探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosyl transferase 1A1,UGT1A1)基因多态性与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症之间的关系。
选择金华市中心医院2016年1月至2017年12月产科或新生儿监护室收治的不明原因非结合性高胆红素血症足月新生儿为高胆组,同期收治的生理性黄疸或健康足月新生儿为对照组,进行前瞻性研究,提取患儿全血DNA,经聚合酶链反应扩增后对UGT1A1全外显子进行Sanger测序和HGMD数据库查询,分析UGT1A1基因型分布、基因型频率,以及不同基因型与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的相关性。
高胆组共纳入240例,对照组共纳入216例。在UGT1A1基因上发现4个与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症相关的突变位点,分别是c.211G>A(Gly71Arg)、c.686C>A(Pro229Gln)、c.1091C>T(Pro364Leu)、c.1456T>G(Tyr486Asp),高胆组各突变位点占比依次为83.9%(141/168)、1.8%(3/168)、8.9%(15/168)和5.4%(9/168);基因型频率和等位基因频率分析显示,高胆组c.211G>A、c.1456T>G两个位点的分布频率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),c.686C>A和c.1091C>T两个位点在两组中的分布差异无统计学意义(P>0.05);二分类变量Logistic回归分析显示,c.211G>A和c.1456T>G两个位点的基因突变与不明原因非结合性高胆红素血症的发生有关,OR值(95%CI)分别为5.412(3.567~8.212)、8.377(1.052~66.670);其中在c. 211G>A位点不同基因型中,携带纯合突变型(AA)的患儿血清总胆红素和非结合胆红素水平均高于携带杂合突变型(GA)的患儿和野生型(GG)患儿,差异有统计学意义(P<0.05)。
UGT1A1基因最常见的突变位点是c.211G>A;c.211G>A和c.1456T>G两位点突变是新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的高危因素;c.211G>A位点纯合突变型患儿血清胆红素水平显著高于杂合突变型和野生型。
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黄疸是新生儿常见的临床症状,近50%的足月儿和80%的早产儿会发生黄疸[1]。尽管大部分黄疸可以自然消退,但由于胆红素在不同个体的代谢差异或病理因素,部分患儿可出现严重高胆红素血症,甚至引起胆红素脑病及核黄疸,导致智力低下、听力障碍、脑性瘫痪等神经功能损害,给家庭和社会造成沉重负担。研究证实非结合胆红素中的游离胆红素是引起胆红素脑损伤的关键[2]。近年来,随着对非结合性高胆红素血症发病机制的不断研究,发现尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP- glucuronosyl transferase,UGT)活性在黄疸的发病中有重要作用[3],尤其是UGT基因序列UGT1家族中第一外显子UGT1A1的基因型对UGT的活性起决定性作用。UGT1A1基因所编码的产物胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(bilirubin UDP glucuronosyltrasferase,B-UGT)在葡萄糖醛酸化的作用下能使非结合胆红素转变成结合胆红素。UGT1A1基因突变可导致此酶缺陷或活性降低,使非结合胆红素葡萄糖醛酸化障碍而无法排出体外,导致体内非结合胆红素升高。因此,本课题拟通过对无亲缘关系的不明原因非结合性高胆红素血症患儿进行UGT1A1基因全外显子测序,进一步了解UGT1A1不同基因型与非结合性高胆红素血症之间的关系。
选择2016年1月至2017年12月入住我院产科或新生儿监护室的足月、正常出生体重新生儿进行前瞻性研究。本研究经过医院伦理委员会批准(2016伦审第125号),患儿家属均签署知情同意书。
(1)胎龄37~42周,出生体重2 500 g以上;(2)出现黄疸症状到入院诊治时间在2周以内;(3)参考《新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识》[4],血清总胆红素水平高于美国Bhutani等[5]绘制的新生儿小时胆红素列线图95百分位,且以非结合胆红素升高为主。
(1)胎龄37~42周,出生体重2 500 g以上;(2)血清总胆红素水平低于《新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识》[4]干预值的生理性黄疸或血清总胆红素水平正常的新生儿。
(1)母婴ABO血型或Rh血型不合溶血病;(2)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症引起的溶血病;(3)其他红细胞相关疾病引起的溶血病,包括球形红细胞增多症、地中海贫血等;(4)感染相关性黄疸;(5)出血引起的血管外溶血;(6)胎粪排出延迟、早期喂养不足或体重异常下降或脱水引起的黄疸;(7)甲状腺功能减退或异常;(8)母乳性黄疸;(9)其他病因,主要包括糖尿病母亲婴儿、21三体综合征、孕母特殊用药等围产期高危因素,以及先天畸形等;(10)患儿家长不同意参加此研究。
高胆组收集检测血常规剩余的EDTA抗凝血200~400 μl,-20℃保存备用。对照组在新生儿做遗传病筛查时吸取3滴末梢血分别滴于干纸片上,制成干血斑,常温保存备用。
