探讨3日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤后脑组织病理表现、生理发育、神经行为和运动发育情况。
选取3日龄雄性SD新生大鼠96只，随机分为对照组和实验组。对照组仅切开颈部皮肤；实验组结扎双侧颈总动脉。记录两组大鼠从术后1 d起至生后3周体重，对比其生理发育情况，并对眼睑反射、竖耳、门齿萌出等感觉反射进行评估，对其四肢放置、抓握反射、翻正反射、负向趋地性等运动反射进行评价。取两组大鼠术后24 h及生后3周脑组织，行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色，观察脑组织病理改变。
术后实验组大鼠较对照组体重增加缓慢、睁眼及惊跳反射延迟、下肢放置及抓握反射抑制、负向趋地性运动能力下降(P均<0.05)。实验组大鼠HE染色显示早期皮质下、脑室周围白质疏松，后期胶质细胞增生、脑室扩大、白质软化灶形成；免疫组织化学染色出现髓鞘发育障碍。
3日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤后可造成脑白质损伤，出现生长发育迟缓及神经运动发育障碍等表现。
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随着医疗技术的发展，早产儿和极低出生体重(very low birth weight, VLBW)婴儿的生存率有很大提高。早产儿脑损伤已成为新生儿脑损伤的重要表现形式，且脑损伤后多伴有严重后遗症，如运动、感知、视觉异常，6～9月龄时脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)发生率高达20%[1,2,3]。早产儿脑损伤表现与足月儿不同，多表现为脑白质损伤，包括局灶性脑白质损伤和弥漫性脑白质损伤。国外研究发现早产儿脑白质损伤的发病率为20%[4,5]。由于早产儿脑损伤发病率高，且并发症的发生严重影响早产儿长期生存质量，因此选择合适的动物模型进行发病机制研究，观察脑损伤后神经运动发育情况，对今后进行脑损伤保护机制研究至关重要。
人类孕23～32周时90%少突胶质细胞为少突胶质细胞前体细胞，是脑白质损伤的高危期。生后2～4日龄新生大鼠神经发育尚未成熟，类似于妊娠28～31周胎儿，为研究未成熟脑缺血性损伤的时期[6]。目前缺氧缺血性脑损伤动物模型(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)多应用7日龄大鼠，相当于足月儿脑神经发育，其脑缺血损伤主要发生在皮质。2～4日龄新生大鼠结扎双侧颈动脉后，脑皮质血流可降至基础脑血流的25%～30%，优于HIBD模型的17%，从而确保造模后发生选择性脑白质损伤而不是严重的皮质损伤。因此本实验应用3日龄雄性新生大鼠结扎双侧颈总动脉，制备早产儿脑损伤模型，观察脑损伤后脑组织病理变化及生理发育、神经运动发育情况。
选择清洁级3日龄(P3)雄性SD大鼠96只(复旦大学医学院实验动物中心提供)，体重7.5～12 g，随机分为对照组和实验组，每组48只。对照组仅切开颈部皮肤；实验组结扎双侧颈总动脉。两组存活大鼠再随机抽取16只于术后24 h及3周两个时间点行组织学研究，每个亚组各8只。其余各组大鼠行神经行为发育及运动评估。
将P3 SD大鼠用无水乙醚麻醉后取仰卧位，无菌条件下行颈腹侧正中切口约0.5 cm，逐层剥离皮下组织，找到血管神经束，分离出双侧颈总动脉。对照组缝合皮肤；实验组用9-0号丝线完全结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤。术后在37 ℃水浴箱内至体温和活动恢复正常，回笼饲养。
术后1 d从存活的神经行为发育及运动评估大鼠中随机选取每组各8只，记录有无惊厥及异常动作发生，测量两组大鼠术后1 d起至生后3周体重，并对睁眼、竖耳、门齿萌出等情况进行视频记录。
