探讨高盐高脂饮食以及粪菌移植对肠屏障功能以及肠道菌群的影响。
18只小鼠随机分为正常饮食（ND）组、高盐高脂饮食（HSFD）组和高盐高脂饮食并接受ND组小鼠粪菌移植（ND-FMT-HSFD）组。ND组用正常饮食饲喂，其余两组用高盐高脂饮食饲喂，连续饲喂6周，在第3周时取正常饮食组小鼠大便，分离肠菌，灌胃给ND-FMT-HSFD组小鼠，每2天粪菌移植1次，连续3周。饲喂处理结束后，分析肠屏障功能及肠道菌群。
高盐高脂饮食小鼠肠屏障通透性增加，肠道菌群丰度降低，拟杆菌门，放线菌门等及其分类下级的丰度显著增加；厚壁菌门，疣微菌门和变形杆菌门等及其分类下级的丰度显著降低。将正常饮食小鼠的粪菌通过灌胃移植到高盐高脂饮食小鼠，显著改变了受体的菌群，但没有改善肠屏障通透性。
高盐高脂饮食损害肠道健康，粪菌移植不能缓解其造成的损伤。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
肠道菌群紊乱与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）密切相关[1,2]。肠道菌群受遗传和多种环境因素的影响，其中饮食和抗生素对其影响最大[3,4]。高盐高脂是西方饮食的最主要特征[5]。高盐饮食（high salt diet，HSD）与高血压等心血管疾病的发生相关[6]。HSD干扰肠道菌群，降低乳酸菌含量[7]，引起肠道抗炎的调节性T细胞和促炎的辅助性T细胞17的比例（Treg/Th17）失调[8]，通过肠脑免疫轴降低小鼠的认知功能[9]。高脂饮食（high fat diet，HFD）与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生相关[10,11]，同时影响肠道菌群[12,13]。既往关于单纯高盐饮食和高脂饮食的研究较多，但现代人们的饮食往往高盐伴随高脂，而合并两种饮食的研究较少，且与IBD的关系尚不清楚。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是治疗肠道菌群紊乱的方法[14,15]。本研究探讨高盐合并高脂饮食（high salt and fat diet，HSFD）、正常饮食（normal diet，ND）小鼠的粪菌移植到HSFD小鼠后对肠屏障功能及肠道菌群的影响，以期为通过饮食和肠道菌群的调整降低IBD风险提供理论依据。
采用SPF级雄性C57B/L6小鼠18只，体质量（20 ± 2）g，鼠龄4~6周，购自广东省医学实验动物中心（动物合格证号：44007200053606）。动物实验均在广州医科大学实验动物中心SPF实验环境中进行，温度20℃~25℃，湿度50%~60%，光照时间为每天的7∶00~19∶00。本实验获得广州医科大学实验动物伦理委员会的批准（批准号：2018-083）。
把18只小鼠随机分为正常饮食（ND）组、高盐高脂饮食（HSFD）组和高盐高脂饮食并接受ND组小鼠粪菌移植（ND-FMT-HSFD）组。ND组用正常饲料饲喂，其余两组用高盐高脂饲料饲喂。高盐高脂饲料是在正常饲料的基础上，添加8%氯化钠（NaCl）和20%猪油，即72 g正常饲料，加8 g NaCl和20 g猪油。小鼠饲料从广东省医学实验动物中心定制。3组小鼠连续饲喂6周。在饲喂第3周时，经肛门取ND组小鼠大便，分离粪菌，给ND-FMT-HSFD组小鼠灌胃行粪菌移植，每2天1次，连续3周；ND组和HSFD组小鼠则根据体质量按10 μl/g行生理盐水灌胃。实验过程中每周经肛门取大便样品。经6周饲喂结束后，在取血前3~6 h，用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran，剂量为100 mg/kg）灌胃。取血前再用5%水合氯醛按照10 μl/g体质量麻醉，然后从腹主动脉取血，取盲肠大便，分离大小肠并测量其长度。
小鼠经肛门取大便，加5倍质量的生理盐水，震荡成均匀悬液，在25℃ 5000 ×g离心5 min，弃上清，称重，生理盐水调节菌液浓度为0.3 g/mL，小鼠用灌胃针经口灌胃行粪菌移植，剂量为10 μl/g体质量。每2天粪菌移植1次，连续3周。
实验过程中，观察小鼠饮食饮水量、体质量及活动状态。
小鼠腹主动脉取血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，离心取血浆，用酶标仪进行荧光定量分析，激发光488 nm测定吸光度A520值，标准曲线法进行定量检测FITC-dextran浓度。
测量小鼠小肠和结直肠长度。10%中性甲醛固定结直肠中段，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察各组结肠组织结构及病理损伤情况。
按照试剂盒说明提取结直肠上段总RNA，然后进行反转录和扩增。qPCR反应条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，循环40次，绘制溶解曲线。β-actin上游引物CTGAGAGGGAAATCGTGCGT，下游引物CCACAGGATTCCATACCCAAGA；IL-1β上游引物CCTGTGTAATGAAAGACGGC，下游引物：GCTTGTGAGGTGCTGATGTA；Claudin2上游引物：GGCTGTTAGGCACATCCAT，下游引物：TGGCACC AACATAGGAACTC；Occludin上游引物：ATTCACT TTGCCATTGGAGG，下游引物：ATTTATGATGAAC AGCCCCC；ZO-1上游引物：TGCAATTCCAAATCC AAACC，下游引物：AGAGACAAGATGTCCGCCAG。采用β-actin作为内参。
