吕元红; 王国兵; 温鹏强; 刘琮; 徐明国; 梅洁花; 赖恒; 李成荣

doi:10.3760/cma.j.cn101070-20190716-00644

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• 论著 •

川崎病白细胞介素-4基因组蛋白乙酰化修饰改变及意义

中华实用儿科临床杂志, 2020,35(6) : 462-466. DOI: 10.3760/cma.j.cn101070-20190716-00644

摘要

目的

探讨白细胞介素-4(IL-4)基因组蛋白乙酰化修饰水平改变及其在川崎病(KD)发病机制中的作用。

方法

选取2016年10月至2018年12月在深圳市儿童医院就诊的KD患儿36例为研究对象，同年龄健康儿童28例作为对照组。KD患儿分别于急性期及静脉用丙种球蛋白(IVIG)治疗有效后4～5 d取血备检。采用染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR检测外周血CD4^＋ T淋巴细胞IL-4基因启动子、增强子Va组蛋白H4乙酰化和p300、CREB结合蛋白(CBP)水平；流式细胞术检测外周血Ⅱ型辅助性T淋巴细胞(Th2)(CD4^＋ IL-4^＋)比例及CD4^＋ T淋巴细胞中磷酸化信号转导及转录活化因子6(pSTAT6)、GATA结合蛋白3(GATA3)、活化T细胞核因子1(NFAT1)、Ⅱ型转化生长因子β受体(TGF-βRⅡ)、磷酸化L型氨基酸转运蛋白1(pLAT1)蛋白表达水平；荧光定量PCR检测CD4^＋ T淋巴细胞IL-4、IL-5、IL-13、IL-4受体α(IL-4Rα)、Ⅰ型转化生长因子β受体(TGF-βRⅠ)、性别决定区Y框蛋白4(SOX4) mRNA表达水平；酶联免疫吸附试验测定血浆IL-4、转化生长因子β(TGF-β)水平。

结果

1．KD患儿Th2细胞比例、功能相关分子(IL-4、IL-5和IL-13)表达及IL-4基因启动子、增强子Va组蛋白乙酰化水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中冠状动脉损伤组(CAL)前述指标均高于无冠状动脉损伤组(NCAL)，差异均有统计学意义(均P<0.05)，经IVIG治疗后显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。2.与对照组比较KD患儿外周血CD4^＋ T淋巴细胞p300、CBP与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平明显上调，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且p300与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平与后者表达均呈正相关(r＝0.72、0.43，均P<0.05)，经IVIG治疗后呈不同程度下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中CAL组p300、CBP与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平明显高于NCAL组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。3.与对照组比较，KD患儿血浆IL-4水平及CD4^＋ T淋巴细胞IL-4Rα/STAT6/GATA-3、pLAT1/NFATc1表达显著增高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，血浆TGF-β水平及下游信号分子TGF-βRⅡ/TGF-βRⅠ/SOX4表达明显下调，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中CAL组血浆IL-4水平及CD4^＋ T淋巴细胞IL-4Rα/STAT6/GATA-3、pLAT1/NFATc1表达均高于NCAL组，血浆TGF-β水平及下游信号分子TGF-βRⅡ/TGF-βRⅠ/SOX4表达低于NCAL组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，经IVIG治疗后呈不同程度的回调，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

结论

IL-4基因组蛋白H4过度乙酰化可能是导致KD患儿免疫功能异常的重要原因之一。

引用本文: 吕元红, 王国兵, 温鹏强, 等. 川崎病白细胞介素-4基因组蛋白乙酰化修饰改变及意义 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2020, 35(6) : 462-466. DOI: 10.3760/cma.j.cn101070-20190716-00644.

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川崎病(KD)是一种急性全身性血管炎症性疾病，可能与感染诱发的免疫异常有关^[1,2,3]，但诱发免疫异常的调控机制尚不完全清楚。Ⅱ型辅助性T淋巴细胞(Th2)是一类T淋巴细胞亚群，参与调节免疫反应，并与多种自身免疫性疾病的发病机制有关^[4,5,6]。白细胞介素(IL)-4是Th2细胞的关键因子，主要参与调节其分化、成熟及免疫功能^[4,5]。本研究探讨KD患儿IL-4基因组蛋白乙酰化修饰改变及其相关的信号调机制，旨在进一步阐明KD的免疫发病机制。

