchanger 1，AE1)进行HCO3－/Cl－交换，这3个分子的缺陷都可以影响肾小管的酸化功能[3]，研究已经证实编码AE1的SLC4A1和编码H＋-ATPase的ATP6V1B1、ATP6V0A4基因是dRTA的主要突变基因，近年也有文献报道FOXI1和WDR72也被证实为dRTA的罕见致病基因[4,5,6]。
SLC4A1基因编码AE1(MIM 109270)，含有20个外显子，位于第17号染色体。AE1有2种亚型，eAE1表达于红细胞中，在维持红细胞的正常形态及气体转运功能中起重要作用，kAE1表达于肾脏，其正常的离子转运活性及正常定位在肾小管的泌酸功能中起非常重要的作用[7]。SLC4A1基因AD遗传方式一般见于高加索人群，目前已报道的常见突变为R589H、R589C、R589S、S613P、R901X、△V850、G609R、S667F、A888LX等，临床表型一般轻于AR遗传的患者，这可能与AE1仍有Cl-转运活性有关[3]。而AR遗传在东南亚多见，目前已报道的常见突变为：G701D、V488M、A858D、R602H、S773P、SAO等[8]。SLC4A1基因同时编码eAE1和kAE1的功能域中发生突变可以导致dRTA和/或血液系统疾病的同时发生，如遗传性溶血性贫血[如遗传性球形红细胞增多症(HS)、东南亚卵圆形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多症等]，SAO杂合子不引起dRTA，与其他突变组合成复合杂合突变时可同时导致dRTA及东南亚卵圆形红细胞增多症，dRTA表型通常较轻，纯合突变患者血液系统表型严重[9,10]。据文献报道，dRTA及遗传性溶血性贫血可同时存在于出现等位基因的突变，大部分患者溶血性贫血程度较轻，受突变所在的结构域及突变类型所决定，如在纯合的G701D突变患儿血液中可检测到微小红细胞、球形红细胞、卵圆形红细胞及椭圆形红细胞的存在，但目前没有文献报道证实其导致溶血性贫血的明确依据[11]，而A858D、V488M及Ser477X纯合突变可导致严重的溶血性贫血和dRTA[10,11,12,13]。目前国内还没有dRTA合并溶血性贫血的病例报道。
G701D突变是东南亚国家dRTA的常见突变类型，国内也有报道[14]。患儿1为SLC4A1的G701D纯合突变，就诊时生长发育落后、代谢性酸中毒、低钾血症、肾结石、骨病等临床表现均明显，并在12岁8个月时已进展至慢性肾脏病2期，在随诊的过程中，并感染的情况下仍出现反复的低钾血症及代谢性酸中毒，符合AR遗传方式临床表型重的特点，且该患儿除dRTA外既往有溶血性贫血病史，但溶血性贫血病因不明，现就诊时血红蛋白在正常范围，可能与G701D的纯合突变导致体内存在的异型红细胞在感染等疾病状态下导致溶血的发生相关，必要时需进一步完善血液系统相关检查。
患儿2、3、5存在导致蛋白质水平第589号位置氨基酸改变的De novo突变，为AD遗传方式的高频突变位点。患儿2并双肾小结石，患儿5伴肾脏钙质沉积，而患儿3确诊时年龄较小，双肾无钙化。这3例患儿临床表型均轻于患儿1，肾功能无异常，通过治疗能得到理想的血pH及血钾水平，证实AD遗传方式的患儿临床表型相对轻的特点。
空泡H＋-ATP酶(vacuolar H＋-ATPase)主要表达于肾脏α-闰细胞的顶膜中，在内耳中也有表达[15]。ATP6V1B1基因(MIM 192132)编码空泡H＋-ATP酶的B1亚单位，由14个外显子组成，位于人类第2号染色体，ATP6V0A4基因(MIM 605239)编码空泡H＋-ATP酶的a4单位，由23个外显子组成，位于人类第7号染色体，这2个基因突变时可以导致空泡H＋-ATP酶的结构和活性异常，引起dRTA和/或感音性耳聋(sensorineural hearing loss，SNHL)，前者可致早发性SNHL，出现听力异常的年龄多<10岁，出现听力异常的比例可高达88%，而后者通常引起晚发性SNHL或不引起SNHL，出现听力异常的比例为36%，但也有后者所致的早发性SNHL的报道[16,17]。这2个基因目前仅报道为AR遗传方式。患儿4为ATP6V1B1基因复合杂合突变，P269L及P385T均为未见文献报道的错义突变，均位于外显子功能域，致病性分析及通过蛋白危害性预测软件预测为有害突变。患儿因年龄小不能配合纯音测听检查，脑干听觉诱发电位筛查无异常，但仍需密切关注听力。患儿6为ATP6V0A4基因纯合突变，该突变导致提前终止蛋白质的转录，未见文献报道，但可导致基因功能的缺失，具有超强致病性，致病性分析及通过蛋白致病软件预测为有害突变。ATP6V0A4基因突变的患儿确诊年龄一般<1岁，且低钾血症较为显著[18]，该患儿3个月大时就被确诊，存在显著的生长发育落后、低钾血症及代谢性酸中毒，就诊时已有肾钙化，临床表型重，后续也需关注其听力情况。
既往研究证实，大部分dRTA患者可以找到致病基因，全外显子家系基因测序在原发性dRTA的诊断中起着重要的作用[19]，35%的儿童患者及82%的成人患者可进展至慢性肾脏病(2期至4期)，目前暂时没有患者进展至慢性肾脏病5期的文献报道，在明确致病基因突变的患者中肾功能受损概率更大。ATP6V1B1基因、ATP6V0A4基因突变者较SLC4A1基因突变者表型一般更严重，确诊的年龄小，听力受损大多发生于ATP6V1B1基因突变者[4]。80%～90%的患儿可出现肾钙化或结石，SLC4A1基因突变者的肾结石表现更为突出。本中心6例患儿均检测出突变基因，其中4例SLC4A1基因突变者中2例出现肾结石，年龄最大的患儿进展至慢性肾脏病2期，而ATP6V1B1、ATP6V0A4基因突变者均出现肾钙化，确诊年龄小，临床表型较重。
dRTA患者由于过度的骨矿化与慢性代谢性酸中毒导致生长发育落后、佝偻病表现，电解质的平衡在其生长发育及肾脏功能维持中起重要作用，给予碱化治疗后大多数患者可以得到生长追赶[17]，主要的治疗为钾剂，枸橼酸钾在低钾性电解质紊乱时可作为优先选择方案，枸橼酸可以络合钙剂，减少肾脏结石的产生和减少肾脏中不溶解钙盐的沉积，但不能完全改善肾脏钙化。在患者出现严重的消化道反应时，碳酸氢钠液及其他含钾溶剂也可以作为补充选择。治疗需要个体化，小年龄的患者及ATP6V1B1基因、ATP6V0A4基因突变者中所需的钾剂量较大。并高钙尿症时，可以使用噻嗪类的利尿剂，但需要注意低钾及多尿的风险。不可逆的听力损伤对以上治疗无效[20]。
总之，dRTA是由于尿液酸化障碍所导致的一系列临床症状群，起病隐匿，常常延误确诊。早期行基因检测可尽早明确诊断，及时治疗，改善远期预后，且明确分子诊断后可以指导其家庭再生育，进行产前筛查。本研究对6例dRTA患儿进行了基因型及临床表型的相关性分析，证实了基因检测在可疑患者中的重要意义，提示不同基因突变及遗传方式的患儿治疗需要个体化，并且发现了3个既往未见报道的突变位点，丰富了基因诊断数据库。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