委托广州艾基生物技术有限公司进行16S rRNA测序及分析。经肛和盲肠取得的粪便，采用DNA抽提试剂盒（Magen HiPure Soil DNA Mini Kit，广州美基生物科技有限公司）抽提微生物总DNA；采用V3V4区域特定引物扩增总DNA里16s rRNA V3V4可变区；DNA凝胶电泳检测完整性及浓度，并切胶回收纯化。进行针对Illumina测序仪的文库制备，连接测序接头，完成文库制备。经由Qubit和Agilent2100质检通过后，上机测序（测序仪：Hiseq2500 PE250，Illumina公司，美国）。对测序结果按照生物信息分析流程进行主成分分析、总菌群丰度的OUT分析和门纲目科属种水平上的菌群组成分析。经数据库比对分析，所有测得的序列均可比对到注释明确的门纲目水平。
采用SPSS 20.0统计软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析；各组两两比较用LSD-t检验；检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
在实验第6周饲喂结束后，与ND组小鼠相比，HSFD组小鼠体质量更低，但差异无统计学意义；与HSFD组小鼠比较，ND-FMT-HSFD组小鼠体质量更低（表1）。
3组小鼠实验结束后各项指标结果
3组小鼠实验结束后各项指标结果
| 组别 | 鼠数 | 体质量（g） | 小肠长度（cm） | 结直肠长度（cm） | 血浆FITC-dextran浓度（μg/ml） |
|---|---|---|---|---|---|
| ND组 | 6 | 24.5 ± 0.6 | 39.2 ± 1.4 | 8.2 ± 0.5 | 1.2 ± 0.0 |
| HFSD组 | 6 | 23.8 ± 0.3 | 36.0 ± 1.1a | 6.3 ± 0.8a | 1.8 ± 0.2a |
| ND-FMT-HFSD组 | 6 | 23.6 ± 0.3bc | 36.2 ± 0.9c | 6.7 ± 0.6c | 1.7 ± 0.1c |
注：FITC-dextran为异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖；与ND组比较，aP<0.05；与HFSD组比较，bP<0.05；与ND组比较，cP<0.05
与ND组小鼠相比，HSFD组小鼠的小肠和结直肠长度更短，差异有统计学意义；HSFD组和ND-FMT-HSFD组的小肠和结直肠长度差异无统计学意义（表1）。
与ND组小鼠相比，HSFD组和ND-FMT-HSFD组小鼠血浆的FITC-dextran浓度更高，表明高盐高脂饮食增加肠黏膜通透性，FMT没有逆转其造成的肠黏膜通透性增加（表1）。
HSFD组小鼠的肠表皮结构损伤以及炎症反应增加，正常饮食小鼠的粪菌移植并没有缓解作用（图1）。
与ND组比较，HSFD组小鼠结直肠组织的炎性因子基因IL-1β表达增高，肠屏障紧密连接蛋白ZO-1表达降低，差异有统计学意义；而Claudin2、Occludin表达也降低，但差异无统计学意义，见表2。
ND组和HFSD组小鼠结直肠组织中IL-1β、Claudin2、Occludin和ZO-1的β-actin的相对表达
ND组和HFSD组小鼠结直肠组织中IL-1β、Claudin2、Occludin和ZO-1的β-actin的相对表达
| 组别 | 鼠数 | IL-1β | Claudin2 | Occludin | ZO-1 |
|---|---|---|---|---|---|
| ND组 | 6 | 0.1 ± 0.0 | 0.7 ± 0.2 | 3.3 ± 2.2 | 1.1 ± 0.4 |
| HFSD组 | 6 | 0.1 ± 0.0 | 0.5 ± 0.4 | 2.3 ± 1.7 | 0.6 ± 0.5 |
| t值 | 2.62 | 0.93 | 0.64 | 2.61 | |
| P值 | <0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 |
注：ND组为正常饮食组；HFSD组为高盐高脂饮食组
肛门与盲肠粪便菌群有差异，肛门粪便菌群丰度更高（图2）。肛门和盲肠的主要菌群如厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）无差异，但盲肠粪便中的变形杆菌门（Proteobacteria）更高，放线杆菌门（Actinobacteria）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）和TM7菌门更低（图3）。在纲和目水平上，结果显示同样的趋势，拟杆菌纲、梭状芽胞杆菌纲、拟杆菌目和梭菌目两者无差异，疣微菌纲和疣微菌目在盲肠粪便中更多，ε-变形菌纲、弯曲杆菌目在肛门粪便中更多（图4和图5）。