1　资料与方法

1.1　研究对象

按就诊顺序随机选取2016年10月至2018年12月来深圳市儿童医院就诊的KD患儿36例。诊断参照日本川崎病研究协会发布的标准^[7]。其中男19例，女17例；年龄1～5.3岁[(2.9±1.3)岁]；病程在10 d以内，均于就诊及随访6个月内定期接受心脏彩色多普勒超声检查，并根据冠状动脉损伤情况分为冠状动脉损伤(CAL)组(16例)和无冠状动脉损伤(NCAL)组(20例)。所有外周血样本取自急性期KD患儿及IVIG治疗有效4～5 d(KD组和KD^IVIG组)。同期健康儿童28例为对照组(Ctrl组)。其中男15例，女13例；年龄1.2～4.8岁[(2.8±1.3)岁]。各组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究通过医院医学伦理委员会批准(批准文号：201401053)，受试者监护人均已知情同意，并签署知情同意书。

1.2　IL-4基因组蛋白乙酰化相关分子mRNA检测

(1)无菌采集KD患儿及健康对照儿童3 mL静脉血，乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na₂)抗凝，采用单克隆抗体包装的磁珠(美国Life公司，111.45D)分离外周血CD4^＋ T淋巴细胞，加入Lysis裂解液，匀浆、纯化总RNA；(2)参照试剂盒(美国Life公司，K1632)步骤，采用Oligo dT引物，经反转录PCR合成cDNA。(3)根据IL-4、IL-5、IL-13、IL-4受体α(IL-4Rα)、Ⅰ型转化生长因子β受体(TGF-βRⅠ)及性别决定区Y框蛋白4 (SOX4)基因mRNA序列设计引物(表1)，以合成的cDNA为模板，按荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物，RR420A)说明，进行相对定量分析。

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表1

反转录-PCR及real-time PCR引物

Table 1

Primers of reverse transcription－PCR and real－time PCR

表1

反转录-PCR及real-time PCR引物

Table 1

Primers of reverse transcription－PCR and real－time PCR

基因	引物序列	复性温度(℃)	扩增位置	产物大小(bp)
IL-4	正向引物：5′-CAGTTCTACAGCCACCATGAG-3′	56	294～470	197
	反向引物：5′-ATCGTCTTTAGCCTTTCCAAG-3′
IL-5	正向引物：5′-TGCTTCTGCATTTGAGTTTGC-3′	56	52～127	76
	反向引物：5′-GCACTTGTGGGAATTTCTGTG-3′
IL-13	正向引物：5′-GCATGGTATGGAGCATCAACC-3′	58	208～316	109
	反向引物：5′-CTCAGCATCCTCTGGGTCTTC-3′
IL-4Rα	正向引物：5′-GCGGATAACTATACACTGGAC-3′	57	484～687	204
	反向引物：5′-AATGTTGACTGCATAGGTGAG-3′
TGF-βRⅠ	正向引物：5′-AATGGGCTTAGTATTCTGGG-3′	55	1 285～1 437	153
	反向引物：5′-ATATTTGGCCTTAACTTCTG-3′
SOX4	正向引物：5′-GCAAGATCATGGAGCAGTCG-3′	60	418～585	168
	反向引物：5′-TGGGCCGGTACTTGTAGTCG-3′
β-actin	正向引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′	56～61	787～906	120
	反向引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′

注：IL-4：白细胞介素4；IL-5：白细胞介素5；IL-13：白细胞介素13；IL-4Rα：白细胞介素4受体α；TGF-βRⅠ：Ⅰ型转化生长因子β₁受体；SOX4：性别决定区Y框蛋白4；β-actin：肌动蛋白β　IL－4：interleukin－4；IL－5：interleukin－5；IL－13：interleukin－13；IL－4Rα：interleukin－4 receptor α；TGF－βRⅠ：transforming growth factor－β receptor Ⅰ；SOX4：SRY(sex determining region Y)－box 4

