探讨抑制低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)、激活Wnt信号通路对新生大鼠脑损伤是否有保护作用。
选取312只3日龄新生SD大鼠建立脑白质损伤(white matter damage，WMD)模型，随机分为单纯造模组(WMD组)、造模后抑制HIF-1α分解组(PHI组)，造模并抑制HIF-1α分解后激活Wnt信号通路组(PHI＋激活Wnt组)及造模并抑制HIF-1α分解后抑制Wnt信号通路组(PHI＋抑制Wnt组)。分别于造模后1、3、7、14 d取脑组织，采用免疫荧光法观察各组各时间点脑组织前体细胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC)及少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)的变化；采用免疫印迹技术测定各组各时间点脑组织HIF-1α蛋白表达情况；通过实时荧光定量聚合酶链反应技术检测各组各时间点脑组织HIF-1α及Wnt7a mRNA水平。于造模后28 d通过悬吊实验、旷场实验、避暗实验对各组大鼠进行行为学检测。
PHI＋激活Wnt组造模后1、3 d时OPC与造模后7、14 d时OL数量均明显多于其他3组。与WMD组相比，其他3组各时间点脑组织HIF-1α蛋白含量、HIF-1α与Wnt7a mRNA表达量均明显增加，尤其PHI＋激活Wnt组，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt7a表达与HIF-1α表达成正相关(r＝0.862，P<0.05)。造模后28 d各组大鼠悬吊实验评分差异无统计学意义(P>0.05)；WMD组大鼠旷场实验评分低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；PHI＋激活Wnt组大鼠记忆保留程度最高，PHI组次之，WMD组最低，WMD组、PHI组及PHI＋抑制Wnt组大鼠第1次进入暗箱的时间(潜伏期)均短于PHI＋激活Wnt组，WMD组进入暗箱的次数(错误次数)大于PHI＋激活Wnt组，差异有统计学意义(P<0.05)。
抑制HIF-1α分解并激活Wnt信号通路对新生大鼠脑损伤有部分修复作用。
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脑白质损伤(white matter damage，WMD)是早产儿缺氧缺血性脑损伤的主要病变基础。研究表明，少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC)对缺氧极其敏感，是WMD的主要受累部位[1,2]。缺氧后OPC损伤或死亡，继而导致少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)分化减少，最终造成中枢神经系统髓鞘化构建障碍[3,4,5,6]。
OPC在缺氧环境下可编码低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)。HIF-1通常以HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体形式存在，其中β亚基属结构单位，在细胞核中持续表达；α亚基是调节活性的功能亚单位，常氧状态可通过泛素蛋白酶途径迅速降解，胞浆中几乎检测不到。而在缺氧状态下，泛素蛋白酶途径受到抑制，HIF-1α在热休克蛋白90的作用下解离增加，进入细胞核内与β亚基结合，促使HIF-1α转录激活区域活性增加，并激活Wnt信号通路的Wnt7a/7b调控激素反应元件表达，该元件通过与转录因子结合使细胞周期停滞，细胞暂停于未分化的自我更新及增殖阶段[5,6,7,8,9,10]。当机体缺氧环境改善后，Wnt信号通路将进行自我调节，此时处于分化停滞阶段的OPC开始向OL定向分化[5]。
基于上述研究，如果能在早产儿生后早期通过抑制HIF-1α降解、较大程度激活Wnt信号通路，从而有效减少由缺氧所致的OPC损伤及丢失并促进其增殖，当机体缺氧状态改善时，则可有更多的OPC向OL分化，促进髓鞘化构建，继而维持中枢神经系统结构及功能稳定，对早产儿脑损伤可能具有保护作用。因此，本实验探讨抑制HIF-1α、激活Wnt信号通路对新生大鼠脑损伤是否有保护作用，为临床干预早产儿脑损伤提供思路。
选取3日龄SD新生大鼠312只，体重5～12 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2008-0004。随机分为单纯造模组(WMD组)、造模后抑制HIF-1α分解组(PHI组)、造模并抑制HIF-1α分解后激活Wnt信号通路组(PHI＋激活Wnt组)和造模并抑制HIF-1α分解后抑制Wnt信号通路组(PHI＋抑制Wnt组)各78只；每组再分为1、3、7、14、28 d 5个亚组，其中1、3、7、14 d亚组各18只，28 d亚组6只。
