本文对肠道菌群研究中的实验设计、样本采集和处理、信息分析方法的基本原理与面临的问题及解决方案进行总结和探讨；强调标准化的实验流程、信息分析及质控方法，构建参考基因组及基线数据库的重要性；并展望了绝对定量、无菌动物、体外模拟等关键技术的应用前景，这些技术将为肠道菌群基础研究在精准医学、精准营养、精准干预中的应用打下坚实的基础。
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肠道菌群与宿主的共生关系是我们生命的基本组织形式。近年来，高通量测序技术及分析方法已广泛应用于肠道菌群研究，为人类了解自身健康与疾病打开了一扇窗。肠道菌群相关研究如火如荼，但研究质量参差不齐，研究方法标准不统一，研究结果差别巨大。因此，需要在研究方案设计、实验技术、信息分析方法等方面进行前瞻性探索并形成规范化的研究方法。本文对肠道菌群研究存在的问题及解决方案进行总结，旨在给研究者提供参考。
现代观点已经将人体看作是我们宿主自身与体内外聚集的微生物所构成的超级共生体，而微生物的基因组，被认为是存在于我们体细胞之外的第二基因组。肠道菌群参与食物成分的分解与转化，产生一系列调节性物质，参与宿主能量代谢、免疫调节和神经内分泌等多种生理活动。心脑血管疾病、代谢异常、心理疾病以及癌症等，都能从肠道微生态的失衡中找到原因，所以肠道菌群相关研究在各个领域均受到重视，并将在未来疾病预防干预与慢性病管理中发挥巨大作用。
肠道菌群测序方法包括标记基因（扩增子）测序、宏基因组以及宏转录组测序等，各有优劣。应当结合科学问题与科学假设、样品类型和分析目的综合考虑[1]。
标记基因测序采用特定引物来扩增基因组的特定区域序列，从而确定样品中微生物系统发育的关系，是一种高效、低成本获取低分辨率的微生物群落结构的方法。细菌与古细菌的鉴定一般用16S rRNA基因，真菌鉴定则用转录间隔区（ITS）。但可变区选择、扩增子片段大小及PCR循环次数的不同会产生引物偏好性，影响测序准确性[2]。
宏基因组学通常采用非靶向"鸟枪法"测序策略，与标记基因测序比较，宏基因组能获得更高的分类分辨率以及更详细的基因组功能信息。当然，在样本制备、测序和分析上的成本就会更高。
宏转录组则是使用RNA测序分析微生物组的转录过程，提供菌群内有关基因表达和功能活性等信息。宏转录组能区分微生物活细胞和死细胞，但对于转录活性较高的生物体有一定的偏向性[3]。宏转录组对技术与成本要求更高，需要去除宿主RNA污染，样本的储存与前处理需要更小心。
快速发展的DNA测序技术使得多领域微生物组的研究数量激增，与此同时，微生物组前沿实验技术也不断被开发。实验方法、环境因素和信息分析都会影响最终结果。来自12个国家的8个团队制定了国际人类微生物标准（IHMS），包括标记基因与宏基因组研究所涉及的样本收集、DNA提取、测序以及数据分析标准[4]。美国启动微生物组质量控制计划（MBQC），制定了样品采集、实验技术、分析方法综合标准，方便信息采集标准化。基因组标准联盟则提出了标记基因序列和宏基因组序列的最小信息标准（minimum information standards，MIxS）。
横断面研究常用于不同人群（如健康与疾病）的肠道菌群差异比较，然而容易受到生活方式、饮食、医疗以及生理等潜在因素的影响。纵向研究适用于时序样本的收集，有助于控制混杂因素，评估群体的稳定性与动态变化。
肠道菌群研究样本量的纳入需要综合考虑统计学、生物学意义以及实际操作情况。肠道菌群研究样品复杂度越高，理论上需要越多重复样本来消除背景误差。如果有3个组，要使加权UniFrac（weighted UniFrac）距离达到足够的统计效能，一般每个组需至少纳入20个样本[5]。