1.3　IL-4基因组蛋白乙酰化及乙酰化酶结合水平测定

(1)用含10 g/L甲醛的PBS溶液重悬部分CD4^＋ T淋巴细胞，37 ℃孵育10 min；(2)加入终质量浓度1 mg/L胃蛋白酶抑制剂(pepstatin A)、1 mg/L抑肽酶(aprotinin)和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的冷PBS溶液洗涤2次后，重新加入200 μL十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，0 ℃裂解10 min；(3)按染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒(美国Upstate公司，17－295)步骤，经超声法片断化基因组DNA为400～600 bp，加入抗-乙酰化组蛋白H4(H4Ac)、抗-p300、抗-CREB结合蛋白(CBP)单克隆抗体，分离、纯化抗体结合DNA；(4)以IL-4基因DNA及H4Ac修饰位点对应序列设计引物，参照荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物，RR420A)说明，进行相对定量分析。

1.4　血浆细胞因子水平测定

(1)所有受试者空腹6 h后，无菌采取2 mL外周血，经肝素抗凝后，300×g离心10 min，分离血浆，－80 ℃冰箱冻存备用；(2)应用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Life公司，BMS225－2、BMS2065*)测定IL-4、转化生长因子β(TGF-β)水平。

1.5　Th2细胞比例及相关信号蛋白检测

(1)取1 mL抗凝静脉血，经密度-梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入终质量浓度300 μg/L佛波酯(PMA)、1 mg/L离子霉素(Ionomycin)、2 μmol/L莫能霉素(Monensin)和1 mL 100 g/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，重悬细胞，于37 ℃、50 mL/L二氧化碳(CO₂)条件下刺激培养6 h，经抗体染色检测CD4^＋ IL-4^＋ (Th2)细胞比例；(2)采用直标或间标法，经抗体染色后，检测CD4^＋ T淋巴细胞IL-4、磷酸化信号转导及转录活化因子6(pSTAT6)、GATA结合蛋白3(GATA3)、活化T细胞核因子1(NFAT1)、Ⅱ型转化生长因子β受体(TGF-βRⅡ)、磷酸化L型氨基酸转运蛋白1(pLAT1)表达水平，结果以平均荧光强度表示。

1.6　统计学处理

采用SPSS 21.0软件分析，检测结果以±s表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　Th2细胞及IL-4基因H4Ac检测结果

与对照组相比，KD患儿Th2细胞比例，系别相关因子IL-4、IL-5和IL-13表达显著增高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中CAL组上述指标均高于NCAL组(均P<0.05)，经IVIG治疗后显著降低(P<0.05)(表2，图1)。采用ChIP检测组蛋白乙酰化修饰水平，显示KD患儿CD4^＋ T淋巴细胞IL-4基因启动子、增强子Va位点H4Ac水平明显上调(P<0.05)，且CAL组IL-4基因启动子、增强子Va位点H4Ac水平均高于NCAL组(P<0.05)，经IVIG治疗后均显著降低(P<0.05)(图2)。

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表2

Th2细胞亚群及IL-4基因组蛋白乙酰化相关分子流式检测结果(±s)

Table 2

Proportions of Th2 and expressions of molecules associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by flow cytometry(±s)

表2

Th2细胞亚群及IL-4基因组蛋白乙酰化相关分子流式检测结果(±s)

Table 2

Proportions of Th2 and expressions of molecules associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by flow cytometry(±s)

组别	例数	Th2 (%)	CD4^＋ T淋巴细胞
组别	例数	Th2 (%)	IL-4	pSTAT6	GATA3	pLAT1	pNFAT1	TGF-βRⅡ
Ctrl	28	2.52±0.58	92.58±31.06	73.54±18.43	106.12±35.92	52.46±12.85	86.22±29.40	48.24±16.25
KD组	36	5.19±1.76^a	281.61±119.22^a	175.31±49.52^a	257.25±92.48^a	72.43±18.35^a	185.52±49.46^a	28.72±9.84^a
NCAL组	20	4.32±1.25	192.75±62.13	145.92±36.23	205.85±72.43	63.39±16.20	158.72±36.41	36.16±13.40
CAL组	16	6.28±2.47^b	392.69±170.62^b	212.05±57.65^b	321.50±142.40^b	83.73±19.71^b	219.02±67.40^b	19.42±8.46^b
KD^IVIG组	36	3.38±1.32^c	159.76±68.30^c	128.26±54.82^c	168.32±71.49^c	59.63±15.82^c	108.30±41.79^c	43.28±18.49^c
t值		8.53^a，2.89^b，4.94^c	8.99^a，4.46^b，5.32^c	11.36^a，4.20^b，3.82^c	8.97^a，2.96^b，4.56^c	4.90^a，3.40^b，3.17^c	9.99^a，3.22^b，7.16^c	5.61^a，4.35^b，4.17^c