高胆组用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒;对照组用TIANGEN干血斑基因组DNA提取试剂盒;严格按照说明书进行操作。所得产物用Thermo NanoDrop 2000检测,确保核酸浓度在25~100 ng/μl,A260/A280>1.65以上,放置-20℃保存备用。
根据UGT1A1基因全序列,用Primer 5.0软件对5个全外显子进行引物设计。见表1。
序号 | UGT1A1基因片段 | 引物序列(5 ′ ~3 ′) | 引物长度(bp) | 产物长度(bp) |
---|---|---|---|---|
1 | Exon 1.1 | F:TCCCTGCTACCTTTGTGGAC | 20 | 694 |
R:CTGGGTAGCCTCAAATTCCA | 20 | |||
2 | Exon 1.2 | F:AAGCAGCTTTGATGTCATGC | 20 | 681 |
R:TCCACTGGAGCACACAGAGT | 20 | |||
3 | Exon 2 | F:CAAACACGCATGCCTTTAATC | 21 | 366 |
R:GCAGGGAAAAGCCAAATCTA | 20 | |||
4 | Exon 3 | F:CAAAACAAGATGCCGGAAGT | 20 | 451 |
R:TTACTCACATGCCCTTGCAG | 20 | |||
5 | Exon 4 | F:TGGGGTATCTCAACCCACAT | 20 | 603 |
R:GGAGGTTGCAGTAAGCCAAG | 20 | |||
6 | Exon 5 | F:TTCTTAAGCAGCCATGAGCA | 20 | 710 |
R:ACCTTTGAATCCCGCACTC | 19 |
注:UGT1A1为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1,表2-4同
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应体积25 μl,包含核模板1 μl、2×EX Taq 12.5 μl、Primer F/R各1 μl、H2O 9.5 μl。扩增条件:①95℃预变性5 min;②95℃变性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸45 s,每个循环退火温度降低0.5℃,20个循环;③95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,15个循环;④72℃延伸5 min。DNA测序委托华大基因科技股份有限公司进行,测序结果应用Chromas软件查看;突变位点应用Mutation Surveyor 4.0软件分析,选取UGT1A1基因序列(NM_019075.2)为标准序列;突变位点信息应用HGMD数据库查询。
应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以±s表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,两组间比较采用两独立样本t检验;非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,组间比较采用秩和检验;计数资料以例(%)表示,组间比较采用χ2检验或者Fisher精确概率法;基因突变对新生儿不明原因非结合性高胆红素血症影响的优势比(odds ratio,OR)和95%可信区间(confidence interval,CI)采用二分类变量Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
研究期间共收治足月、正常出生体重新生儿7 760例。符合高胆组入选标准369例,排除129例,共纳入240例,其中男129例,女111例;胎龄(38.9±1.2)周;出生体重(3 252±403)g;日龄5(4,7)d;总胆红素(314.3±49.3)μmol/L,非结合胆红素(306.4±48.5)μmol/L。符合对照组入选标准3 384例,排除3 168例,共纳入216例,其中男114例,女102例;胎龄(38.8±1.3)周;出生体重(3 207±363)g;日龄5(3,7)d;总胆红素(58.4±28.9)μmol/L,非结合胆红素(53.4±28.6)μmol/L。两组性别、胎龄、出生体重、日龄差异均无统计学意义(P>0.05)。
通过对高胆组和对照组进行UGT1A1全外显子测序、HGMD数据库查询和Alamut功能软件预测,发现4个与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症致病相关的突变位点,分别是:1号外显子c.211G>A(Gly71Arg);1号外显子c.686C>A(Pro229Gln);4号外显子c.1091C>T(Pro364Leu);5号外显子c.1456T>G(Tyr486Asp)。2、3号外显子未发现突变位点。见图1。高胆组共检出168个突变位点,其中c.211G>A位点最常见,占83.9%(141/168),包含85.1%(120/141)的杂合突变型和14.9%(21/141)的纯合突变型,其他依次为c.686C>A占1.8%(3/168),c.1091C>T占8.9%(15/168),c.1456T>G占5.4%(9/168)。
对照组和高胆组4个突变位点的基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),说明所选的研究对象基因频率分布具有人群代表性。高胆组和对照组c.211G>A位点突变率分别为58.8%(141/240)和20.8%(45/216),c.1456T>G位点突变率分别为3.8%(9/240)和0.5%(1/216),两组两个位点的基因型频率和等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05);两组c.686C>A和c.1091C>T两个位点的基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