DNA提取方法可以直接影响下游基因测序数据分析的结果。所有提取过程必须使用相同的试剂盒；低生物量的样本做宏基因组时需要注意试剂保存、配置和提取过程中的污染问题；试剂最好过滤除菌，并且设置空白对照[9]。Costea等[10]针对同一份粪便样本采用了21种具有代表性的DNA提取方法，量化菌群组成差异，经过比较，其中基于QIAamp Stool Mini kit的方案Q整体表现最好，建议将其作为标准化的提取方法。
高通量测序常用的质量控制方法包括Qubit检测、毛细管电泳、qPCR以及Nanodrop等。毛细管电泳适合文库长度检测。Qubit与qPCR适合文库浓度检测，qPCR检测精度高，但Qubit检测更简便、灵敏度高、成本低，且qPCR无法检测没有添加接头的DNA。Nanodrop则更适合检测样本污染情况。
文库构建是高通量测序的前提。文库的质量过低，会导致成簇或多重模板太多；文库质量过高，导致数据读取量少，基因组覆盖率低。建库成败极大依赖于所提供DNA的量及降解情况，质量过低会导致扩增效率、文库得率和多样性降低。
美国Illumina公司是二代测序仪生产企业，自2006年进军基因测序市场以来，陆续发布了MiSeq、HiSeq、X10、NovaSeq等一系列测序仪器。X10、NovaSeq系列通量高，产量大，能够快速、经济地进行大规模平行测序。MiSeq系列特点是简约快速，且可以进行双末端150 bp测序，广泛应用于16S rRNA扩增子测序。国产品牌则主要是华大基因的BGISEQ-500、MGISEQ-2000等平台。2015年，华大发布了首款国产测序系统——BGISEQ-500，该系统采用了优化的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，可开展全基因组测序、宏基因组、转录组测序等，对健康人群肠道样本的深度宏基因组测序数据已通过一系列的性能评估，展示了BGISEQ-500宏基因组测序应用性能的优异性、准确性、稳定性及跨平台一致性[11]。
常规数据质控包括去除低质量、含N碱基、接头的读长（reads）等。宏基因组质控一般还需要去除宿主污染，通过与宿主参考基因组比对，剔除宿主DNA信息。常用到的比对软件包括SoapAligner/Bowtie（1和2）和BWA等。用于短序列比对的SoapAligner和Bowtie在速度和资源上都更占优。前者速度上比较有优势的短序列比对工具，而且占用内存非常小。
宏基因组测序可以获得物种、功能组成和进化信息。信息分析策略一般有两种，一种是基于参考数据库比对的，如使用k-mers分类DNA片段的物种，或基于参考基因集，如华大的肠道菌群参考基因集（IGC），或者是采用去冗余的高特异性基因作为物种分类标记，如MetaPhlAn2，而HUMAnN2进一步注释到基因和代谢通路。另一种则是将测序数据进行拼接，按照相似性进行分类或者分箱，以获得部分或完整的微生物参考基因集/基因组。由于组装方法、条件不同，而且受到测序量、覆盖度以及样本本身多样性的影响，组装通常比较困难，每个研究项目数据不同拼接得到的参考基因集/基因组必定有很大差异，造成不同项目之间的结果没法有效直接进行横向比较。
宏基因组研究中通常从基因、物种和功能层面获得微生物组丰度图谱。要让不同样品的基因丰度具有可比性，构建一个统一且完整的参考基因集/基因组非常重要。2010年，华大基因以MetaHIT计划为背景，整合1000多个个体的数据，建立了第一个包含1000万个基因的参考基因集。2016年，华大对基因集进行了升级，结合英国成年双胞胎肠道菌群研究有关的基因集，累计达到1140万个基因，并整合了相应的物种、功能数据库，用于菌群基因、物种和功能信息注释，寻找组间差异标记物，构建样本分类器等。参考基因集的构建和完善为开展大规模的宏基因组研究奠定了基础。MetaPhlAn2注释的方法则纳入了17 000多个参考基因组（包含13 500多个细菌和古菌、3500多个病毒和110种真核生物），累计高达100万以上的非冗余特异标记基因；可以快速、精确地进行物种分类、相对丰度计算评估，其分辨达到种水平，部分能对株水平进行鉴定和追踪[12]。