OL标记O4单克隆抗体、OPC标记O1单克隆抗体(宝曼生物，上海)；德克萨斯红抗小鼠IgM抗体(百奥博科技，北京)；异硫氰酸荧光素抗小鼠IgM抗体(Vector，美国)；Tublin抗体(Abcam，英国)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，碧云天，中国)；PHI试剂(Sigma，美国)；HIF-1α抗体(博士德，武汉)；Wnt通路抑制剂XAV939、激动剂LiCl(皓元生物，上海)。
所有大鼠七氟烷吸入麻醉后结扎左侧颈总动脉，恢复1 h后放置在2 L缺氧密闭容器中，以2.5 L/min的速度输入6%O2、94%N2混合气体，持续2 h，取出后放回空气中饲养。造模24 h后，WMD组侧脑室注射5 μl生理盐水，腹腔注射0.1 ml生理盐水；PHI组侧脑室注射5 μl PHI制剂，腹腔注射0.1 ml生理盐水；PHI＋激活Wnt组侧脑室注射5 μl PHI制剂，腹腔注射0.1 ml LiCl制剂；PHI＋抑制Wnt组侧脑室注射5 μl PHI制剂，腹腔注射0.1 ml XAV939制剂。
分别于造模后1、3、7、14 d取各组大鼠称重并断头取脑(每组各时间点均为18只)。
分别取造模后1、3、7、14 d各组大鼠全脑组织行冰冻切片，取侧脑室平面脑组织冰冻切片6张，于1、3 d切片上加入OPC标记O1的一抗，于7、14 d切片上加入OL标记O4的一抗，分别于4 ℃过夜，在暗室中加入对应二抗后室温避光放置1 h，加入核染料DAPI，封片后置于荧光显微镜下观察放大200倍后左侧脑白质区域OPC及OL形态和数量。
采用免疫印迹法。分别取造模后1、3、7、14 d各组大鼠左侧缺血周围白质脑组织约50 mg，加入3倍体积组织裂解液提取蛋白，整个过程于冰上进行，按照双联喹啉酸蛋白定量方法调节蛋白浓度。制备不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳(100 V 15 min，200 V 35 min)完毕后，将凝胶上的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上(300 mA 90 min)。予5%脱脂奶粉封闭，室温2 h，然后行特异性抗原条带监测，一抗(1∶200)4 ℃过夜，二抗(1∶500)室温孵育2 h，加入化学发光底物，利用凝胶成像分析系统数字显像。一抗分别为大鼠抗HIF-1α抗体、大鼠抗Tublin抗体，其中Tublin为内参。
采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法。分别取造模后1、3、7、14 d各组大鼠左侧缺血周边白质脑组织约50 mg，用Trizol法提取总RNA后测定RNA浓度及纯度。以2 μg RNA为模板，Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒逆转录成cDNA，以β-actin为内参将cDNA稀释10倍加入引物(表1)配成体系行PCR反应。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，循环40次。反应结束后，采用△△CT法计算目的基因相对定量。
PCR引物
PCR引物
| 名称 | 引物 |
|---|---|
| HIF-1α上游引物 | 5′-GCGGCGAGAACGAGAAGAAAAATAGG-3′ |
| HIF-1α下游引物 | 5′-TCACGTTGTGGGGAAGTGGCAA-3′ |
| Wnt7a上游引物 | 5′-CTCAAAGTGGGGAGTCGGGAGG-3′ |
| Wnt7a下游引物 | 5′-TGGTACTGGCCTTGCTTCTCCTT-3′ |
| 内参β-actin上游引物 | 5′-CATCACTATCGGCAATGAGCGGTT-3′ |
| 内参β-actin下游引物 | 5′-GATGCCACAGGATTCCATACCCAG-3′ |
注：PCR为聚合酶链反应，HIF为低氧诱导因子
分别取造模后28 d各组大鼠进行检测。(1)悬吊试验：将大鼠双前腿抓住一水平木棒，离开地面，记录大鼠掉下的时间。评分标准：≤10 s记1分，11～30 s记2分，31～120 s记3分，121 s～5 min记4分，>5 min记5分。(2)旷场试验：取大小为30 cm×30 cm×30 cm的无顶木盒，在盒底用黑线分成16个等大方格。将大鼠放置于中央方格中，观察5 min内大鼠1/2以上身体从所在方格进入相邻方格及大鼠后肢性站立、排便等情况。评分标准：大鼠1/2以上身体通过格子、排便、直立各记为1分，计算总分。(3)避暗实验：避暗箱分为明、暗两室，明室有灯光照亮，暗室底部铺有不锈钢栅，可通电电击动物，两室之间有一小洞可供大鼠自由通过。于实验前24 h将大鼠置于明室，利用大鼠趋暗性，预适应3 min后通电，并于24 h后正式实验，从大鼠进入明室开始计时，记录5 min内大鼠第1次进入暗箱的时间(潜伏期)和进入的次数(错误次数)，以此检测大鼠的记忆保留程度。