参与神经行为评估的两组大鼠于生后1～3周每日行神经行为发育视频记录，由我院神经科固定1名医生进行神经行为评价。(1)感觉反射：包括眼睑反射及耳廓反射，应用棉签轻触大鼠眼睑和耳廓，记录出现反射的日龄。(2)听觉惊跳反射：记录大鼠对突然出现拍打声的惊跳反应及出现的日龄。拍打声使用分贝监测器(ws3130A，深圳WENSN技术有限公司)控制在110分贝。(3)四肢抓握反射：用细木条轻碰大鼠的上肢和下肢，记录大鼠能用上肢或下肢抓住木条的日龄。(4)四肢放置反射：抓住鼠尾提起大鼠，分别将大鼠前后爪的爪背靠向桌子边缘，记录大鼠能够将四肢抬起放在桌上的日龄。(5)翻正反射：从大鼠仰卧位放置开始记时，到大鼠翻身成俯卧位前后爪放平时记时停止，此过程为大鼠完成翻正反射，记录其完成的日龄。(6)负向趋地性反射：大鼠头朝下放置在长30 cm、倾斜45°的木板中间，记录大鼠转身头向上将四爪放平并能够爬至木板顶端的日龄，如果大鼠未能在30 s内完成动作，则为阴性。
术后24 h及生后3周从组织学研究大鼠中取存活大鼠各8只行苏木精-伊红(HE)染色。大鼠乙醚麻醉后，先以生理盐水、继以4%多聚甲醛通过左心室插管灌注，小心剥取脑组织固定于4%多聚甲醛48 h。脑组织标本经酒精分级脱水石蜡包埋，连续冠状切片(厚6 μm)，行HE染色及髓磷脂碱性蛋白( MBP)免疫组化染色，选取前连合侧脑室平面进行分析。
应用SPSS18.0统计软件。符合正态分布的计量资料以
±s表示，两组间同一时间点比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
实验组48只大鼠术后24 h存活33只(68.8%)，对照组48只大鼠无死亡。去除两组用于组织学研究大鼠各16只，对照组生后3周存活率为100%(32 /32)，实验组为56.3%(18/32)，两组大鼠存活率差异有统计学意义(P<0.05)。术后1～2 d实验组大鼠出现皮肤紫绀、活动和进食减少，1只大鼠术后立即出现惊厥，随后死亡。28.1%(9/32)实验组大鼠术后1周内发生下肢单瘫，爬行时向健侧画圈；12.5%(4/32)发生双下肢瘫，爬行时摔倒。
两组存活大鼠术前体重差异无统计学意义(P>0.05)，实验组大鼠术后第1天均出现体重减轻，术后第2天起体重缓慢增长，至生后2周时体重增长明显加快。对照组假手术后体重逐渐增长。术后1 d～生后3周实验组大鼠体重均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
两组大鼠不同日龄体重比较(g，
±s)
两组大鼠不同日龄体重比较(g，±s)
| 组别 | 只数 | 术前 | 术后1 d | 术后2 d | 术后3 d | 生后1周 | 生后2周 | 生后3周 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 8 | 7.1±0.2 | 8.7±0.2 | 10.6±0.4 | 13.2±0.3 | 14.9±0.3 | 33.6±0.6 | 59.2±1.5 |
| 实验组 | 8 | 7.3±0.2 | 6.9±0.2 | 7.6±0.3 | 8.5±0.4 | 9.4±0.9 | 17.8±0.9 | 35.3±1.9 |
| t值 | 2.000 | 7.830 | 6.380 | 8.550 | 5.670 | 14.900 | 9.800 | |
| P值 | 0.470 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.010 | <0.001 | <0.001 |
实验组大鼠出现睁眼的时间晚于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组大鼠竖耳及门齿萌出时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
两组大鼠生理发育比较(d，
±s)
两组大鼠生理发育比较(d，±s)
| 组别 | 只数 | 睁眼时间 | 竖耳 | 门齿萌出 |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 8 | 13.0±0.3 | 9.0±0.0 | 10.3±0.4 |
| 实验组 | 8 | 16.4±1.2 | 10.0±0.0 | 10.6±0.9 |
| t值 | 2.740 | 0.000 | 0.310 | |
| P值 | 0.010 | 0.460 | 0.340 |
实验组大鼠出现眼睑反射及惊跳反射的日龄较对照组延迟，差异有统计学意义(P<0.05)；两组大鼠耳廓反射日龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