单个基因组组装通常会假设基因组各个区域测序覆盖度大致相同，这样就可以识别重复拷贝，区分测序错误并识别等位基因突变。而宏基因组组装很困难，因为每个基因组覆盖度取决于每个物种的丰度及其PCR扩增偏向性等因素。低丰度的物种可能由于测序深度不够而无法组装。目前最常用的宏基因组组装算法是图论（DeBrui jn）[13]，这种方法复杂，测序错误（非基因组序列）及重复序列可能导致组装错误，且由于NGS测序得到的序列较短，组装效果不佳。针对组装得到的重叠群（Contig），可以通过分箱（binning）技术将丰度较为一致的序列聚在一起，得到可能来自同一个菌株的基因组序列。再根据组装结果进行株水平的基因和功能注释。另外，还可用于宏基因组关联分析，可将特定功能产物与物种、基因进行关联研究（MWAS）[14]。
宏基因组常规分析流程见图1。
参考基因集无法获得基因之间的关联关系，即不清楚是否来自同一个基因组。每个物种得到的基因数量也不尽相同，不同物种之间存在相似基因和水平转移，同时，很多基因不能唯一地注释到相应的物种，因此，基于基因集的物种定量存在比较大的问题。另外，由于缺乏高质量的参考基因组，超过50%的测序数据无法有效比对到细菌参考基因组上，这已成为肠道菌群分析的一大障碍[13]。肠道微生物基因组在美国国家生物技术信息中心数据库（NCBI）中不到4%，而目前关注的焦点大都是临床相关致病菌。世界上第1个肠道菌群参考基因组是2010年人类微生物组计划（HMP）建立的178个参考微生物组，截止到2017年HMP计划分离超过2000株菌，其中437个属于肠道微生物，但肠道微生物参考基因组远未饱和[15]。
近期华大团队发表了全球最大的人体肠道细菌基因组研究成果。该研究利用培养组学方法，从健康人粪便样本中获得1520个单菌基因组草图，为微生物组研究提供了大量全新的、高质量的参考基因组，对于疾病与肠道菌群的相互作用机制的深入研究开辟了新方向[16]。同期，很多国际团队在参考基因集和参考基因组的构建方面做了大量的卓越的工作。Almeida等[17]从11 850个人类肠道菌群基因组中鉴别出了1925种潜在肠道细菌，极大地丰富了已知肠道菌群种类和功能，尤其补充了非洲和拉美地区人群的肠道菌群信息，对于详细阐释肠道菌群种类和功能有参考价值。Pasolli等[18]对来自32个国家不同地区、生活方式、年龄段和身体部位（粪便、口腔、皮肤和阴道）的9428个人体宏基因组进行大规模组装，发现了大量的未知微生物物种和基因组，使人类微生物组的参考基因组规模翻了1倍，大大扩展了人们对人体微生物组多样性的认知。然而，目前这些研究成果尚未进行有效整合、构建一个相对通用、有效的肠道菌群参考基因组，因此还需要有更多的资源投入到通用的参考基因组的构建工作中，以便更好地推动肠道菌群研究的标准化，使得不同项目数据间的横向比较成为可能。