注：Th2：Ⅱ型辅助性T淋巴细胞；Ctrl：健康对照；KD：川崎病；NCAL：无冠状动脉损伤；CAL：冠状动脉损伤；KD^IVIG：静脉输注丙种球蛋白治疗后4～5 d的川崎病；IL-4：白细胞介素4；pSTAT6：磷酸化信号转导及转录活化因子6；GATA3：GATA结合蛋白3；pLAT1：磷酸化L型氨基酸转运蛋白1；pNFAT1：磷酸化活化T细胞核因子1；TGF-βRⅡ：Ⅱ型转化生长因子β受体；与Ctrl组比较，^aP<0.05；与NCAL组比较，^bP<0.05；与KD组比较，^cP<0.05　Th2：hel－per T cells type Ⅱ；Ctrl：healthy controls；KD：Kawasaki disease；NCAL：non－coronary artery lesions；CAL：coronary artery lesions；KD^IVIG：Kawasaki disease after intravenous immunoglobulin treatment for 4－5 d；IL－4：interleukin 4；pSTAT6：phosphorylated signal transducer and activator of transcription 6；GATA3：GATA bin－ding protein 3；pLAT1：phosphorylated L－type amino acid transporter 1；NFAT1：nuclear factor 1 of activated T cells；TGF－βRⅡ：transforming growth factor－β1 receptor Ⅱ；compared with control group，^aP<0.05；compared with NCAL group，^bP<0.05；compared with KD group，^cP<0.05

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图1

IL-4基因组蛋白乙酰化相关分子荧光定量PCR检测结果

Figure 1

Expression levels of molecules associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by real－time PCR

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注：Ctrl：健康对照；KD：川崎病；NCAL：无冠状动脉损伤；CAL：冠状动脉损伤；KD^IVIG：静脉输注丙种球蛋白治疗后4～5 d的川崎病；β-actin：肌球蛋白β；IL-4：白细胞介素4；IL-5：白细胞介素5；IL-13：白细胞介素13；IL-4Rα：白细胞介素4受体α；TGF-βRⅠ：Ⅰ型转化生长因子β受体；SOX4：性别决定区Y框蛋白4；与Ctrl组比较，^aP<0.05；与NCAL组比较，^bP<0.05；与KD组比较，^cP<0.05　Ctrl：healthy controls；KD：Kawasaki disease；NCAL：non－coronary artery lesions；CAL：coronary artery lesions；KD^IVIG：Kawasaki disease after intravenous immunoglobulin treatment for 4－5 d；IL－4：interleukin 4；IL－5：interleukin 5；IL－13：interleukin 13；IL－4Rα：interleukin－4 receptor α；TGF－βRⅠ：transforming growth factor－β receptor Ⅰ；SOX4：SRY(sex determining region Y)－box 4；compared with control group，^aP<0.05；compared with NCAL group，^bP<0.05；compared with KD group，^cP<0.05

图1

IL-4基因组蛋白乙酰化相关分子荧光定量PCR检测结果

Figure 1

Expression levels of molecules associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by real－time PCR

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图2

IL-4基因组蛋白乙酰化及组蛋白乙酰化酶结合水平检测结果

Figure 2

Histone acetylation and the binding abilities of histone acetylase with IL－4 gene detected by chromatin immunoprecipitation

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注：Ctrl：健康对照；KD：川崎病；NCAL：无冠状动脉损伤；CAL：冠状动脉损伤；KD^IVIG：静脉输注丙种球蛋白治疗后4～5 d的川崎病；Pro：启动子；Va：增强子Va；CBP：CREB结合蛋白；与Ctrl组比较，^aP<0.05；与NCAL组比较，^bP<0.05；与KD组比较，^cP<0.05　Ctrl：healthy controls；KD：Kawasaki disease；NCAL：non－coronary artery lesions；CAL：coronary artery lesions；KD^IVIG：Kawasaki disease after intravenous immunoglobulin treatment for 4－5 d；Pro：promoter；Va：enhancer Va；CBP：CREB－binding protein；compared with control group，^aP<0.05；compared with NCAL group，^bP<0.05；compared with KD group，^cP<0.05

