探讨核因子-κB(NF-κB)介导肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对骨肉瘤增长的影响及其作用机制。
选取4～6周无特定病原体级Balb/c雄性裸鼠15只，数字表法随机分为人骨肉瘤MG63细胞组、人单核巨噬细胞系THP-1细胞组、MG63＋THP-1混合细胞组3组，每组5只。于裸鼠右侧腋窝皮下注射浓度为1.0×108/mL的不同细胞悬液制备裸鼠成瘤模型：MG63细胞组裸鼠每只注射MG63细胞悬液0.2 mL，THP-1细胞组裸鼠每只注射THP-1细胞悬液0.2 mL，MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠每只注射MG63＋THP-1混合细胞悬液(9∶1)0.2 mL。注射细胞后每天观察各组裸鼠是否出现移植瘤，从MG63组和MG63＋THP-1混合细胞组均出现移植瘤当天开始，用游标卡尺测量移植瘤的长径和短径，并计算移植瘤体积，此后每5天测量1次，对比不同时间各组移植瘤生长情况；注射细胞后第25天处死裸鼠，剥离移植瘤，对比各组移植瘤质量。将移植瘤置于10%甲醛中固定，制备石蜡切片，采用HE染色，观察各组移植瘤的肿瘤特征改变；采用免疫组织化学SP染色，观察各组移植瘤中核转录因子NF-κB蛋白的表达情况；采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件定量分析比较各组移植瘤中NF-κB蛋白的表达水平。
THP-1细胞组裸鼠没有形成移植瘤。MG63＋THP-1混合细胞组和MG63细胞组的裸鼠分别从注射细胞后第7天、第10天开始腋窝皮下可触及移植瘤，且随时间增加，肿瘤体积逐渐增大；第10、15、20和25天MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤体积分别为(474.4±56.1)、(945.0±79.7)、(2 886.0±462.3)、(3 319.6±388.4)mm3，均明显大于MG63细胞组的移植瘤体积(233.3±28.2)、(669.6±75.9)、(1 464.0±135.2)、(2 068.0±223.2)mm3，差异均有统计学意义(t＝3.536、2.504、2.952、2.794, P值均<0.05)。在种植细胞后第25天处死裸鼠，MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤质量(0.920±0.134)g，明显大于MG63细胞组(0.544±0.079)g，差异有统计学意义(t＝2.404, P<0.05)。移植瘤HE染色显示，MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤均可见明显的肿瘤特征改变。免疫组织化学SP染色显示，NF-κB蛋白在MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤组织和组织间隙均呈高表达状态；检测NF-κB蛋白表达水平，MG63＋THP-1混合细胞组NF-κB蛋白吸光度值(0.362±0.006)，明显大于MG63细胞组NF-κB蛋白吸光度值(0.326±0.006)，差异有统计学意义(t＝9.895, P<0.05)。
TAMs可以促进骨肉瘤的增长，其作用机制可能与NF-κB蛋白高表达有关。
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骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，进展快、预后差，是儿童和青少年骨肿瘤相关死亡最常见原因[1]。因此，为了对骨肉瘤进行有效地预防和治疗，了解其发生机制至关重要[2]。目前已有研究表明肿瘤细胞周围浸润着大量巨噬细胞，称之为肿瘤相关性巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)，其与乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌等肿瘤细胞的增殖呈正相关[3]，但TAMs在骨肉瘤发生发展中的作用仍未见报道。核因子-κB(nuclear factro, NF-κB)为一个转录因子蛋白家族，是机体调节机制的关键因子。Miwa等[4]已证实NF-κB参与炎症控制、细胞生长和凋亡，并且NF-κB信号通路在骨肉瘤的细胞生存与凋亡、血管生成和肿瘤发展过程中具有重大意义。本研究通过向裸鼠皮下注射人骨肉瘤MG63细胞、人单核巨噬细胞系THP-1细胞和MG63＋THP-1混合细胞构建裸鼠体内移植瘤模型，探讨TAMs对骨肉瘤增长的影响及其可能的机制，为骨肉瘤的防治提供新的思路。