应用SPSS 21.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以
±s表示，多组比较采用方差分析，相同时间点两两比较采用SNK q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
对各组大鼠造模等处理后，WMD组死亡6只(7.7%)；PHI组死亡10只(12.8%)；PHI＋激活Wnt组死亡6只(7.7%)；PHI＋抑制Wnt组死亡8只(10.3%)，各组均补充大鼠至实验所需只数。各组存活大鼠均未见明显活动减少，但多喜向右侧偏移，其中WMD组偏移情况较为明显。造模后各组大鼠体重差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
不同时间各组大鼠体重比较(g，
±s)
不同时间各组大鼠体重比较(g，±s)
| 组别 | 只数 | 3 d | 7 d | 14 d | 28 da |
|---|---|---|---|---|---|
| WMD组 | 18 | 6.7±0.8 | 12.5±1.4 | 22.3±2.6 | 79.2±3.6 |
| PHI组 | 18 | 7.3±1.2 | 12.4±1.2 | 22.8±1.9 | 79.7±2.9 |
| PHI＋激活Wnt组 | 18 | 7.3±1.0 | 12.4±1.5 | 23.0±2.2 | 79.4±4.0 |
| PHI＋抑制Wnt组 | 18 | 6.7±0.9 | 11.5±1.6 | 22.8±2.7 | 78.8±3.1 |
| F值 | 0.812 | 0.581 | 0.091 | 0.065 | |
| P值 | 0.500 | 0.643 | 0.972 | 0.983 |
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解；a每组6只
造模后1、3 d切片中，除WMD组外的其余3组侧脑室周围白质均可见散在分布的OPC，尤其PHI＋激活Wnt组更明显；造模后7、14 d切片中，除WMD组外的其余3组侧脑室周围白质均可见散在分布的OL，尤其PHI＋激活Wnt组在同一层面、同一区域内数量明显增多。见图1、图2
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解
与WMD组相比，其余3组各时间点脑组织HIF-1α蛋白含量均明显增加，尤其PHI＋激活Wnt组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解
随着时间推移，各组大鼠脑组织HIF-1α与Wnt7a mRNA表达量均呈衰减趋势。与WMD组相比，其余3组HIF-1α与Wnt7a mRNA表达量在各时间点均明显增多，尤其是PHI＋激活Wnt组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。Wnt7a表达与HIF-1α表达成正相关(r＝0.862，P<0.05)，应用HIF-1α抑制剂后HIF-1α凋亡减少、Wnt7a含量增加。
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解；与WMD组比较，aP<0.05, bP<0.01
造模后28 d各组大鼠悬吊实验评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。
造模后28 d各组大鼠行为学检测结果(
±s)
造模后28 d各组大鼠行为学检测结果(±s)
| 组别 | 只数 | 悬吊实验(s) | 旷场实验(分) | 潜伏期(s) | 错误次数(次) |
|---|---|---|---|---|---|
| WMD组 | 6 | 2.3±0.4 | 24.0±10.0 | 27.9±21.0b | 2.8±1.3b |
| PHI组 | 6 | 2.0±0.7 | 43.8±13.2a | 64.2±11.8b | 2.0±0.8 |
| PHI＋激活Wnt组 | 6 | 2.4±0.5 | 48.0±5.5a | 241.6±69.9 | 0.5±0.6 |
| PHI＋抑制Wnt组 | 6 | 2.2±0.5 | 47.3±13.2a | 39.8±11.7b | 2.3±1.3 |
| F值 | 0.378 | 4.369 | 28.443 | 3.600 | |
| P值 | 0.771 | 0.027 | <0.001 | 0.046 |
注：WMD为脑白质损伤，PHI为抑制低氧诱导因子1α分解；a与WMD组比较，P<0.05; b与PHI＋激活Wnt组比较，P<0.05