人种、地区、生活方式与风俗习惯等对个体菌群差异贡献度高达70%以上[19]，种族和地域等因素不容忽视[20]，只有针对特定人群的肠道菌群研究才能为精准营养、精准医学提供指导。因此，美国以及欧洲等西方发达国家把构建肠道菌群基因组视为"人类基因组计划完成后最重要的基因组计划"。中国地广人多，群体构成和饮食习惯多元化，肠道菌群差异程度也必然很高。因此，建立中国人自己的肠道菌群基线数据库具有重要的战略价值。2018年周宏伟团队开展的广东省肠道菌群计划（GGMP）通过大规模收集基线人群样本并进行测序分析，发现菌群表现出明显的地区关联性，区域因素影响程度显著大于年龄、疾病、生活方式等其他因素，且传统疾病特征菌及疾病相关预测模型均受到区域化限制[21]。这些发现对于肠道菌群与疾病的研究尤其是临床应用具有极大参考价值，也更进一步说明了建立基线数据库的重要性。
当前所有基于高通量测序的物种和代谢通路定量都是相对丰度法，这种相对比例的定量方法忽略了菌群整体的绝对数量，无法准确描述微生物之间、微生物与宿主之间的相互作用关系，不能有效反映物种丰度与代谢潜力变化的程度和方向性问题[22]。假设存在某种抗生素，对所有的肠道菌群的杀伤作用相同，使用相对定量的方法可能得出各种菌的丰度在干预前后没有变化的结论，而实际情况是每种菌的丰度都等比例降低。因此，要准确衡量菌群组成和物种之间以及与宿主的相互作用，反映菌群在病理学、生理学、生态学中的潜在影响，菌群绝对丰度的定量分析技术必不可少。
Vandeputte等[23]将扩增子测序和微生物流式细胞技术结合起来，构建出粪便菌群绝对定量的工作流程，发现健康个体菌群定量存在10倍的差异，避免了菌群相互作用中的组成性效应，并表明拟杆菌与普雷沃菌之间的平衡是相对定量造成的一种假象。另一种绝对定量方式则是通过加入人工合成的外源DNA作为内参，用于分析复杂环境样品中细菌绝对丰度[24]。因此，菌群的研究必须实现从相对定量到绝对定量的转变，以便获得能够更加反映真实情况的数据。
近些年兴起的培养组学使可培养的人体细菌增加上百种，是构建高质量菌群参考基因组的前提。培养组学质谱（MALDI-TOF-MS）和16S rRNA测序等技术快速鉴定细菌分类，为研究宿主-细菌关系提供了新视角[25]。
工作量大、重复培养高丰度物种、检测样本量有限仍然是培养组学的主要缺点。最近Kleyer等[26]利用高通量测序结合培养组学开发了一种利用微流控技术分离和鉴定新细菌的新技术，有助于构建参考基因组，充分挖掘宏基因组分析的潜能[27]。培养组学还可以提供用于体外实验的细菌菌株，利用动物模型探究目标菌株在疾病发生发展中的作用，促进微生物菌株的功能研究，为后续的开发和利用奠定必不可少的基础。基于微流控技术微生物分离培养技术见图2[28]。
一般使用小鼠模型研究宿主和微生物之间特定的相互作用。动物实验要防止同笼效应，也要避免1只小鼠的单笼胁迫，同窝小鼠应随机均匀分配，避免亲代效应[29]。菌群失衡与某些疾病的发生并不是简单的相关关系，无菌小鼠模型非常适合菌群的生理机制与功能验证研究。无菌小鼠主要基于胚胎屏障方式进行培育，其体内既无抗原也无特异性抗体，很适合免疫学、营养学、毒理学、心血管病等相关菌群研究。无菌小鼠微生物控制程度等级最高，培育和维护相当困难[30]。无菌小鼠在无菌环境中能够正常生存，其在生理上、发育上、免疫上与正常小鼠的区别仍然缺乏系统性的研究，因此，有必要利用系统生物学思维和技术，从多个维度系统性地比较无菌小鼠与正常小鼠的差异，为无菌小鼠的广泛应用提供基础数据。
体外肠道发酵可简单模拟菌群与宿主相互作用，具有费用低、重复性好、无需伦理批准、省时省力等优点。通常是将处理过的粪便菌液接种于营养培养基中，模拟生理条件（培养基、温度、pH值、厌氧菌、滞留时间等）下不同结肠区域生化反应、酶的消化活性、黏液的产生，并随时间变化进行动态采样，可用于益生菌、益生元、药物代谢以及临床干预研究[31]。然而，体外模拟与真实体内情况还是有较大差别，考虑到其优势和局限性，将体外模拟、动物模型与人体研究相结合，设计多尺度研究策略，有助于深入了解肠道微生物群、饮食和宿主之间的复杂关系，并进一步阐明肠道微生物群对健康和疾病的作用[32]。
