评价血浆谷氨酰胺转胺酶2（TGM2）水平对克罗恩病（CD）患者内镜下活动的监测价值。
收集2017年10月至2018年10月在中山大学附属第一医院行肠镜检查的CD患者及健康志愿者的血浆标本，使用酶联免疫吸附法测定血浆TGM2浓度。根据CD活动指数（CDAI）及CD内镜下严重程度指数（CDEIS）评估疾病临床活动和内镜下活动情况。收集CD患者肠镜前后3 d内的C-反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）及血小板计数（PLT）。
70例患者中，33例（47.1%）处于疾病临床活动期，38例（54.3%）存在内镜下活动。内镜下活动的CD患者血浆TGM2浓度高于内镜下缓解的患者[12.70（4.95，29.71）μg/L比0.37（0，2.23）μg/L，P<0.01]及健康对照组[12.70（4.95，29.71）μg/L比0.74（0，2.04）μg/L，P<0.01]，差异有统计学意义。CD患者血浆TGM2浓度与CDAI（ρ= 0.647，P<0.01）及CDEIS（ρ= 0.727，P<0.01）具有相关性。患者血浆TGM2浓度（AUC= 0.871，P<0.01）、CRP（AUC=0.703，P<0.01）及ESR（AUC= 0.702，P<0.01）对内镜下活动具有诊断价值，其中血浆TGM2浓度诊断效能最高，最佳诊断阈值为4.81 μg/L，敏感性为76.32%，特异性为93.75%。
血浆谷氨酰胺转胺酶2可作为血浆生物标志物监测CD患者内镜下疾病活动情况。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
克罗恩病（Crohn′s disease，CD）的主要治疗目标已从诱导并维持临床缓解转向内镜下缓解及黏膜愈合[1]。与疾病内镜下活动的患者相比，疾病内镜下缓解或黏膜愈合的患者预后更好、住院率及手术率更低[2]。因此，内镜下疾病活动程度的监测在CD患者疾病管理中尤为重要。谷氨酰胺转胺酶2（transglutaminase 2，TGM2）是一类具有催化蛋白质赖氨酸上的e氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基结合，从而导致蛋白质（或多肽子）之间发生共价交联作用的多功能酶，在炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要作用[3,4]。尿液中TGM2浓度可作为生物标志物监测IgA肾病及狼疮性肾病活动[5]，但尚未检索到探讨其在CD中的作用的研究。本研究拟探讨血浆TGM2浓度是否能作为生物标志物监测CD内镜下疾病活动情况。
前瞻性纳入2017年10月至2018年10月在中山大学附属第一医院拟行肠镜检查的CD患者70例和中山大学附属第一医院内镜室体检肠镜检查正常的健康志愿者35例。CD患者纳入标准：（1）明确诊断CD；（2）年龄小于70岁；（3）可获得结肠镜检查前后3 d内的血C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）及血小板计数（platelets，PLT）检测结果。CD诊断标准参考2016年CD诊治欧洲循证共识意见[6]。根据蒙特利尔分型标准对CD进行疾病分型[6]。排除标准：（1）单纯上消化道型CD；（2）患有其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等；（3）患有哮喘、过敏性荨麻疹等过敏性疾病；（4）近1个月曾有呼吸道、泌尿道感染等急性感染史；（5）处于妊娠期、哺乳期、病毒性肝炎活动期等。健康志愿者纳入标准：（1）既往无胃肠道疾病、自身免疫性疾病等任何慢性疾病和肿瘤病史，以及1个月内无急性感染史；（2）肠镜检查正常。70例CD患者中，男48例（68.6%），女22例（31.4%），中位年龄28（21，37）岁。健康志愿者中，男20例（57.1%），女15例（42.9%），中位年龄为25（24，32）岁。CD组与健康对照组之间性别及年龄差异均无统计学意义。