图2

IL-4基因组蛋白乙酰化及组蛋白乙酰化酶结合水平检测结果

Figure 2

Histone acetylation and the binding abilities of histone acetylase with IL－4 gene detected by chromatin immunoprecipitation

2.2　IL-4基因H4Ac相关因子检测结果

KD患儿CD4^＋ T淋巴细胞组蛋白乙酰化酶p300、CBP与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平明显上调(均P<0.05),其中p300与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平与均后者表达呈正相关(r＝0.72、0.43，均P<0.05)，经IVIG治疗后显著降低(均P<0.05)(图2)。进一步比较CAL和NCAL组IL-4基因p300/CBP的结合水平，发现CAL组p300、CBP与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平明显高于NCAL组(均P<0.05) (图2)。

2.3　细胞因子IL-4、TGF-β及TCR信号检测结果

与对照组相比，急性期KD患儿血浆IL-4水平及TCR信号关键分子pLAT1蛋白水平显著上调(P<0.05)，而血浆TGF-β水平明显降低(P<0.05)，且CAL组IL-4水平及pLAT1表达均高于NCAL组，TGF-β水平低于NCAL组(P<0.05)，经IVIG治疗后明显回调(P<0.05)(表2、表3)。进一步比较各组IL-4、TGF-β及TCR下游信号传导分子的表达，发现KD患儿CD4^＋ T淋巴细胞IL-4R/STAT6/GATA-3、NFAT1表达显著增高，TGF-βRⅡ/TGF-βRⅡ/SOX4表达明显下调，且CAL组前4项均高于NCAL组、后3项低于NCAL组(P<0.05)，经IVIG治疗后均有不同程度回调(P<0.05)(表2、表3，图1)。

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表3

IL-4基因组蛋白乙酰化相关细胞因子ELISA检测结果(±s)

Table 3

Plasma cytokines associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by ELISA(±s)

表3

IL-4基因组蛋白乙酰化相关细胞因子ELISA检测结果(±s)

Table 3

Plasma cytokines associated with histone acetylation of IL－4 gene detected by ELISA(±s)

组别	例数	IL-4(ng/L)	TGF-β(ng/L)
Ctrl组	28	6.22±1.09	918.36±195.43
KD组	36	7.68±1.55^a	423.85±138.62^a
NCAL组	20	6.81±1.27	475.10±142.09
CAL组	16	8.77±1.76^b	359.79±108.15^b
KD^IVIG组	36	6.44±1.32^c	685.02±203.19^c
t值		4.23^a，3.88^b，3.65^c	11.84^a，2.68^b，6.37^c

注：IL-4：白细胞介素-4；ELISA：酶联免疫吸附试验；Ctrl：健康对照；KD：川崎病；NCAL：无冠状动脉损伤；CAL：冠状动脉损伤；KD^IVIG：静脉输注丙种球蛋白治疗4～5 d的KD；TGF-β：转化生长因子β；与Ctrl组比较，^aP<0.05；与NCAL组比较，^bP<0.05；与KD组比较，^cP<0.05　IL－4：interleukin 4；ELISA：enzyme－linked immunosorbent assay；Ctrl：healthy controls；KD：Kawasaki disease；NCAL：non－coronary artery lesions；CAL：coronary artery lesions；KD^IVIG：KD after intravenous immunoglobulin treatment for 4－5 d；TGF－β：transforming growth factor β；compared with control group，^aP<0.05；compared with NCAL group，^bP<0.05；compared with KD group，^cP<0.05

3　讨论

KD是一种急性自身免疫性疾病，可能与感染引起自身免疫功能过度活化有关^[1,2,3]，但导致其免疫耐受功能异常的机制仍不完全清楚。Th2细胞是一类T淋巴细胞亚群，通过分泌IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子促进B淋巴细胞抗体类型转换而介导体液免疫，其数量或功能失衡可导致机体免疫功能紊乱^[4,5,6]。国外报道^[8]及本研究观察到KD患儿Th2细胞比例及IL-4、IL-5和IL-13表达显著上调，其中CAL组前述5项均高于NCAL组，经IVIG治疗后显著降低，提示Th2细胞数量及功能异常可能与KD发病机制有关。