与NC组小鼠相比，HSFD组和ND-FMT-HSFD组小鼠总菌群丰度降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度增加，厚壁菌门（Firmicutes），疣微菌门（Verrucomicrobia）、变形杆菌门（Proteobacteria）丰度降低。与HSFD组小鼠相比，ND-FMT-HSFD组小鼠拟杆菌门增加以及总菌群丰度降低，厚壁菌门、疣微菌门、放线杆菌门和TM7菌门丰度降低，变形杆菌门丰度没有明显变化（图3）。
与ND组小鼠相比，HSFD组小鼠拟杆菌纲（Bacteroidia）、芽孢菌纲（Bacilli）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）的丰度增加，梭状芽孢杆菌纲（Clostridia）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）的丰度降低；而疣微菌纲（Verrucomicrobiae）、Tm7-3菌纲的丰度无明显差异。与HSFD组小鼠相比，ND-FMT-HSFD组小鼠拟杆菌纲丰度的增加，梭状芽孢杆菌纲丰度的降低，疣微菌纲、δ-变形菌纲数目差异较小（图4）。
与ND组小鼠相比，HSFD组小鼠拟杆菌目（Bacteroidales）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、芽孢杆菌目（Bacillales）、乳杆菌目（Lactobacillales）的丰度显著增加，梭菌目（Clostridiales）、弯曲杆菌目（Campylobacterales）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、YS2菌目和图利茨菌目（Turicibacterales）的丰度显著降低；而疣微菌目（Verrucomicrobiales）、CW040菌目、红蝽菌目（Coriobacteriales）的丰度无明显差异。与HSFD组小鼠相比，ND-FMT-HSFD组小鼠拟杆菌目和丹毒丝菌目丰度增加，梭菌目、乳杆菌目和芽孢杆菌目丰度的降低，疣微菌目、弯曲杆菌目、伯克氏菌目、脱硫弧菌目丰度无明显差异，CW040菌目、红蝽菌目、双歧杆菌目和图利茨菌目消失，原本没有的肠杆菌目（Enterobacteriales）出现（图5）。
单纯高盐饮食引起体质量下降[9]，单纯高脂饮食增加体质量，本研究中长期高盐高脂饮食小鼠体质量下降，表明本研究所使用的盐量和脂肪量使得高盐的减重作用大于高脂的增重作用。高盐饮食可直接作用于肠道，引起Treg/Th17失调，增加实验小鼠对实验性结肠炎的敏感性[8]。西方饮食引起小鼠肠道黏液层缺陷，通透性增加，黏膜层生长速率降低[16]。本研究结果也表明，长期高盐高脂饮食使小肠和结直肠缩短，增加促炎基因的表达，增加肠屏障通透性，这可能与致病菌肠道易感性增加有关，IBD发生率增高可能与现代西方化的饮食有关。
动物实验常取盲肠粪便样本，但需要处死实验动物，并且每只动物只能取1次。经肛门取新鲜粪便标本可以多次进行。本研究结果表明肛门粪便与盲肠粪便的菌群有一定差异，前者菌群丰度较高，但两者间拟杆菌纲和梭状芽胞杆菌纲、拟杆菌目和梭菌目无差异。平行比较时，建议采用取样部位一致的样本。
肠道菌群主要受环境因素而不是遗传因素的影响[17]。饮食是塑造肠道菌群最重要的环境因素。小鼠进行2周4%高盐饮食，乳酸菌含量显著降低[7]。高脂饮食与对照饮食的实验小鼠，在肠道菌群的丰度、多样性和拟杆菌门与厚壁菌门的比例上存在差异，但是把多个研究进行Meta分析，结果显示没有差异，可能与研究条件不同有关[18]。但是，该Meta分析发现一些共性变化，即高脂饮食小鼠的多尔菌属、颤螺旋菌属和瘤胃球菌属等生成短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）的菌属增多，抗炎的苏黎士杆菌属减少，促炎的乳球菌属增加，而SCFA能给动物提供更多的能量，导致体质量增加[18]。产SCFA菌及SCFA的减少与心血管疾病风险增加呈正相关[19]。单纯高盐饮食是否通过降低产SCFA菌而增加心血管疾病风险，尚未检索到相关研究报道。
粪菌移植将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现疾病的治疗。FMT对复发艰难梭菌感染具有90%以上的缓解率，美国感染病学会（IDSA）联合美国医疗保健流行病学学会（SHEA）指南将FMT用于治疗艰难梭菌感染[20]。FMT对IBD、肝炎、抑郁症等都有应用潜力[21]。接受FMT后，受体的菌群会发生改变，但并不是变得和供体相似[22]。本研究发现FMT加剧高盐高脂饮食造成的主要菌群变化趋势，逆转了高盐高脂饮食造成的部分菌群的变化，说明FMT中外来菌群对原生菌群的干预是非常复杂的，菌群之间生态位竞争机制尚不清楚。
有研究认为在动物FMT实验中，正常的菌群不易被紊乱的菌群替换[23]。正常菌群的定义尚无定论。此外，尚不清楚菌群的稳定性跟其是否"紊乱"有无相关性。不同供体菌群定植力可能不同，不同受体菌群稳定性也可能存在差异，供体与受体菌群的兼容性是否和环境和遗传因素有关，这些问题尚待深入研究。
利益冲突 所有作者均声明无利益冲突