组别 | 例数 | 基因型频率 | 等位基因频率 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
野生型 | 杂合突变型 | 纯合突变型 | |||||
c.211 G>A | GG | GA | AA | G | A | ||
高胆组 | 240 | 99(41.2) | 120(50.0) | 21(8.8) | 318(66.2) | 162(33.8) | |
对照组 | 216 | 171(79.2) | 45(20.8) | 0(0) | 387(89.6) | 45(10.4) | |
χ2值 | 82.657 | 70.553 | |||||
P值 | <0.001 | <0.001 | |||||
c.686 C>A | CC | CA | AA | C | A | ||
高胆组 | 240 | 237(98.8) | 3(1.2) | 0(0) | 477(99.4) | 3(0.6) | |
对照组 | 216 | 216(100) | 0(0) | 0(0) | 432(100) | 0(0) | |
χ2值 | -a | -a | |||||
P值 | 0.250 | 0.251 | |||||
c.1091 C>T | CC | CT | TT | C | T | ||
高胆组 | 240 | 225(93.8) | 15(6.2) | 0(0) | 465(96.9) | 15(3.1) | |
对照组 | 216 | 207(95.8) | 9(4.2) | 0(0) | 423(97.9) | 9(2.1) | |
χ2值 | 0.990 | 0.963 | |||||
P值 | 0.320 | 0.326 | |||||
c.1456 T>G | TT | TG | GG | T | G | ||
高胆组 | 240 | 231(96.2) | 9(3.8) | 0(0) | 471(98.1) | 9(1.9) | |
对照组 | 216 | 215(99.5) | 1(0.5) | 0(0) | 431(99.8) | 1(0.2) | |
χ2值 | 4.297 | 4.249 | |||||
P值 | 0.038 | 0.039 |
注:a采用Fisher精确概率法
二分类变量Logistic回归分析显示,c. 211G>A和c.1456T>G两个位点的突变型(含杂合突变型和纯合突变型)与野生型相比,差异均有统计学意义(P<0.05);c.686C>A和c.1091C>T两个位点各基因型差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
突变位点 | 型别 | 高胆组(例) | 对照组(例) | 总突变率(%) | Wald值 | OR值 | 95%CI | P值 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
c.211G>A | 野生型 | 99 | 171 | 40.8 | 62.998 | 5.412 | 3.567~8.212 | <0.001 |
突变型a | 141 | 45 | ||||||
c.686C>A | 野生型 | 237 | 216 | 0.7 | 0.000 | 1.472E9 | 0.000~0.000 | 0.999 |
杂合突变型 | 3 | 0 | ||||||
c.1091C>T | 野生型 | 225 | 207 | 5.3 | 0.977 | 1.533 | 0.657~3.579 | 0.323 |
杂合突变型 | 15 | 9 | ||||||
c.1456T>G | 野生型 | 231 | 215 | 2.2 | 4.033 | 8.377 | 1.052~66.670 | 0.045 |
杂合突变型 | 9 | 1 |
注:a包含杂合突变型和纯合突变型
通过对高胆组4个突变位点不同基因型与患儿血清胆红素水平的比较显示,c.211G>A位点不同基因型患儿总胆红素和非结合胆红素水平差异有统计学意义(P<0.05),纯合突变型(AA)的患儿总胆红素和非结合胆红素水平高于杂合突变型(GA)和野生型(GG)患儿,差异有统计学意义(P<0.05);杂合突变型(GA)和野生型(GG)患儿差异无统计学意义(P>0.05)。c.686C>A、c.1091C>T和c.1456T>G 3个位点各基因型患儿血清胆红素水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。
基因型 | 例数 | 总胆红素 | 结合胆红素 | 非结合胆红素 | |
---|---|---|---|---|---|
211GG | 99 | 309.9±48.4a | 7.8±2.5 | 302.1±47.8a | |
211GA | 120 | 313.3±50.3a | 7.8±2.4 | 305.5±49.3a | |
211AA | 21 | 340.7±40.1 | 8.4±2.1 | 332.3±40.9 | |
F值 | 3.492 | 0.543 | 3.480 | ||
P值 | 0.032 | 0.582 | 0.032 | ||
686CC | 237 | 314.6±49.4 | 7.9±2.4 | 306.8±48.6 | |
686CA | 3 | 287.5±33.8 | 5.9±1.6 | 281.5±34.5 | |
t值 | 0.948 | 1.381 | 0.895 | ||
P值 | 0.344 | 0.169 | 0.372 | ||
1091CC | 225 | 313.8±48.4 | 7.8±2.4 | 306.0±47.6 | |