15只Balb/c雄性裸鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(动物合格号：43004700040521)，鼠龄4～6周，体质量18～21(19.50 ± 0.50)g，无特定病原体(specified pathogen-free，SPF)级动物房饲养，12 h光照和12 h黑夜交替，自由进食、活动，裸鼠生长情况良好。本实验获得郑州大学伦理委员会批准(批文号：2018030)，实验过程中对动物处置严格遵循替代(replacement)、减少(reduction)、优化(refinement)的"3R"原则，善待动物。
人骨肉瘤MG63细胞和人单核巨噬细胞系THP-1细胞均购于美国ATCC公司，RPMI 1640细胞培养液购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人NF-κB、兔抗人MCP-1抗体和HRP标记山羊抗兔二抗均购置于北京博奥森生物科技有限公司，SP免疫组织化学试剂盒和DAB显色剂均购于武汉谷歌生物科技有限公司。采用日本Nikon显微镜观察和拍摄病理和免疫组织化学照片。
MG63细胞和THP-1细胞均使用RPMI 1640培养液(含10%热灭活胎牛血清＋100 IU/mL青霉素＋100 mg/mL链霉素)置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的恒温箱中培养。待细胞生长融合达到70%时，用胰蛋白酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)分别制备成浓度为1.0×108/mL的单细胞悬液，用于后续制备裸鼠成瘤模型。
采用数字表法将15只Balb/c雄性裸鼠随机分为MG63细胞组、THP-1细胞组、MG63＋THP-1混合细胞组(MG63∶THP-1＝9∶1[5])。于裸鼠右侧腋窝皮下注射浓度为1.0×108/mL的不同细胞悬液制备裸鼠成瘤模型。其中，MG63细胞组裸鼠每只注射MG63细胞悬液0.2 mL，THP-1细胞组裸鼠每只注射THP-1细胞悬液0.2 mL，MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠每只注射MG63＋THP-1混合细胞悬液(9∶1)0.2 mL。
细胞注入裸鼠后每天观察裸鼠状态，并观察移植瘤的发生和生长情况。从不同组裸鼠右侧腋窝皮下均可扪及移植瘤开始，用游标卡尺(精确度0.1 mm)测量不同组移植瘤的长径(a)和短径(b)，按照公式计算移植瘤体积(V)[6]。此后每5 d测量1次，对比不同时间各组移植瘤生长情况。
V＝ab2/2
根据预实验观察成瘤情况，肿瘤种植后MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤体积增长较快、较大，在种植细胞后第25天，出现注射针口的坏死。遵循善待动物原则，3组实验动物均于肿瘤细胞接种后第25天，采用CO2窒息安乐死处死裸鼠，剥离移植瘤，对比各组移植瘤质量。将移植瘤置于10%甲醛中固定保存。
取移植瘤保存于10%甲醛中，常规进行梯度脱水、石蜡包埋。每个蜡块标本在中间位置连续切片2张，制成厚度为8 μm石蜡切片备用。每个蜡块标本第1张做HE染色，第2张做免疫组织化学染色。
HE染色：将病理切片依次放入不同浓度的二甲苯和无水乙醇，将切片脱腊；放入苏木素染液染3～5 min，水洗，分化液分化，再次水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；将病理切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5 min，伊红染液染色5 min；最后切片无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下采集图像，观察移植瘤是否出现明显的肿瘤特征改变。