IL-4是Th2细胞的关键因子，参与调节其分化、成熟及免疫功能^[4,5]，其表达受组蛋白乙酰化、细胞因子信号等多种因素调节^[9,10]。转录因子可与IL-4基因启动子、增强子Va结合，通过募集组蛋白乙酰化酶p300/CBP而介导上述2个位点的组蛋白发生乙酰化，促使染色质构象发生变化而形成松散的空间结构，进而增强IL-4基因转录^[11,12]。本研究显示KD患儿CD4^＋ T淋巴细胞IL-4基因启动子、增强子Va位点H4Ac及其与p300、CBP的结合水平明显上调，且p300与IL-4基因启动子、增强子Va结合水平与后者表达呈正相关，CAL组前述4项均高于NCAL组，经IVIG治疗后均显著降低，提示急性期KD患儿Th2细胞异常可能与p300/CBP介导的IL-4基因组蛋白过度乙酰化有关。

调节IL-4基因组蛋白乙酰化修饰的信号机制仍不清楚。IL-4可与细胞表面IL-4R受体结合而诱导下游转录因子STAT6发生磷酸化，pSTAT6上调GATA-3表达，二者均可募集p300/CBP结合至IL-4基因，其中STAT6与启动子、增强子Va结合，GATA-3仅与增强子Va结合，并促进相应位点的组蛋白发生乙酰化^[10,13]。TCR信号活化可诱导NFAT1与IL-4基因启动子、增强子Va结合并募集p300/CBP，从而增强其组蛋白乙酰化水平^[14]。血浆中的TGF-β可与TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ形成聚合物而上调SOX4表达，后者竞争性抑制GATA-3介导的IL-4基因组蛋白乙酰化^[15]。另有研究发现，静脉注射的IVIG通过上调TGF-β的表达而促进体内免疫平衡的恢复，从而减轻KD血管损伤^[16]。本研究显示，KD患儿血浆IL-4水平、TCR信号关键分子pLAT1蛋白水平显著增加，TGF-β水平明显降低，且CAL组IL-4水平及pLAT1表达均高于NCAL组、TGF-β水平低于NCAL组，经IVIG治疗后明显回调。进一步分析IL-4、TCR及TGF-β下游信号分子，发现KD患CD4^＋ T淋巴细胞IL-4Rα/STAT6/GATA-3、NFAT1表达显著增高，TGF-βRⅡ/TGF-βRⅠ/SOX4表达明显低于正常对照组，且CAL组前述4项指标均高于NCAL组、后3项指标低于对照组，经IVIG治疗后均有不同程度回调，提示IL-4、TCR信号过度活化及TGF-β信号相对不足可能是导致KD患儿IL-4基因组蛋白过度乙酰化的关键因素，而IVIG或可通过上调TGF-β信号并抑制p300/CBP与IL-4基因结合，进而抑制IL-4表达及促进Th2细胞恢复。

综上，本组研究推测KD患儿IL-4、TCR信号过度活化及TGF-β信号相对不足，促使p300/CBP与IL-4基因结合水平增加，造成后者组蛋白过度乙酰化及转录活性上调，最终导致Th2细胞及IL-4、IL-5和IL-13表达异常。而IVIG或可通过上调TGF-β信号并抑制p300/CBP与IL-4结合，进而抑制IL-4表达及促进Th2细胞恢复。但是否同时存在其他信号参与调节IL-4基因组蛋白乙酰化仍有待进一步研究。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

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贡献者信息

吕元红

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

王国兵

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

温鹏强

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

刘琮

深圳市儿童医院心血管内科，广东　深圳　518038

徐明国

深圳市儿童医院心血管内科，广东　深圳　518038

梅洁花

深圳市儿童医院心血管内科，广东　深圳　518038

赖恒

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

李成荣

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

通信作者

王国兵

深圳市儿童医院儿科研究所，广东　深圳　518038

Email：rogasan@163.com

关键词

川崎病; Ⅱ型辅助性T淋巴细胞; 细胞因子; 组蛋白乙酰化; 免疫;

基金项目

国家自然科学基金（81102227）

深圳市知识创新计划（JCYJ20180228175700233）

深圳市卫生计生系统科研项目（201401053）

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2020-04-08

收稿日期：2019-07-16

本文编辑

单卫华

Original Article

Modification and significance of histone acetylation associated with interleukin-4 gene in pediatric Kawasaki disease

Yuanhong Lyu, Guobing Wang, Pengqiang Wen, Cong Liu, Mingguo Xu, Jiehua Mei, Heng Lai, Chengrong Li

Published 2020-04-08

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2020, 35(6): 462-466. DOI: 10.3760/cma.j.cn101070-20190716-00644

Abstract

Objective

To investigate the histone acetylation of interleukin-4(IL-4) gene and its roles in immunological pathogenesis of Kawasaki disease (KD).

