探讨中介素(IMD)对过氧化氢(H2O2)诱导的骨髓源间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响及可能机制。
应用骨髓细胞贴壁培养法获得大鼠BMSCs；将10–6mol/L的IMD预处理BMSCs 30 min后，换用含100 μmol/L H2O2的完全培养基处理2 h，应用流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western印迹和免疫荧光检测IMD对凋亡相关蛋白的表达情况；并检测IMD对ERK1/2磷酸化水平的影响；进一步在IMD干预前用特异性抑通路制剂阻断ERK1/2信号途径，观察其对IMD作用的影响。
IMD可使BMSCs内ERK1/2通路磷酸化水平升高(P<0.01)。与对照组和IMD两组相比，在H2O2组中加入H2O2后细胞凋亡率则增加至55.9%(P<0.01)；但在IMD＋H2O2组中细胞凋亡率为15.7%，与对照组和IMD组相比细胞凋亡率增加，但较H2O2组显著降低(P<0.01)。IMD预处理可明显减少由H2O2介导的BMSCs凋亡，且促凋亡蛋白Caspase–3及Bax的表达减少，抗凋亡蛋白Bcl–2的表达增高(P<0.01)，ERK1/2通路特异性抑制剂U0126预处理后该作用消失。
IMD可激活BMSCs内ERK1/2信号通路，调节凋亡相关蛋白的表达，减少由H2O2诱导的BMSCs凋亡。激活ERK1/2通路参与了其抗凋亡作用的调控。
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骨髓源间充质干细胞(BMSCs)是干细胞治疗研究中的最佳候选种子细胞之一[1]。但在心肌梗死的研究中，由于梗死或损伤心肌组织微环境中存在氧化应激等不利因素，促使移植细胞短期内发生死亡或凋亡[2]。因此，增强BMSCs对有害刺激的防御能力，减少细胞凋亡是提高细胞移植利用率的重要策略。中介素(IMD)是降钙素基因相关肽(CGRP)超家族成员的一种扩血管活性肽，具有保护内皮功能、促血管生成、抗氧化应激、调节免疫和炎性反应以及抗凋亡作用[3]。文献报道IMD可通过抗氧化应激、减轻炎症反应和缺血再灌注损伤等机制进而抑制心肌细胞、肾小管细胞和脑血管内皮细胞的凋亡[4,5,6]，这提示IMD具有多器官和多细胞保护作用，推测IMD对BMSCs也可能有类似作用。细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)可以介导细胞内信号转导和基因表达，参与多种细胞增殖、迁移和分化调节[7]。本研究目的旨在探讨IMD在体外H2O2诱导的BMSCs凋亡的影响及其可能涉及ERK1/2通路的相关机制。
DMEM/F12 1∶1培养液(Hyclone公司)；Hyclone胎牛血清(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；大鼠IMD多肽(美国PHOENIX PHARMACEUTICAS公司)；FITC标记兔抗大鼠CD29抗体、PE标记小鼠抗大鼠CD90、CD45抗体(BioLegend公司)；Annexin V–FITC细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；兔抗大鼠β–肌动蛋白(Actin)、GAPDH、P–Erk1/2、T–Erk1/2、Bcl–2、Bax、Caspase–3多克隆抗体以及ERK1/2通路特异抑制剂U0126(Hyclone公司)。
取4～6周龄健康雄性SD大鼠(购自遵义医学院动物中心，清洁级，证书号ZY2010–115，平均体质量约100 g)断颈处死，无菌条件下获取双下肢骨髓液，1 000 r/min离心5 min；弃上清液后加入3 ml DMEM/F12培养液重悬细胞沉淀，混匀后接种于25 cm3培养瓶中培养。经多贴壁培养后以流式细胞仪鉴定细胞表面标志物(CD29、CD45和CD90)证实为目的细胞BMSCs。根据实验需要，将BMSCs分为6组：(1)对照组：正常状态下的BMSCs，不予任何处理；(2)IMD组：IMD(10–6mol/L)处理BMSCs 30 min；(3)H2O2组：H2O2(100 μmol/L)处理BMSCs 2 h；(4)IMD＋H2O2组：IMD(10–6 mol/L)预处理BMSCs 30 min后加入H2O2(100 μmol/L)处理BMSCs 2 h；(5)IMD＋H2O2＋U0126组：U0126(20 μmol/L)处理BMSCs 1 h后加入IMD(10–6 mol/L)处理30 min，再加入H2O2(100 μmol/L)处理2 h；(6)U0126组：U0126(20 μmol/L)处理BMSCs 1 h。
应用流式细胞仪检测对照组、IMD组、H2O2组、IMD＋H2O2组、IMD＋H2O2＋U0126组和U0126组的细胞凋亡情况。适时取各组培养细胞，以200 μl的Binding Buffer悬浮细胞后加入3～5 μl Annexin V–FITC混匀，加入5 μl Propidium Iodide(PI)，混匀；室温避光反应15 min，1 h内上机进行流式细胞仪检测。
应用免疫荧光法检测对照组、IMD组、H2O2组和IMD＋H2O2组BMSCs的Caspase–3表达情况。上述4组细胞以4%多聚甲醛室温固定30 min后0.5% triton–100破膜，山羊血清封闭30 min后加入Caspase–3抗体，4 ℃孵育过夜；加入二抗并以DAPI染色5 min后荧光显微镜观察结果。同时，应用常规Western印迹法检测这4组细胞中凋亡相关蛋白Caspase–3、Bax和Bcl–2表达水平。
为了检测IMD对BMSCs中凋亡相关蛋白表达调节是否是通过ERK1/2信号途径实现的，应用常规Western印迹法检测对照组、IMD组和IMD＋U0126组中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白的水平。同时应用Western印迹方法检测了对照组、IMD组、H2O2组、IMD＋H2O2组和IMD＋H2O2＋U0126组BMSCs中凋亡相关蛋白表达水平。
