Estradiol stimulates the growth and biofilm formation of clinical Staphylococcus epidermidis

Wang Xi; Zhou Yongchun; Huang Yunchao; Zou Tianning; Lü Zhiyong; Chen Ying; Liu Xin; Duan Wanshi

doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.38.010

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• 基础研究 •

雌二醇对临床表皮葡萄球菌生长和生物膜形成的作用

中华医学杂志, 2016,96(38) : 3083-3089. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.38.010

摘要

目的

探讨雌二醇对乳房假体表面表皮葡萄球菌生长、生物膜形成的影响。

方法

以乳房硅胶片为载体，选择表皮葡萄球菌标准株(ATCC)和临床株(SE)，在不同雌二醇浓度下培养4、6、12、24、48和72 h。根据吸光度(A)值绘制出生长曲线；用结晶紫染色法检测生物膜形成能力；用激光聚焦显微镜(CLSM)和扫描电子显微镜(SEM)观察生物膜结构。

结果

4株细菌在加入雌二醇后生长都较空白组提前1 h进入对数生长期(雌二醇组在第3小时进入，空白组在第4小时进入)。ATCC12228和SE40在高浓度雌二醇作用下仍无生物膜形成(A值均<0.12)。ATCC35984和SE101在雌二醇作用下，初始黏附能力明显加强，0 pmol/L组(0.081±0.015和0.082±0.011)，50 pmol/L组(0.087±0.013和0.088±0.010)，125 pmol/L组(0.175±0.052和0.091±0.012)，250 pmol/L组(0.153±0.036和0.090±0.006)，500 pmol/L组(0.157±0.050和0.082±0.032)；同时细菌生物膜厚度也随雌二醇浓度而增加，培养24 h时的A值分别为0 pmol/L组(1.609±0.171和0.247±0.017)，50 pmol/L组(1.391±0.087和0.256±0.015)，125 pmol/L组(2.051±0.070和0.268±0.064)，250 pmol/L组(1.973±0.073和0.265±0.019)，500 pmol/L组(1.904±0.060和0.245±0.019)，在雌二醇浓度为125 pmol/L时生物膜达到最厚。CLSM和SEM观察到高浓度的雌二醇能促使生物膜提前进入成熟阶段，125 pmol/L雌二醇组的生物膜较其他浓度组形成的生物膜更致密、更厚。

结论

雌二醇可促进表皮葡萄球菌的生长，同时还提高生物膜的形成能力。

引用本文: 王曦, 周永春, 黄云超, 等. 雌二醇对临床表皮葡萄球菌生长和生物膜形成的作用 [J] . 中华医学杂志, 2016, 96(38) : 3083-3089. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.38.010.

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表皮葡萄球菌虽是一种寄居在人类皮肤和黏膜的正常菌群，但当它随植入物一起进入到深层组织时，就会导致相关感染。其中其形成生物膜的能力被认为是其最重要的毒力特征之一^[1]。在乳腺整形外科中最常见的并发症就是假体植入术后的包膜挛缩，虽然其诱因包括异物反应、血肿、细菌定植、植入位置和假体表面纹理^[2,3]，但亚临床感染理论已得到论证，其中以表皮葡萄球菌为主^[4]。

葡萄球菌生物膜的形成能力因宿主体内微环境的改变或调节因子的紊乱而发生变化。其中体内性激素水平的升高就会导致细菌数量和毒力的增加，从而使宿主出现相关感染^[5,6,7]，因此我们设想作为长期硅凝胶假体的女性人群，是否她们的雌激素水平也会影响定植在乳腺假体表面的表皮葡萄球菌的特性，最终在假体包膜挛缩的发生过程中起不良作用。本研究希望通过体外实验，观察雌二醇对表皮葡萄球菌生长和生物膜形成的影响情况，为寻找导致乳房假体植入术发生包膜挛缩的原因提供新方向和实验基础。