两组大鼠出现原始反射的日龄比较(d，
±s)
两组大鼠出现原始反射的日龄比较(d，±s)
| 组别 | 只数 | 眼睑反射 | 惊跳反射 | 耳廓反射 |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 8 | 8.0±0.4 | 8.4±0.3 | 15.5±0.2 |
| 实验组 | 8 | 11.0±0.6 | 11.2±0.9 | 18.6±1.5 |
| t值 | 4.170 | 2.950 | 2.200 | |
| P值 | 0.010 | 0.030 | 0.060 |
实验组大鼠下肢放置反射、上肢抓握反射及下肢抓握反射出现时间均较对照组延迟，差异有统计学意义(P<0.05)；两组大鼠上肢放置反射出现时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。
两组大鼠四肢运动发育情况比较(d，
±s)
两组大鼠四肢运动发育情况比较(d，±s)
| 组别 | 只数 | 上肢放置反射 | 下肢放置反射 | 上肢抓握反射 | 下肢抓握反射 |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 8 | 7.4±0.2 | 8.1±0.4 | 7.5±0.2 | 8.1±0.4 |
| 实验组 | 8 | 7.6±0.4 | 10.6±0.9 | 9.4±0.2 | 10.4±0.7 |
| t值 | 0.440 | 2.550 | 6.790 | 2.880 | |
| P值 | 0.060 | 0.040 | 0.030 | 0.020 |
实验组大鼠完成趋地性反射日龄明显迟于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组大鼠完成翻正反射日龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。
两组大鼠其他运动发育情况比较(d，
±s)
两组大鼠其他运动发育情况比较(d，±s)
| 组别 | 只数 | 翻正反射 | 趋地性反射 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 8 | 7.0±0.0 | 10.8±0.5 |
| 实验组 | 8 | 8.2±0.5 | 19.0±2.0 |
| t值 | 2.140 | 4.760 | |
| P值 | 0.080 | 0.010 |
术后24 h实验组存在皮质及脑室周围白质疏松，无明显脑室扩大。生后3周实验组大鼠出现脑室扩大及白质软化灶，脑白质有不同程度的胶质细胞增生。见图1。
A．术后24 h对照组皮质结构正常；B．术后24 h实验组皮质结构疏松；C．术后24 h对照组脑室周围白质结构正常；D．术后24 h实验组脑室周围白质疏松；E．生后3周对照组脑室正常；F．生后3周实验组脑室扩大；G．生后3周对照组脑组织结构正常；H．生后3周实验组脑白质出现组织坏死溶解
MBP免疫组化染色显示，随着髓鞘发育成熟，生后3周对照组大鼠脑白质区可见较为明显的棕褐色髓鞘，而实验组仅偶见散在的棕褐色髓鞘，密度稀、颜色浅。见图2。
A．对照组大鼠MBP染色阳性颗粒浓密；B．实验组大鼠MBP染色阳性颗粒减少
近年来，早产儿脑损伤的发病机制及防治成为研究热点，制备合适的动物模型是实验关键。目前临床多应用动物模型如鼠、兔等，通过诱导脑缺氧缺血或颅内注射微生物、细菌产物、兴奋性毒素来制备脑损伤模型，不同造模方式和选用不同动物类型均有各自的特点。
啮齿类动物由于遗传学一致、价格低廉，常用于研究各种行为和高级神经活动表现。Gibson和Clowry[8]应用7日龄小鼠，通过脑皮质下注射鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid，IBA)制作脑白质损伤动物模型。研究结果显示，这种造模方式不仅可引起实验组小鼠脑白质损伤，还可引起脑皮质严重损伤，因此近来很多学者都不主张应用该种方式制作脑损伤动物模型。Pang等[9]应用P5大鼠，通过颅内注射细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)造模。结果显示该种动物模型脑室扩大发生率高，但脑白质损伤发生较少。