1091CT | 15 | 321.3±63.1 | 8.1±2.7 | 313.2±62.1 | |
t值 | -0.570 | -0.393 | -0.560 | ||
P值 | 0.569 | 0.695 | 0.576 | ||
1456TT | 231 | 314.8±49.1 | 7.9±2.4 | 307.0±48.3 | |
1456TG | 9 | 300.6±56.4 | 7.5±2.6 | 293.0±55.1 | |
t值 | 0.851 | 0.417 | 0.844 | ||
P值 | 0.396 | 0.677 | 0.400 |
注:a与211AA比较,P<0.05
新生儿黄疸是儿科常见临床病症,研究表明,位于染色体2q37的3′端UGT1A1基因突变可引起B-UGT结构异常和功能缺失[6],而B-UGT是胆红素结合的关键酶,此酶缺陷可导致非溶血性非结合性高胆红素血症。UGT1A1基因序列改变是引起先天性葡萄糖醛酸转移酶缺乏所致非结合性高胆红素血症的病理基础。本研究对240例不明原因的非结合性高胆红素血症新生儿进行UGT1A1全外显子测序,发现4个与该病相关的突变位点,包括c.211G>A(Gly71Arg)、c.686C>A(Pro229Gln)、c.1091C>T(Pro364Leu)和c.1456T>G(Tyr486Asp)。
以往的UGT1A1基因突变研究显示,外显子区域以c.211G>A(Gly71Arg)突变居多。本研究中c.211G>A位点总突变率为40.8%(186/456),是本地区UGT1A1基因最常见的突变位点;在非结合性高胆红素血症患儿中突变频率为58.8%(141/240),高于广西(28.0%)[7],低于新疆(61.1%)[8]和山西(93.3%)[9]。该突变主要发生在亚洲人群,在其他人群如高加索人中极为少见[10],提示UGT1A1基因型呈现地域分布和人类种群差异。本研究结果显示,高胆组c.211G>A基因型频率和等位基因频率与对照组差异有统计学意义,该位点突变可能是新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的危险因素。马来西亚Wong等[11]和泰国Prachukthum等[12]的研究也证实这一观点。本研究对该位点不同基因型与患儿血清胆红素水平的进一步分析显示,携带纯合突变型(AA)的患儿与携带杂合突变型(GA)的患儿和野生型(GG)患儿相比,总胆红素和非结合胆红素水平差异均有统计学意义,这与Prachukthum等[12]和Maruo等[13]的研究结果相似。这可能与该突变致71位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸,导致UGT活性降低有关;c.211G>A纯合突变和杂合突变会使UGT活性分别下降60.2%和32.2%。
本研究中c.1456T>G(Tyr486Asp)位点总突变率为2.2%(10/456),占高胆组所有检出突变位点的5.4%(9/168);基因型频率和等位基因频率分析显示,高胆组c.1456T>G基因型频率和等位基因频率与对照组差异有统计学意义,提示该位点突变亦是新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的高风险因素。该位点突变导致486位酪氨酸变为天门冬氨酸。Yamamoto等[14]研究结果显示,Y486D纯合型突变将使B-UGT活性下降至正常的7.6%左右。本研究中高胆组未检测到c.1456T>G纯合突变,只有9例c.1456T>G杂合突变,而对照组中只检测到1例杂合突变;高胆组c.1456T>G杂合突变型和野生型患儿总胆红素和非结合胆红素水平差异无统计学意义。由于该位点突变率低,突变标本少,明确c.1456T>G不同基因型和血清胆红素水平的关系还需要大量的研究数据支持。
本研究中c.686C>A(Pro229Gln)和c.1091C>T(Pro364Leu)两个位点的总突变率分别为0.7%(3/456)和5.3%(24/456),占高胆组中所有检出突变位点的1.8%(3/168)和8.9%(15/168);基因型频率和等位基因频率分析显示,高胆组与对照组相比,c.686C>A和c.1091C>T基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义;该位点与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症无关;高胆组c.686C>A和c.1091C>T不同基因型患儿的血清总胆红素和非结合胆红素水平差异也无统计学意义。
此外,本研究结果显示对照组c.211G>A杂合突变型占20.8%(45/216),说明单纯的c.211G>A杂合型突变并不是新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的决定因素;高胆组36.3%(87/240)的患儿在UGT1A1全外显子无突变位点,说明除了UGT1A1基因突变,还有其他因素与新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的发生相关,包括启动子TATA盒区域TA插入突变[15]、上游苯巴比妥反应增强元件PBREM突变、有机阴离子转运体1B1基因突变[16]、环境及围生期因素等。
综上所述,c.211G>A位点突变是UGT1A1最常见的突变位点,c.211G>A和c.1456T>G是本地区新生儿不明原因非结合性高胆红素血症的危险因素。c.211G>A位点纯合突变患儿血清胆红素水平显著高于杂合突变型和野生型。UGT1A1基因型的检测,尤其是c. 211G>A和c.1456T>G两个突变位点的检测对于新生儿高胆红素血症高危人群的筛查和病因分析有一定指导意义[17,18]。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突