材料与方法

一、材料

1．菌株：

表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(aap^＋、ica^＋、生物膜表型阳性)，购自美国典型菌种保藏中心。标准株ATCC12228(aap^－、ica^－、生物膜表型阴性)，购自中国科学院微生物研究所。表皮葡萄球菌临床分离株SE101(icaA^＋、icaD^＋、aap^＋，生物膜表型阳性)和SE40(icaA^－、icaD^－、aap^－，生物膜表型阴性)，两者均来自临床中假体及扩张器包膜细菌培养，并已在前期实验中通过PCR检测，半定量实验、共聚焦电子显微镜及扫描电镜证实生物膜形成能力。

2．仪器与试剂：

乳腺外科使用硅胶扩张器(10 ml、圆柱形C10；硅胶扩张器与乳房假体表面的硅胶材料一致，均购自广州市万和整形材料有限公司。加工成面积5 mm²方形硅胶片，环氧乙烷熏蒸灭菌备用)；活/死细菌荧光染色剂(Live/Dead Baclight Bacterial Viability Kit，购自美国Life公司，批号L7007)；雌二醇(estradiol，E₂，购自美国Sigma公司，批号P0478)。

二、方法

1．细菌悬液制备：

常规复苏冻存的ATCC35984、ATCC12228、SE101和SE40，接种在LB琼脂平板上，在37 ℃下培养24 h。挑取单菌落转移到TSB培养基中，37 ℃、250 r/min，根据细菌生长曲线，培养16～18 h后细菌至对数生长期。用紫外分光光度计调整菌液浓度为1×10⁷CFU/ml备用。

2．雌二醇(E₂)悬液的制备：

根据E₂分子量272.39计算，在10 ml无水乙醇中溶解0.027 2 g的E₂，制成浓度为10^－2mol的原液，避光置于－20 ℃备用。实验前取0.001 ml原液，加入20 ml无水乙醇和80 ml蒸馏水制备成100 nmol/L浓度的E₂悬液，以此为基础，加入TSB培养基调整E₂浓度分别为5 nmol/L、2.75 nmol/L、1.375 nmol/L和500 pmol/L备用。

3．实验分组：

E₂浓度分别为50、125、250、500 pmol/L的4个组定为实验组，未添加E₂的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基为对照组。

4．制备硅胶材料表面细菌生物膜体外模型：

在无菌24孔平底板中每孔加入菌液400 μl、E₂ 40 μl(空白组加40 μl TSB)、灭菌的硅胶材料1片，每组分别在4、6、12、24、48 h和72 h板中均接种6个复孔，放入37 ℃恒温箱培养。

5．细菌生长曲线的制作：

将ATCC35984、ATCC12228、SE101和SE40菌液各稀释到78 ml TSB培养基中，调至A₆₀₀＝0.02；每种细菌菌液分装到26个离心管中，每管3 ml；每种细菌分为两组，一组为空白组，另一组为125 pmol/L E₂组(前期实验观察到此浓度时形成生物膜最厚)。将104个离心管置于37 ℃、220 r/min摇床中振荡培养，每1小时取出各菌种、各浓度菌液共8管分别测其A值，每管测3次，直到第12小时，后至24 h时再测1次。取每管3次数值的平均值，以时间为X轴，A值为Y轴。根据公式t＝0.301/(logA_(n＋1)－logA_(n))计算细菌倍增时间，其最小值为对数生长期倍增时间^[8]。

6．表皮葡萄球菌黏附能力的检测：

将ATCC35984和ATCC12228菌液按步骤4制备好，置于37 ℃恒温箱中培养1 h后取出各个复孔中的硅胶片，用4 ℃磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，风干后放入24孔板中，每孔加入200 μl三氯乙酸固定，1 h后取硅胶片再次用4 ℃ PBS清洗3次，风干后放入24孔板中，每孔加入1%结晶紫200 μl染色30 min，取出硅胶片用4 ℃ PBS漂洗直至无残余染料，室温晾干后再放入一块24孔板，加入二甲基亚砜脱色15 min后取每孔100 μl脱色液至96孔板，用微量酶标板测量仪测定490 nm的A值，以只加入TSB培养基作为空白对照。测得每孔的A值减去空白对照的A值为最终A值，实验重复3次。