肠道菌群在药物疗效、药物递送以及增效减毒方面有重要作用。药物的糖醛酸化是药物通过胆汁或尿液解毒并清除的重要机制，肝脏中尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸的形成对调节这一机制至关重要[33]。抗癌药物伊利替康能够在人体肝脏内通过葡糖醛酸化的方式失活，其衍生物通过肝肠循环进入肠道，被菌群编码的β葡萄糖醛酸酶重新修饰而激活，引起腹泻等不良反应[34]。
肠道菌群能利用食物成分进行有效代谢，主要营养来源是饮食中的复合碳水化合物。菌群可通过糖酵解、磷酸戊糖途径氧化分解等方式代谢糖类。碳水化合物在小肠被分解成简单的糖，在结肠被菌群进一步发酵分解成短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸等）而被机体吸收利用[35]。大多数菌群还能利用肠道内含氮资源，当肠道内碳水化合物耗尽后，菌群能利用蛋白质作为能源，经过脱氨、脱羧途径代谢，产生氨、酚类、吲哚类、胺类、硫化氢等物质，对机体产生重要影响。高脂饮食会导致肠内细菌总数、多样性减少，双歧杆菌属降低，而拟杆菌、梭菌目相对增加，胆汁酸代谢异常，影响肠道的屏障功能，革兰氏阴性菌的增加还会导致脂多糖（LPS）增多，影响宿主免疫与脂代谢。
Pharmacomicrobiomic项目旨在探索人体共生菌与药物的相互作用并建立数据库，有助于研究人员根据微生物物种组成预测、检测药物试验效果[36]。例如，肠道微生物群能将黄芩苷水解成相应的苷元黄芩苷，该苷元易于吸收，吸收后可重新结合。地高辛则能被肠道内Eggerthella lenta代谢，降低其药效，同时口服地高辛与四环素或红霉素，则会导致地高辛中毒[37]。VMH数据库（http：//vmh.life）整合了人类代谢、肠道菌群、疾病、营养等资源，建立可信的代谢模型，实现数据检索、探索、通路图可视化和饮食方案设计4大功能[38]。
构建食物、药物与肠道菌群关联数据库将有助于阐明复杂疾病的作用机制，需要从系统生物学角度整合多组学数据，建立肠道菌群与营养、药物以及疾病相互作用的计算模型，并以数据为驱动，提高饮食-菌群-健康轴的数据利用率，为食物、药物与人类健康与疾病的关联提供全新的视角，为潜在的临床干预应用提供决策支持。
随着科学技术的发展，菌群一定会成为药物开发和疾病干预的靶点，如何定向调节肠道菌群就成为一个重要课题。通过建立食物与菌群、药物与菌种（包括中药）的关联数据库，有可能通过机器学习等算法，针对菌群的初始和目标状态设计出一套基于饮食和药物的干预方案，从而实现更好的健康管理和疾病治疗。
本文总结了肠道菌群研究涉及到的基本问题，包含了实验设计、样品收集、测序技术、信息分析到数据挖掘等基本环节；强调了标准化方法学开发、基础数据库构建的必要性。国际人体微生物组标准（IHMS）及微生物组质量控制计划（MBQC）已在这方面进行尝试。生物信息分析流程和对照的选择也逐步走向标准化，绝对定量的引入非常关键，可以使真实样本在系统水平进行量化分析，也促进不同项目数据之间的互相比较，推进信息和资源的共享。总之，方法的标准化和规范化，是促进菌群研究和发展的重要保障。同时，菌群只是影响人类疾病和健康的一种因素，在思考和设计科研项目时，要充分采用系统生物学的思路和方法，从多个维度来理解生命过程，这样才有助于深入理解菌群与健康、疾病的深层次机制。利用动物模型、体外试验等方法在系统层面可以开展干预研究，为微生物领域从基础研究走向临床提供了广泛应用前景。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