患者及健康志愿者均知情并签署知情同意书。本研究已获得中山大学附属第一医院临床科研与实验动物伦理委员会批准[伦申（2019）084号]。
所有纳入研究的CD患者及健康志愿者均在知情同意后开始收集临床资料及静脉血样，静脉血样送检TGM2。
记录患者的年龄、性别、CRP、ESR及PLT等临床数据及测定患者血浆TGM2浓度。根据克罗恩病疾病活动指数（Crohn′s disease activity index，CDAI）判断患者疾病活动度，根据CD内镜下严重程度指数（Crohn′s disease endoscopic index of severity，CDEIS）评估内镜下活动度。
根据CDAI将CD患者分为疾病临床活动组（CDAI≥150）和疾病临床缓解组（CDAI<150）两个亚组。根据CDEIS将CD患者分为内镜下活动组（CDEIS>3）和内镜下缓解组（CDEIS≤3）两个亚组。35例健康志愿者为健康对照组。
分别比较分析各组患者及健康志愿者的血浆TGM2浓度差异；比较分析各组患者之间临床指标的差异；分析各临床指标与CDAI及CDEIS的相关性；分析血浆TGM2浓度、CRP及ESR等临床指标对CD患者内镜下活动的诊断最佳临界值、敏感度和特异度。
在肠镜检查前后3 d内，使用含EDTA-K2抗凝剂的采血管采集研究对象的肘部静脉血液3 ~ 4 ml。采集血标本后30 min内在4 ℃条件下1900g离心10 min，转移上清至1.5 ml离心管。然后在4 ℃条件下16 000g离心10 min去除剩余细胞成分，将上层血浆转移至另一新的1.5 ml离心管。采集的血浆转移至-80 ℃冰箱保存，并在两周内完成TGM2浓度测定。
TGM2酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒由英国RayBiotech Life公司生产，酶标仪由瑞士Tecan公司生产，型号为F50。
（1）配置试剂：将试剂盒中试剂复温至室温。使用试剂盒中样本稀释液将血浆样本稀释3倍及配置TGM2标准品梯度溶液（200 μg/L、80 μg/L、32 μg/L、12.80 μg/L、5.120 μg/L、2.048 μg/L、0.819 μg/L、0 μg/L）。使用蒸馏水将20 ×清洗缓冲液配置成适量1 ×清洗缓冲液。使用抗体及生物素稀释液配置适量生物素抗体工作液及辣根过氧化物酶偶联亲和素工作液；（2）酶联免疫吸附法测定TGM2浓度：在预包被抗体的96孔中每孔加入稀释后血浆样本或标准品梯度溶液100 μl，每个样本或标准品梯度溶液设置一个副孔，在圆周震荡摇床上室温孵育2.5 h。甩去孔中液体，每孔加入300 μl 1 ×清洗缓冲液清洗4次，最后一次清洗后在干纸巾上拍干孔中剩余液体。清洗后每孔加入100 μl生物素抗体工作液，圆周震荡摇床上室温孵育1 h后甩干孔中液体。1 ×清洗缓冲液清洗4次，方法同前。清洗后每孔加入100 μl亲和素工作液，圆周震荡摇床上室温孵育45 min后甩干孔中液体。1 ×清洗缓冲液清洗4次，方法同前。清洗后每孔加入100 μl四甲基联苯胺显色液，圆周震荡摇床上室温孵育30 min后加入50 μl终止液。立即在450 nm波长下酶标仪读数；（3）标准曲线绘制及TGM2浓度计算：使用CurveExpert 1.4软件绘制TGM2浓度-吸光度标准曲线，得到标准曲线方程，将各样品吸光度代入方程后计算各样本TGM2浓度。