7．结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力：

分别于培养4、6、12、24、48、72 h后从每组各取6片硅胶片，PBS清洗3次、风干后放入24孔板中，每孔加入1%结晶紫200 μl染色30 min，取出硅胶片PBS漂洗、风干后再放入一块24孔板，加入二甲基亚砜脱色15 min后取每孔100 μl脱色液至96孔板，用微量酶标板测量仪测定490 nm的A值，以只加入TSB培养基作为空白对照。测得每孔的A值减去空白对照的A值为最终A值，差值>0.12的菌株为生物膜形成阳性，实验重复3次。

8．激光共聚焦显微镜(CLSM)观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度：

分别于培养6、12、24 h后从5组不同E₂浓度中各取出硅胶片(前期实验观察6 h时就形成一定厚度的生物膜，到24 h时生物膜达到最厚)，生理盐水洗去浮游菌，放入新的24孔板后加入配置好的荧光染色剂，常温下避光染色20 min，再用生理盐水轻轻冲洗，用激光共聚焦显微镜观察及摄影。以氩离子激光为光源，每个标本随机选取5个视野为单位视野，观察细菌群落荧光图像；每个视野随机获取一个生物膜测量其厚度(取平均值)，逐层扫描，观察、摄片。

9．扫描电子显微镜(SEM)观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构：

分别在4、6、12、24、48、72 h时取出硅胶材料，PBS洗涤后用2%戊二酸固定，4 ℃保存送检。用乙醇梯度脱水、CO₂临界点干燥，真空镀金。将制好的标本置于扫描电子显微镜下观察。参考生物膜特征和结构，对生物膜成熟情况进行分级^[9]。Ⅰ级-浮游细胞，细胞黏着在生物材料上；Ⅱ级-形成小细胞群或小菌落；Ⅲ级-菌落之间通过胞外基质纤维相互联系，形成蜘蛛网外观的微菌落塔；Ⅳ级-形成蜂窝式的塔楼，中间存在通道和无定形细胞外物质。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。数据以±s表示，组内比较采用t检验；组间两两比较采用方差分析；两两比较采用SNK检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．E₂对不同菌株生长能力的影响：

在空白组中，ATCC35984、ATCC12228、SE101和SE40在第4小时进入对数生长期。但在E₂组中，四株菌株都在第3小时就进入对数生长期。24 h时4组菌株都进入衰亡期(图1A～D)。

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图1

表皮葡萄球菌在无雌二醇和含雌二醇中的生长曲线

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A．ATCC35984；B. ATCC12228；C. SE101；D. SE40

图1

表皮葡萄球菌在无雌二醇和含雌二醇中的生长曲线

2．E₂对表皮葡萄球菌黏附能力的影响：

ATCC35984和SE101初始黏附能力随E₂浓度的增加而得到加强，125、250和500 pmol/L组A值均高于0 pmol/L，比较差异有统计学意义(P<0.05)，且在125 pmol/L时的A值最大，均高于0 pmol/L，比较差异有统计学意义(P<0.05)，125、250和500 pmol/L组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。而E₂对ATCC12228和SE40黏附在生物材料表面的能力无促进作用，各浓度间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

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表1

四种菌株在不同E₂浓度下的黏附能力(结晶紫染色法)(±s)

表1

四种菌株在不同E₂浓度下的黏附能力(结晶紫染色法)(±s)