结扎大鼠颈总动脉的方法近来被成功应用于研究未成熟少突胶质细胞缺氧缺血损伤的机制。Lin等[10]通过结扎P4大鼠双侧颈总动脉并吸入8%氧气20 min造模，通过免疫组化技术得出P6及P9实验组大鼠相比对照组脑白质O4＋O1＋标记阳性的少突胶质细胞前体细胞(pre-oligodendrocyte，preOL)减少，MBP减少，证实实验组大鼠发生了脑白质损伤。Uehara等[11]研究结果显示，结扎新生大鼠双侧颈总动脉后，皮质下大脑血流降至脑基础血流的25%左右，明显高于结扎单侧颈总动脉加吸入低浓度氧的模型(15%～17%)，可选择性损伤脑白质。因此，选择结扎双侧颈总动脉造模比结扎单侧颈总动脉加低氧吸入模型能更确切地模拟早产儿脑损伤特点。
在选择新生大鼠日龄时，Back和Rosenberg[12]研究证实人类脑白质易损时期为孕24～32周，此时脑内免疫标记O4＋O1-的preOL占优势，而相应大鼠脑白质易损时间为生后2～4 d，此时脑白质内以preOL为主，因此，进行早产儿脑白质损伤的研究宜选用生后2～4 d未成熟大鼠。因此本文择选取结扎3日龄大鼠双侧颈总动脉的方式造模。
早产儿脑损伤时病理多表现为脑白质脱髓鞘、轴突变性、组织疏松和反应性胶质细胞增生。大部分表现为脑白质萎缩及脑室扩大，也有表现为局灶脑白质损伤、再吸收及胶质细胞增生。MBP是构成髓鞘的重要成分，是轴突的特异性免疫标记物。早产儿脑白质损伤时由于白质脱髓鞘、轴突变性，出现MBP减少。本研究实验组大鼠术后24 h出现皮质下白质疏松和脑室周围白质疏松，此时期脑室无明显扩大。实验组大鼠3周时出现脑室扩大、白质软化灶，且均有不同程度的胶质细胞增生。免疫组化证实随着髓鞘发育成熟，对照组大鼠3周时脑白质区可见较为明显的棕褐色髓鞘，而实验组仅偶见散在的棕褐色髓鞘，且密度稀、颜色浅。这些病理表现与临床相符合。另外早期实验研究发现，结扎3日龄大鼠双侧颈总动脉后6 h，大鼠脑白质内的少突胶质细胞开始出现细胞肿胀及细胞内线粒体损伤，12 h少突胶质细胞开始发生凋亡[13]，也进一步从微观角度证实未成熟大鼠发生了脑白质损害。
实验过程中提高实验组大鼠存活率的方法包括：控制室温>22 ℃，以保持新生大鼠体温；适度麻醉；手术操作熟练并避免牵拉迷走神经；术后恢复时注意保持湿度50%；待大鼠活动完全恢复再回笼饲养。
大鼠的神经行为发育评价方法已成熟，曾被成功应用于大鼠创伤性脑损伤后神经行为发育的研究，近年来被应用到研究大鼠脑缺氧缺血损伤后的神经行为发育中。Lubics等[14]应用7日龄大鼠结扎单侧颈总动脉并吸入8%氧气2 h的方法造成新生大鼠缺氧缺血性脑损伤。比较实验组与对照组大鼠在体重、原始反射、运动协调性发育上的差异，结果显示实验组新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后存在生长发育障碍、睁眼时间延迟、原始反射抑制、四肢运动障碍及运动协调性下降。本研究也同样证实实验组大鼠术后存在生长发育落后。实验组大鼠术后1～2 d存在体重下降，与脑损伤后大鼠因神志抑制摄食活动减少导致脱水有关，也可能由于缺血损伤海马饮食中枢，造成食欲下降有关。本研究中仅观察到1只实验组大鼠发生惊厥，但由于实验组大鼠术后必须回笼由母鼠饲养，不利于观察，因此确切惊厥发生率较难统计。实验组出现睁眼及眼睑反射时间明显延迟，但出现竖耳及耳廓反射时间差异无统计学意义，可能与新生大鼠耳廓反射较难引出有关。
实验组与对照组新生大鼠上肢放置反射出现时间差异无统计学意义，而下肢放置反射出现时间两组差异有统计学意义，另外实验组大鼠上肢和下肢抓握反射出现时间较对照组延迟，差异有统计学意义。结合实验组大鼠在术后1周内多出现下肢偏瘫和双瘫，分析实验组未成熟大鼠脑损伤后可能主要影响下肢运动发育。
实验组大鼠出现翻正反射的时间与对照组差异无统计学意义，说明新生大鼠脑组织相比人类有一定的代偿能力。但一些实验证实应用相应的运动实验[15](如转轮实验、楼梯实验)对脑缺氧缺血的新生大鼠进行长期随访，仍能检测出实验组大鼠存在运动及认知缺陷。
总之，本研究应用3日龄未成熟SD大鼠，通过结扎双侧颈总动脉的方法造模，组织学证实实验组大鼠发生脑白质损伤。对实验组和对照组大鼠进行神经行为评价，证实实验组大鼠出现生长发育迟缓、原始反射受抑制、运动能力下降甚至惊厥、瘫痪，类似人类早产儿脑损伤后的发病情况。研究证实未成熟大鼠脑损伤后有一定代偿能力，但仍可应用相应的运动实验检测其运动及认知上的缺陷。