采用IBM SPSS 24.0软件对数据进行分析。符合偏态分布的定量资料以M（P25，P75）表示，两组间均数比较使用Mann-Whitney秩和检验，多样本均数比较使用Kruskal-Wallis秩和检验后Bonferroni法两两比较平均秩和。相关性分析采用Spearman相关系数分析。采用SPSS软件绘制ROC曲线并使用MedCalc软件计算各指标ROC曲线下面积、诊断最佳临界值、敏感度、特异度并比较各指标之间的诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。
70例CD患者中，33例（47.1%）为疾病临床活动期，37例（52.9%）为疾病临床缓解期；38例（54.3%）为内镜下活动期，32例（45.7%）为内镜下缓解期。CD确诊的年龄为A1型（≤16岁）、A2型（17 ~ 40岁）和A3型（>40岁）分别有9例（12.9%）、51例（72.9%）和10例（14.3%）。病变部位为L1型（回肠型）、L2型（结肠型）和L3型（回结肠型）分别有8例（11.4%）、5例（7.1%）和57例（81.4%），其中合并肛周病变34例（48.6%），累及上消化道者12例（17.1%）。疾病行为B1型（非狭窄非穿透型）、B2型（狭窄型）和B3型（穿透型）分别有39例（55.7%）、16例（22.9%）和15例（21.4%）。在肠镜检查前使用糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂、沙利度胺、全肠内营养、美沙拉嗪及其他治疗的CD患者分别有9例（12.9%）、20例（28.6%）、13例（18.6%）、5例（7.1%）、4例（5.7%）、8例（11.4%）和11例（15.7%）。
健康对照组患者的血浆TGM2浓度为0.74（0，2.04）μg/L。CD患者各亚组的血浆TGM2浓度、CRP、ESR和PLT计数见表1。
健康对照组及CD患者血浆TGM2浓度、CRP、ESR、PLT计数结果
健康对照组及CD患者血浆TGM2浓度、CRP、ESR、PLT计数结果
| 组别 | 例数 | TGM2浓度（μg/L） | CRP（mg/L） | ESR（mm/h） | PLT（109/L） |
|---|---|---|---|---|---|
| 健康对照组 | 35 | 0.74（0，2.04） | / | / | / |
| 疾病临床活动组 | 33 | 16.49（5.22，47.96） | 18.4（5.29，40.25） | 37（24，59） | 267（230，346） |
| 疾病临床缓解组 | 37 | 0.55（0，3.21） | 1.74（0.79，8.75） | 14（8，31.5） | 296（220，436） |
| 内镜下活动组 | 38 | 12.70（4.95，29.71） | 13.25（4.27，32.38） | 33（22，55） | 296.5（226.5，412.8） |
| 内镜下缓解组 | 32 | 0.37（0，2.23） | 1.90（1.05，8.24） | 14（8，36） | 262.7（229.3，332） |
注：TGM2为谷氨酰胺转胺酶2；CRP为C-反应蛋白；ESR为红细胞沉降率；PLT为血小板计数
疾病临床活动组血浆TGM2浓度高于疾病临床缓解组（Z = 5.565，P<0.01）及健康对照组（Z= 5.074，P<0.01）；疾病临床缓解组与健康对照组之间血浆TGM2浓度的差异无统计学意义（P= 0.566）。内镜下活动组血浆TGM2浓度高于内镜下缓解组（Z= 5.447，P<0.01）及健康对照组（Z= 5.572，P<0.01）；内镜下缓解组与健康对照组之间血浆TGM2浓度的差异无统计学意义（P= 0.995）。