雌二醇浓度(pmoL/L)	ATCC35984	ATCC12228	SE101	SE40
0	0.081±0.015	0.079±0.005	0.082±0.011	0.071±0.014
50	0.087±0.013	0.084±0.009	0.088±0.010	0.065±0.007
125	0.175±0.052^ab	0.078±0.007	0.091±0.012^a	0.065±0.004
250	0.153±0.036^ab	0.077±0.006	0.090±0.006^a	0.075±0.034
500	0.157±0.050^ab	0.085±0.032	0.082±0.032^cd	0.064±0.023
F值	21.741	0.874	3.358	1.635
P值	<0.001	0.483	0.014	0.174

注：同一菌株，与0 pmol/L组比较，^aP<0.05；与50 pmol/L组比较，^bP<0.05；与125 pmol/L组比较，^cP<0.05；与250 pmol/L组比较，^dP<0.05

3． E₂对不同菌株形成生物膜能力的影响：

ATCC12228和SE40在不同浓度E₂中A值均<0.12，提示无生物膜形成。而ATCC35984和SE101表现出生物膜厚度与E₂浓度的正相关性，虽然ATCC35984在4 h和6 h时表现出0、50 pmol/L组生物膜厚度>125、250、500 pmol/L组，相互比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；但12～72 h时，随E₂浓度的增加，ATCC35984和SE101形成的生物膜厚度显著增加，125、250、500 pmol/L组生物膜厚度均显著>0、50 pmol/L组，相互比较差异有统计学意义(P<0.05)；且125 pmol/L组生物膜最厚。ATCC35984和SE101在4 h时初步形成生物膜，6 h生物膜就达到一定的厚度，随时间推移，生物膜厚度也不断增加，24 h时生物膜厚度达到最大值，48 h和72 h形成的生物膜较24 h有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)(表2，表3)。

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表2

不同E₂浓度下ATCC35984生物膜形成情况(结晶紫染色法)(±s)

表2

不同E₂浓度下ATCC35984生物膜形成情况(结晶紫染色法)(±s)

雌二醇浓度(pmoL/L)	4 h	6 h	12 h	24 h	48 h	72 h
0	0.218±0.033^bd	0.506±0.037^cd	0.849±0.148^bcd	1.609±0.171^bcd	1.382±0.199^cd	0.936±0.263^cd
50	0.198±0.038^a	0.508±0.046^cd	0.704±0.056^acd	1.391±0.087^bcd	1.293±0.110^cd	0.846±0.129^cd
125	0.207±0.026^d	0.440±0.049^ab	1.120±0.035^abd	2.051±0.070^abd	1.770±0.105^abd	1.808±0.565^abd
250	0.181±0.024^ac	0.416±0.067^ab	1.118±0.046^abc	1.973±0.073^abc	1.791±0.144^abc	1.493±0.083^abc
500	0.177±0.015^ac	0.466±0.071^ab	1.098±0.056^abc	1.904±0.060^abcd	1.657±0.102^abcd	1.594±0.104^abc
F值	6.545	9.652	103.715	136.615	49.820	38.019
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

注：同一时间点与0 pmol/L组比较，^aP<0.05；与50 pmol/L组比较，^bP<0.05；与125 pmol/L组比较，^cP<0.05；与250 pmol/L组比较，^dP<0.05

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表3

不同E₂浓度下SE101生物膜形成情况(结晶紫染色法)(±s)

表3

不同E₂浓度下SE101生物膜形成情况(结晶紫染色法)(±s)

雌二醇浓度(pmoL/L)	4 h	6 h	12 h	24 h	48 h	72 h
0	0.146±0.016	0.153±0.010	0.172±0.021	0.247±0.017	0.184±0.022	0.193±0.025
50	0.141±0.012^a	0.155±0.011^a	0.156±0.015	0.256±0.015	0.185±0.020^a	0.224±0.032
125	0.194±0.025	0.190±0.037	0.197±0.015	0.268±0.064	0.219±0.021	0.244±0.044^b
250	0.147±0.020^ab	0.170±0.013	0.193±0.008^c	0.265±0.019^b	0.200±0.023	0.264±0.067^c
500	0.173±0.024	0.162±0.010^abd	0.168±0.011^a	0.245±0.019^a	0.201±0.014^d	0.175±0.013^a
F值	23.88	10.88	24.103	1.768	8.927	14.361
P值	<0.001	<0.001	<0.001	0.143	<0.001	<0.001