Methods

Thirty-six children with KD and 28 age-matched healthy children in Shenzhen Children′s Hospital from October 2016 to December 2018 were recruited in this study.Peripheral venous blood samples were collected from healthy controls (28 cases) and patients with KD during acute phase and 4 to 5 days after effective intravenous immunoglobulin (IVIG) treatment.Co-immunoprecipitation followed by real-time PCR was used to assess histone H4 acetylation levels of IL-4 promoter and Va enhancer, and binding abilities of p300 and CREB-binding protein (CBP) with promoter and Va enhancer of IL-4 gene in peripheral blood CD4⁺ T cells.Flow cytometry was performed to analyze the proportion of CD4⁺ IL-4⁺ T cells (Th2) and protein le-vels of phosphorylated signal transducer and activator of transcription 6 (pSTAT6), GATA binding protein 3 (GATA3), nuclear factor 1 of activated T cells(NFAT1), transforming growth factor-β receptor Ⅱ (TGF-βRⅡ), and phosphorylated L-type amino acid transporter 1(pLAT1). Quantitative real-time PCR was used to evaluate the transcription levels of IL-4, IL-5, IL-13, IL-4 receptor α (IL-4Rα), transforming growth factor-β receptor Ⅰ (TGF-βRⅠ) and sex-determining region Y(SRY)-box 4 (SOX4) in CD4⁺ T cells.Plasma concentrations of IL-4 and transforming growth factor-β(TGF-β) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.

Results

(1)Compared with control group, the proportion of Th2 cells, expression levels of Th2-associated cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and histone H4 acetylation levels associating with IL-4 promoter and Va enhancer, increased remarkably during acute KD(all P<0.05), and restored after IVIG therapy(all P<0.05). Meanwhile, all the former items in KD patients with coronary artery lesions (CAL) were higher than those in patients with non-coronary artery lesions (NCAL) (all P<0.05). (2) Compared with control group, binding abilities of p300 and CBP with IL-4 promoter and Va enhancer in CD4⁺ T cells were up-regulated significantly during acute KD (all P<0.05), and decreased in varying degrees after IVIG treatment (all P<0.05). Positive correlations between binding abilities of p300 with IL-4 (promoter and Va enhancer) and the expression of IL-4 promoter and Va enhancer were detected in patients with acute KD (r=0.72, 0.43, all P<0.05). Furthermore, binding abilities of p300 and CBP with IL-4 promoter and Va enhancer in CAL group were higher than those in NCAL group (all P<0.05). (3) Compared with control group, patients with acute KD had remarkably increased plasma concentration of IL-4, and expression levels of IL-4Rα/STAT6/GATA-3 and pLAT1/NFAT1 in CD4⁺ T cells (all P<0.05), and significantly down-regulated plasma concentration of TGF-β and expression level of TGF-βRⅡ/TGF-βRⅠ/SOX4 (all P<0.05). All the items mentioned above restored in varying degrees after IVIG treatment (all P<0.05). Simultaneously, the 6 items aforementioned in CAL group were found to be higher than those in NCAL group (all P<0.05), while the latter four items were lower than those in NCAL group (all P<0.05).

Conclusion

Histone hyperacetylation of IL-4 gene may be related to immune dysfunction in patients with KD.

Key words:

Kawasaki disease; Type Ⅱ helper T cells; Cytokine; Histone acetylation; Immune

Contributor Information

Yuanhong Lyu

Shenzhen Institute of Pediatrics, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Guobing Wang

Shenzhen Institute of Pediatrics, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Pengqiang Wen

Shenzhen Institute of Pediatrics, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Cong Liu

Department of Cardiology, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Mingguo Xu

Department of Cardiology, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Jiehua Mei

Department of Cardiology, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Heng Lai

Shenzhen Institute of Pediatrics, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

Chengrong Li

Shenzhen Institute of Pediatrics, Shenzhen Children′s Hospital, Shenzhen 518038, Guangdong Province, China

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