免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-peroxidase，SP)染色检测：将病理石蜡切片脱腊，抗原修复、血清封闭30 min，采用兔抗小鼠NF-κB一抗(1∶100稀释)，用PBS作空白对照，均于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日采用HRP标记山羊抗兔二抗室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在200倍显微镜镜下，每张切片随机选取10个视野，观察NF-κB蛋白的表达情况。NF-κB蛋白定位于细胞浆，阳性染色呈棕黄色。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，对NF-κB蛋白的表达水平进行定量分析[7]：随机选取10个视野，测量每个视野下阳性表达区域的吸光度，10个视野的平均吸光度为每张切片的吸光度值。
应用SPSS 21.0软件进行统计分析。服从或近似服从正态分布的计量资料以
±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
THP-1细胞组由于没有移植瘤形成，所以裸鼠状态较好，饮食和活动正常。MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组的裸鼠随着移植瘤的形成和逐渐增大，饮食减少，行动迟缓；其中2只MG63＋THP-1混合细胞组的裸鼠，由于移植瘤增长速度快，身体消瘦，几乎不活动。
THP-1细胞组裸鼠没有形成移植瘤。MG63＋THP-1混合细胞组的裸鼠从注射细胞后第7天开始腋窝皮下可扪及移植瘤，而MG63细胞组的裸鼠从注射细胞后第10天开始腋窝皮下可扪及移植瘤，且随时间增加，2组肿瘤体积逐渐增大。于注射细胞的第10天测量移植瘤体积，此后每5天测量1次，并比较2组裸鼠移植瘤体积：第10、15、20和25天MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤体积均明显大于MG63细胞组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表1。
MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠注射细胞后不同时间移植瘤体积比较(mm3,
±s)
MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠注射细胞后不同时间移植瘤体积比较(mm3,
±s)
| 组别 | 例数 | 第10天 | 第15天 | 第20天 | 第25天 |
|---|---|---|---|---|---|
| MG63细胞组 | 5 | 233.3±28.2 | 669.6±75.9 | 1 464.0±135.2 | 2 068.0±223.2 |
| MG63＋THP-1混合细胞组 | 5 | 474.4±56.1 | 945.0±79.7 | 2 886.0±462.3 | 3 319.6±388.4 |
| t值 | 3.536 | 2.504 | 2.952 | 2.794 | |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
在种植细胞后第25天处死裸鼠，MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤质量明显大于MG63细胞组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤质量和NF-κB吸光度值比较(
±s)
MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤质量和NF-κB吸光度值比较(±s)
| 组别 | 例数 | 移植瘤质量(g) | NF-κB吸光度 |
|---|---|---|---|
| MG63细胞组 | 5 | 0.544±0.079 | 0.326±0.006 |
| MG63＋THP-1混合细胞组 | 5 | 0.920±0.134 | 0.362±0.006 |
| t值 | 2.404 | 9.895 | |
| P值 | <0.05 | <0.05 |
注：NF-κB为核因子-κB
MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤HE染色显示：细胞排列显著紊乱，呈不规则弥漫性分布；细胞异型性明显、数量异常增多，细胞核体积增大、形状不一且染色较深，核仁明显，瘤内有血管形成。MG63细胞组和MG63＋THP-1混合细胞组移植瘤均可见明显的肿瘤特征改变，见图1。
注：红箭示血管；蓝箭示核异质细胞
骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，好发于股骨、胫骨和肱骨等长骨，其特征为未成熟的类骨质形成和成骨细胞分化异常[8]；其发病率在青少年肿瘤中处于第三位，仅次于淋巴瘤和脑肿瘤[9]，对青少年的健康成长造成了极大威胁。
在肿瘤的发生机制中，炎症促癌学说越来越受到重视，认为先天性免疫系统介导的炎症并没有消灭肿瘤细胞、抑制肿瘤的发生、发展，而是提供了适宜肿瘤发生发展的微环境[10]。巨噬细胞来源于单核细胞，可迁移至组织中分化为不同功能的细胞，并且在抗原递呈、伤口愈合、免疫调节、组织血管生成、炎症及吞噬方面起着不同的生理作用[11]。巨噬细胞聚集在恶变细胞周围形成TAMs。已有研究表明，TAMs参与并调节了多种肿瘤的发生和进展过程，如乳腺癌[12]、子宫内膜癌[13]、肾癌[14]等。Feng等[5]将单核巨噬细胞系THP-1细胞和煤焦沥青诱导的恶性转化的人支气管上皮细胞共培养，发现与THP-1共培养的恶性转化支气管上皮细胞表现出更强的增殖力和集落形成力。有关巨噬细胞在骨肉瘤发生发展中的作用仍未见报道。本研究结果显示，THP-1细胞组裸鼠没有形成移植瘤，说明单独的单核巨噬细胞没有成瘤性；MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤体积、质量均明显大于MG63细胞组，形成的移植瘤病理检测发现细胞核体积增大，且瘤内血管形成，表明THP-1细胞能够促进骨肉瘤的增长，提示TAMs在骨肉瘤发生、发展过程中发挥着重要作用。
NF-κB是与特异性DNA序列结合的蛋白质，作为一种重要的核转录因子，它存在于所有细胞中，参与机体的多个调节机制，并且与肿瘤的发生、发展关系密切[15]。Zhao等[16]研究显示，降低NF-κB信号通路的活性，可以抑制骨肉瘤细胞的生长和增殖；Tang等[17]研究表明，糖原合酶激酶3β能通过NF-κB信号通路提高骨肉瘤的致癌活性，并提出以NF-κB信号通路为靶点可能是提高骨肉瘤抗肿瘤药物治疗活性的有效策略。本研究免疫组织化学结果显示，MG63＋THP-1混合细胞组裸鼠移植瘤中NF-κB蛋白的表达较MG63细胞组明显增加，进一步证明了NF-κB在骨肉瘤发展过程中的重要作用，与既往研究结果一致。本研究结果提示，巨噬细胞可促进骨肉瘤肿瘤细胞中NF-κB的蛋白表达，且NF-κB参与了巨噬细胞促进骨肉瘤的增长。笔者分析，其机制可能是巨噬细胞与骨肉瘤细胞相互作用，一方面在骨肉瘤细胞的作用下，通过IK转录因子κB激酶抑制剂(inhibitor of nuclear factor κ-B kinase, IKK)-介导的TLR4-MyD88-IRAK-TRAF6-IKK-NF-κB信号通路激活NF-κB，或通过非经典TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB信号通路激活NF-κB，促使巨噬细胞分泌大量炎症因子等，进而促使更多炎症细胞聚集，更多炎症因子分泌，形成肿瘤微环境；另一方面巨噬细胞分泌的炎症因子作用于骨肉瘤细胞，促使骨肉瘤细胞的NF-κB信号通路激活，导致其下游的促细胞增殖的基因表达，从而促进骨肉瘤的发展与增殖。
综上所述，本研究首次采用体内裸鼠成瘤实验观察单独THP-1、MG63细胞和THP-1与MG63混合细胞形成移植瘤的能力，结果显示单核巨噬细胞可以促进骨肉瘤的增长，其作用机制可能与NF-κB蛋白高表达有关。因此推测，通过减少骨肉瘤中巨噬细胞数量、改变骨肉瘤炎症微环境或直接抑制NF-κB蛋白表达来抑制骨肉瘤生长，将可能成为骨肉瘤治疗的新方向。本研究存在以下局限性：(1)在促进成瘤的机制上，仅观察NF-κB表达增加，证据不足，在今后的研究中，需阻断NF-κB的表达，进一步验证NF-κB在促进成瘤中的作用；(2)本研究仅研究巨噬细胞与骨肉瘤细胞的直接接触作用，没有通过细胞小室系统将2种细胞分隔开研究巨噬细胞与骨肉瘤细胞的非直接接触作用，没有分析巨噬细胞分泌的细胞因子等因素对骨肉瘤细胞的生长与增殖的影响，这将在今后研究中深入探讨。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