注：同一时间点与0 pmol/L组比较，^aP<0.05；与50 pmol/L组比较，^bP<0.05；与125 pmol/L组比较，^cP<0.05；与250 pmol/L组比较，^dP<0.05

4．激光共聚焦显微镜(CLSM)观察硅胶材料表面生物膜厚度：

通过CLSM测量生物膜厚度，6 h时，125、250、500 pmol/L组生物膜厚度>0、50 pmol/L组，比较差异有统计学意义(P<0.05)；之后各组生物膜逐渐增厚，12、24 h时125、250、500 pmol/L组生物膜厚度均>0、50 pmol/L组，且125 pmol/L组生物膜厚度均明显大于其他浓度组，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表4)。

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表4

ATCC35984在各浓度组各时间点细菌生物膜厚度比较(μm，±s)

表4

ATCC35984在各浓度组各时间点细菌生物膜厚度比较(μm，±s)

雌二醇浓度(pmoL/L)	6 h	12 h	24 h
0	21.98±1.80	35.66±3.58	70.29±6.57
50	20.20±2.12	30.67±1.28^a	57.94±3.82^a
125	17.48±1.41^ab	69.56±2.79^ab	106.46±6.05^ab
250	15.42±1.81^abc	59.10±4.08^abc	95.62±2.81^abc
500	16.63±0.98^ab	46.41±1.45^abcd	82.76±3.16^abcd
F值	15.53	190.69	100.21
P值	<0.001	<0.001	<0.001

注：与0 pmol/L组比较，^aP<0.05，与50 pmol/L组比较，^bP<0.05，与125 pmol/L组比较，^cP<0.05，与250 pmol/L组比较，^dP<0.05

培养24 h后不同浓度E₂作用下生物膜的死活菌情况，发现5组形成的生物膜中均有大量死菌和活菌同时存在，细菌在E₂作用下形成的生物膜量明显较无雌激素组多，在125 pmol/L E₂作用下生物膜达到最厚，死活菌的比例也较其他组明显高(图2)。

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图2

孵育24 h各组激光共聚焦显微镜观察(死活菌的比例最高箭头示)(×200)

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A：0 pmol/L；B: 50 pmol/L ；C: 125 pmol/L；D: 250 pmol/L；E: 500 pmol/L；F: 250 pmol/L

图2

孵育24 h各组激光共聚焦显微镜观察(死活菌的比例最高箭头示)(×200)

5．扫描电镜(SEM)观察生物膜超微结构：

SEM观察结果，ATCC12228和SE40未见生物膜结构(图3)，ATCC35984和SE101在125 pmol/L E₂作用下，4 h时硅胶片上可见单个细菌分裂后形成的细菌团(图4A和图5A)；6 h可见大量细菌团覆盖在硅胶片表面，有些细菌团向外延伸(图4B和图5B)；12 h即见纤维组织形成，将细菌团相互连接形成塔状的结构(图4C和图5C)；24 h可见成熟的细菌生物膜结构，蜂窝式的结构中有大量通道和无定形细胞外物质填充(图4D和图5D)；48 h和72 h时随可见生物膜结构，但都呈分解状，周围有新的细菌正在形成细菌团(图4E、F和图5E、F)。

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图3

生物膜阴性株在E₂浓度为125 pmol/L中培养24 h时的扫描电镜图 ×10 000

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A: SE40; B: ATCC12228

图3

生物膜阴性株在E₂浓度为125 pmol/L中培养24 h时的扫描电镜图 ×10 000

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图4

SE101在E₂浓度为125 pmol/L中培养4(A)、6(B)、12(C)、24(D)、48(E)、72 h(F)后的生物膜扫描电镜图(箭头示细菌团相互连接)