疾病临床活动组的CRP（U= 3.971，P<0.01）和ESR（U= 3.266，P<0.001）均高于疾病临床缓解组，而PLT计数两组间差异无统计学意义（P= 0.120）。内镜下活动组中的CRP（U= 2.912，P<0.01）和ESR（U= 2.902，P<0.01）均高于内镜下缓解组，而PLT计数两组间差异无统计学意义（P= 0.088）。
血浆TGM2浓度（ρ= 0.647，P<0.01）、CRP（ρ= 0.483，P<0.01）及ESR（ρ= 0.465，P<0.01）与CDAI呈正相关，而PLT与CDAI无显著相关（ρ= 0.182，P= 0.131）。
血浆TGM2浓度（ρ= 0.727，P<0.01）、CRP（ρ= 0.505，P<0.01）、ESR（ρ= 0.448，P<0.01）及PLT（ρ= 0.312，P<0.01）均与CDEIS呈正相关。
ROC曲线分析结果显示，血浆TGM2浓度（AUC= 0.871，P<0.01）、CRP（AUC= 0.703，P<0.01）、ESR（AUC = 0.702，P<0.01）对CD患者内镜下活动均有诊断价值，而PLT对CD患者内镜活动无诊断价值（AUC = 0.619，P = 0.088）。血浆TGM2浓度诊断价值均高于CRP（P = 0.017）及ESR（P = 0.021），而CRP和ESR诊断价值的差异无统计学意义（P = 0.989）。将血浆TGM2浓度>4.81 μg/L作为预测阈值时，Youden指数达到最高值0.70，敏感性为76.32%，特异性为93.75%。血浆TGM2浓度、CRP、ESR、PLT对CD内镜下活动的诊断效能见图1。
目前CD的治疗目标已从维持症状缓解转向黏膜愈合，因此，对CD患者内镜下活动度的监测已成为了CD疾病管理的重中之重。虽然肠镜是评估CD患者内镜下活动程度的金标准，但由于肠镜为侵入性检查，患者依从性较差，而且对CD患者内镜下活动度的评分需要专业的内镜医生评估，更限制了其在CD患者门诊随访的应用[7]。CD患者的疾病临床活动程度与内镜下活动程度并不完全平行，如果仅依靠疾病临床活动程度指导CD患者疾病管理，会使患者面临疾病进展或过度治疗的风险[8]。临床常用的炎性标志物CRP及ESR虽然对患者内镜下活动的监测有一定价值，但特异性较差[9]。因此，寻找能较好监测CD患者内镜活动的新的无创性检查具有重要意义。
近年来，部分新的生物标志物已用于监测CD患者内镜下活动。其中，粪便钙卫蛋白与内镜下活动程度具有很高的相关性，最具用临床应用前景[10]。然而钙卫蛋白仍有不少缺点：其浓度受粪便在肠道的留存时间、患者年龄、测试方法等影响；在结直肠癌、肠道感染、息肉患者中也升高，对内镜下活动评估的特异性较差；影响诊断阈值的因素较多，较难得到精确的诊断阈值[11,12,13]。因此，寻找能稳定反映CD患者内镜下活动程度的生物标志物具有很大的临床价值。
TGM2是一种分泌型的多功能酶，研究证实其在慢性炎症反应及肿瘤炎症反应通路的持续激活中发挥重要作用[14,15]。已发现在环孢素A诱导的牙龈慢性炎症反应患者的血浆中、IgA肾病和过敏性紫癜型肾炎活动期患者的尿液中，TGM2浓度上升[5,16]。本研究显示疾病临床活动期CD患者血浆TGM2浓度明显高于疾病临床缓解组及健康对照组。更重要的是，内镜下活动的CD患者TGM2浓度显著高于内镜下缓解的患者，且敏感性及特异性较好，其诊断价值高于临床常用指标CRP和ESR，提示其可作为生物标志物反映CD内镜下活动情况。
此外，本研究尚存在一定局限性。本研究样本量较小，尚不能明确TGM2对症状缓解而内镜下活动的CD患者的诊断价值；缺少其他非特异性肠道炎症反应患者作为对照，不能充分说明其监测CD内镜下活动的特异性；本研究为单中心研究，可能存在一定的偏倚。因此，仍需大样本、多中心的前瞻性研究明确TGM2在CD患者内镜下活动的监测价值，同时进一步明确TGM2在CD发病中的具体机制。
利益冲突 所有作者均声明无利益冲突