造模后28 d WMD组大鼠旷场实验评分低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；PHI组、PHI＋激活Wnt组及PHI＋抑制Wnt组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。
造模后28 d PHI＋激活Wnt组大鼠记忆保留程度最高，PHI组次之，WMD组最低，WMD组、PHI组及PHI＋抑制Wnt组潜伏期均短于PHI＋激活Wnt组，WMD组错误次数大于PHI＋激活Wnt组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
围产期感染和缺氧缺血是早产儿WMD的重要影响因素，尤其对早产儿脑白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)的影响更为明显。采用脑缺血后缺氧的方式制作新生大鼠WMD模型与感染和放射损伤等方式构建的模型相比，更贴近于早产儿脑损伤的发生和演变。新生大鼠生后1～5 d脑细胞中晚期OL前体占主导[12]；生后5 d是脑组织神经元迁移的终末阶段，其成熟度相当于人类早产儿[13,14]；生后7 d左右大脑发育很快，脑组织中OL逐渐发育成熟并发生髓鞘化，大脑重量明显增加，其成熟度类似于人类足月或近足月，脑室周围白质对缺氧缺血造成损伤的易感性较弱，较少发生WMD。实验证明[15,16]，选取生后第2天的大鼠造模操作难度较大，大鼠死亡率较高；而选取3日龄大鼠造模成功率高，脑损伤主要表现在白质，病理改变与病情发展一致。
脑组织中OL的发育可分为5个阶段：先祖细胞、早期OPC、晚期OPC、未成熟OL、成熟OL[17]。胎龄23～32周是早产儿易发生PVL和WMD的时间段，在此期间晚期OPC是构成脑室周围白质的主要细胞，因此，理论上晚期OPC是早产儿脑室周围白质损伤中的关键靶细胞，比早期OPC或OL更易受到缺氧缺血损伤。既往研究也证实单侧脑缺氧缺血的幼鼠模型脑室下区凋亡细胞主要为OPC[13,18]。
造模后机体恢复过程中再灌注可引起反应性超氧阴离子和过氧化氢等自由基增加，而体外培养的OPC对自由基的攻击具有明显易损性，加入自由基清除剂如维生素E可减少因自由基攻击引起的OPC凋亡，对OPC有保护作用[19,20]。OPC的易损性同时依赖于脑发育的成熟度，OPC凋亡在损伤后48～72 h达到高峰[1]，所以本实验在大鼠脑损伤后抑制HIF-1α分解，使OPC停滞于早期阶段或更成熟阶段，使易受损的晚期OPC数目减少，从而减少OPC损伤。PHI的基础上辅以Wnt信号通路激活剂，OPC损伤情况明显缓解，且在恢复至常氧环境后Wnt通路中的活性蛋白Wnt7a含量增多，并作用于下游基因，使OPC重新启动细胞周期发育为晚期OPC、向OL分化增多，有助于后期中枢系统髓鞘化的建立。同时，在辅以Wnt信号通路抑制剂后Wnt通路中活性蛋白数量较激动剂组明显减少，OPC数目也减少，分化的OL也呈减少趋势，中枢神经系统髓鞘化建立适当延迟，这也提示了Wnt信号通路在促进HIF-1α修复WMD的过程中起重要作用。通过进一步验证，本研究结果显示Wnt7a表达与HIF-1α变化成正相关，这可能与低氧环境PHI后HIF-1α泛素化降解途径被阻断，进入细胞核内与β亚基结合数量增多，形成的HIF-1增多，从而通过低氧反应元件激活体内Wnt信号传导通路有关。
PVL是早产儿WMD的主要形式，能引起神经功能障碍或缺陷[21,22,23]，认知和行为功能改变主要取决于WMD的严重程度[24,25,26]。脑白质主要为神经元轴突及胶质细胞，中枢神经系统髓鞘由OL形成。WMD后，具有传导功能的髓鞘易发生断裂或形成减少，从而破坏神经元之间及皮质与中枢之间的信号传导，对中枢神经系统整体功能造成严重影响，临床上常表现为神经运动功能障碍、空间感觉障碍、学习记忆能力下降等，也可出现痉挛性双下肢瘫。
研究显示，WMD发生的高峰期内脑组织轴突发育尚不成熟，易受自由基损伤[27]，造成连续性缺失和髓鞘化形成障碍，这是造成脑性瘫痪的病理基础。WMD患儿神经行为障碍主要表现在幼儿期，通常认为造模后28 d大鼠在神经发育上相当于人类2～3岁幼儿[28]，因此对造模后28 d大鼠进行行为学检测结果比较可靠[29]。悬吊实验主要反映随意运动功能及肌力水平，旷场实验反映情感行为能力，避暗实验反映学习记忆能力。本研究结果显示，HIF-1α分解减少会对大鼠情感认知及记忆起保护作用。有研究表明，WMD通常引起脑内抑制功能降低，例如抗焦虑功能降低[30]，这可能与下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱有关[31]。本实验中PHI的大鼠情感认知功能较WMD组有所好转，但具体机制仍需进一步研究。
总之，3日龄未成熟大鼠WMD后通过抑制HIF-1α分解和激活Wnt信号通路，可有效减少由缺氧所致的OPC损伤及丢失，并能在一定程度上促进OPC增殖。因此当机体缺氧状态得到改善后，可有更多的OPC向OL分化，进一步促进中枢神经系统髓鞘化的形成，有助于维持中枢神经系统结构及功能稳定，对WMD具有部分修复作用。