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图4

SE101在E₂浓度为125 pmol/L中培养4(A)、6(B)、12(C)、24(D)、48(E)、72 h(F)后的生物膜扫描电镜图(箭头示细菌团相互连接)

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图5

ATCC35984在E₂浓度为125pmol/L中培养4(A)、6(B)、12(C)、24(D)、48(E)、72 h(F)后的生物膜扫描电镜图((箭头示细菌团)

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图5

ATCC35984在E₂浓度为125pmol/L中培养4(A)、6(B)、12(C)、24(D)、48(E)、72 h(F)后的生物膜扫描电镜图((箭头示细菌团)

24 h时比较不同E₂浓度下表皮葡萄球菌细菌生物膜的结构发现，5组硅胶片表面均可见复杂网络状的成熟细菌生物膜结构，覆盖整个生物材料表面，125 pmol/L E₂作用下形成的生物膜结构较其他浓度组范围最广泛、结构最致密、最丰富、层次最多(图6C和图7C)，250 pmol/L浓度下的生物膜结构与125 pmol/L的相似；而0、50、500 pmol/L组的生物膜相比较下层次较少，结构较简单(图6，图7)。

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图6

24 h时SE101在不同E₂浓度作用下形成生物膜的扫描电镜图 ×4 000

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A：0 pmol/L；B: 50 pmol/L ；C: 125 pmol/L；D: 250 pmol/L；E: 500 pmol/L

图6

24 h时SE101在不同E₂浓度作用下形成生物膜的扫描电镜图 ×4 000

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图7

24 h时ATCC35984在不同E₂浓度作用下形成生物膜的扫描电镜图×1 000

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A：0 pmol/L；B: 50 pmol/L ；C: 125 pmol/L；D: 250 pmol/L；E: 500 pmol/L

图7

24 h时ATCC35984在不同E₂浓度作用下形成生物膜的扫描电镜图×1 000

讨论

葡萄球菌因菌株、感染部位、黏附材料、细菌生长周期不同，其形成的生物膜在组成上也有很大差别^[10]。我们的研究发现，同为生物膜阳性表型的表皮葡萄球菌，ATCC35984和SE101在生长能力和生物膜形成能力上均有差异，它们虽然在同一时间进入对数生长期，但SE101进入平台期的时间和在平台期的持续时间都较ATCC35984落后。比较同一时间点也发现，SE101形成的生物膜厚度与ATCC35984的有显著差异，24 h时，ATCC35984的A值是2.051，明显高于SE101的A值(0.268)。

在生物膜形成过程中，微环境的改变或其他调节因子的参与都会影响生物膜的形成^[5,6,7,11]。而乳腺癌作为激素依赖型肿瘤，当E₂水平长期维持在103 pmol/L以上，其发病率也随之增高。因此我们通过模拟乳腺癌患者绝经前后的高雌激素水平，发现E₂能促进细菌提前进入对数生长期；同样ATCC35984和SE101形成的生物膜厚度也与E₂的浓度有明显正相关性，在E₂浓度为125 pmol/L时，两株细菌生物膜都达到最厚，提示E₂能明显促进表皮葡萄球菌生物膜的形成。

细菌生物膜的形成主要经过三个步骤：初始附着，菌落和菌群形成，脱落或分解。我们的前期研究已经发现高浓度的E₂能明显增加表皮葡萄球菌生物膜的形成，通过本次的研究发现E₂使ATCC35984和SE101的初始黏附能力都得到了加强，提示高浓度E₂通过促进细菌的初始黏附，达到对生物膜形成的影响。

细菌生物膜的结构复杂而有时序性。SEM观察ATCC35984生物膜发现，4 h可见细菌团，同时测得此时的A值在0.177～0.218，说明此时虽有生物膜形成，但未达到一定厚度；6 h时见小菌落覆盖，12 h时菌落群更丰富，且菌落之间有纤维组织形成；24 h时生物膜达到成熟阶段，其OD值也到最大值，在CLSM下呈现火山口状(图2C)。48 h和72 h就见生物膜崩解和再生并存。同时125 pmol/L E₂作用下形成的生物膜更厚、更致密，这可能会增加临床上细菌生物膜治疗的难度。

虽然我们观察到雌二醇对表皮葡萄球菌的生长和生物膜的形成有一定的促进作用，但是其作用机制尚不清楚，我们将在今后的实验中进一步进行探讨。

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贡献者信息

王曦

650118　昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院乳腺外一科

周永春

云南省肺癌研究重点实验室

黄云超

昆明医科大学第三附属医院胸外一科

邹天宁

650118　昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院乳腺外一科

吕志勇

昆明医科大学第三附属医院麻醉手术科

陈颖

昆明医科大学第三附属医院胸外一科

刘馨

昆明医科大学第三附属医院肿瘤研究所

段万石

昆明医科大学第三附属医院胸外一科

通信作者

黄云超

昆明医科大学第三附属医院胸外一科

Email：huangych2001@aliyun.com

关键词

雌二醇; 乳房假体; 表皮葡萄球菌; 细菌生长; 生物膜;

历史

出版日期：2016-10-18

收稿日期：2016-03-21

本文编辑

陈新石

Basic Research Article

Estradiol stimulates the growth and biofilm formation of clinical Staphylococcus epidermidis

Wang Xi, Zhou Yongchun, Huang Yunchao, Zou Tianning, Lü Zhiyong, Chen Ying, Liu Xin, Duan Wanshi

Published 2016-10-18

Cite as Natl Med J China, 2016, 96(38): 3083-3089. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.38.010

Abstract

Objective

To investigate the effect of steroid hormones on the growth and biofilm formation of S. epidermidis.

Methods

In all experiments, two S. epidermidis standard strains (ATCC12228 and ATCC35984) and two S. epidermidis clinical strains (SE101 and SE40) were incubated on the surface of silica gel in estradiol concentrations of 0, 50, 125, 250 and 500 pmol/L at 4, 6, 12, 24, 48 and 72 hours. Growth curve were drawn by means of the OD value. Formed biofilms were assessed by crystal violet staining methods. In order to observe the processes and structures of biofilm, the confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron microscope (SEM) were used.

Results

All of the four strains which were incubated with the concentrations of 125 pmol/L of estradiol had entered the logarithmic growth stage ahead of the blank control (3 h and 4 h). Crystal violet staining indicated that there was no biofilm for ATCC12228. Improved primary attachment abilities were found for ATCC35984 and SE101 in the presence of estradiol, and the OD values were 0 pmol/L (0.081±0.015 and 0.082±0.011), 50 pmol /L (0.087±0.013 and 0.088±0.010), 125 pmol/L (0.175±0.052 and 0.091±0.012), 250 pmol/L (0.153±0.036 and 0.090±0.006), 500 pmol/L (0.157±0.050 and 0.082±0.032), respectively. The thickness of biofilm reached the peak in 125 pmol/L estradiol at 24 h. CLSM and SEM found estradiol promoted the biofilm maturity and the biofilm of 125 pmol/L group was denser and thicker than that of the other concentration groups.

Conclusions

Our in vitro experiments indicate that estradiol could promote the growth of S. epidermidis which exit on the surface of silica gel, and improve the ability of biofilm formation of S. epidermidis.

Key words:

Estradiol; Prosthesis; Staphylococcus epidermidis; Bacterial growth; Biofilm

Contributor Information

Wang Xi

Department of Breast Surgery 1 Ward, Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University, the Tumor Hospital of Yunnan Province, Kunming 650118, China

Zhou Yongchun

Huang Yunchao

Zou Tianning

Lü Zhiyong

Chen Ying

Liu Xin

Duan Wanshi

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