应用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。所有数据均使用
±s表示，组间采用单因素方差分析和t检验检测组间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。
取贴壁培养的生长良好的3代细胞以流式细胞仪测定细胞表面标记CD29、CD90和CD45的表达情况，结果显示CD29和CD90的阳性细胞比例分别为99.6%和99.7%，而CD45阳性细胞比例仅为2.3%，这提示培养的细胞绝大部分为BMSCs(图1)。
A：CD29阳性细胞为99.6%；B：CD90阳性细胞为99.7%；C：CD45阳性细胞仅为2.3%
应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，结果显示(图2)：对照组和IMD组细胞生长无变化(图2A，图2B，P>0.05)；与对照组和IMD两组相比，在H2O2组中加入H2O2后细胞凋亡率则增加至55.9%(图2C，P<0.01)；但在IMD＋H2O2组中细胞凋亡率为15.7%，与对照组和IMD组相比细胞凋亡率增加，但较H2O2组显著降低(图2D，P<0.01)。
首先应用免疫荧光检测IMD干预后BMSCs细胞中Caspase–3的蛋白水平，结果显示：对照组和IMD组的绿色荧光表达较弱(图3A)；IMD组绿色荧光表达与对照组比较差异无统计学意义(图3B)；当予H2O2处理后可见细胞内绿色荧光表达显著增强(图3C)；而IMD的预处理可明显减少绿色荧光表达，甚至恢复到对照组表达水平(图3D)。
应用Western印迹检测IMD对凋亡相关蛋白Caspase3、Bax和Bcl–2表达的影响，结果显示(图4)：对照组和IMD组的促凋亡蛋白Caspase–3和Bax的表达无明显差异(P>0.05)，而IMD组中抗凋亡蛋白Bcl–2的表达显著高于对照组(P<0.01)；H2O2组中Caspase–3、Bax表达较对照组和IMD组增高(P<0.01)，而Bcl–2表达与对照组无明显差异(P>0.05)，但较IMD组降低(P<0.01)；在IMD＋H2O2组中Caspase–3和Bax表达较H2O2组显著降低，而Bcl–2表达则显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)。
注：与对照组比较，aP<0.01；与IMD组比较，bP<0.01；与H2O2组比较，cP<0.01
为了明确IMD是否调节ERK1/2信号途径，以Western印迹法检测IMD对总ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白的影响。结果显示(图5)：3组中总ERK1/2水平无差异(P>0.05)；对照组仅有少量ERK1/2蛋白磷酸化，IMD组中磷酸化ERK1/2水平较对照组显著增多(P<0.01)，但在IMD＋U0126组中，磷酸化ERK1/2水平较IMD组显著降低(P<0.01)，与对照组相比无差异(P>0.05)。
进一步应用流式细胞检测了IMD是否通过激活ERK1/2信号通路影响BMSCs凋亡水平，结果显示(图6)：对照组、IMD组、H2O2组及IMD＋H2O2组的存活率、凋亡率和坏死率与Annexin/PI双染色结果一致(图2，P<0.01)；但在IMD＋H2O2＋U0126组中，BMSCs凋亡率和死亡率较IMD＋H2O2组和U0126组显著升高(图6D，图6E，P<0.01)，而U0126组的细胞凋亡率和死亡率与对照组无差异(图6F，P>0.05)。
为了验证IMD是否通过激活ERK1/2信号途径调节BMSCs凋亡相关蛋白表达水平，应用Western印迹检测各组蛋白水平，结果显示(图7)：对照组、IMD组、H2O2组和IMD＋H2O2组促凋亡蛋白(Caspase–3和Bax)和抗凋亡蛋白(Bcl–2)表达与前述结果一致(图4)；但在IMD＋H2O2＋U0126组中加入ERK1/2特异性抑制剂U0126后Caspase–3和Bax蛋白表达较IMD组和IMD＋H2O2组显著增加，而Bcl–2则显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；同时，无论是促凋亡蛋白还是抗凋亡蛋白，其表达水平均与H2O2组类似，两者差异无统计学意义(P>0.05)。
基础研究发现，干细胞在体外培养后可诱导分化为心肌细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、脂肪细胞和骨细胞等[1]，将干细胞移植到心肌梗死交界区后可分化为心肌细胞和血管内皮细胞，减少梗死面积并提高心功能[8,9]。尽管多种类型干细胞移植治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病(包括心肌梗死、脑梗死和外周动脉疾病等)的相关研究取得了极大进展，但缺血或坏死心肌微环境中存在着促进细胞凋亡的各种因素如氧化应激、缺氧和炎症反应等，使移植后的细胞大量凋亡，导致移植细胞存活率低，这始终是无法逾越的障碍，也很大程度上限制了干细胞治疗应用效果[10]。因此提高移植细胞活力并恢复细胞修复机制是细胞移植治疗获得理想结果的关键因素。
文献报道[4,5,6]，IMD具有抗细胞凋亡作用，能够保护多种细胞免受各种刺激诱导的凋亡。但这一作用是否同样适用于BMSCs？本研究发现，IMD减少了由H2O2诱导的BMSCs的凋亡，并可调节凋亡相关蛋白的表达。同时，IMD预处理后，ERK1/2通路的磷酸化水平升高，这提示IMD可激活BMSCs的ERK1/2通路。而且还发现，当用ERK1/2特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2信号途径时，IMD对BMSCs的保护作用受到抑制，这提示ERK1/2信号通路的激活在IMD对H2O2诱导的BMSCs的凋亡的抑制作用及调节凋亡相关蛋白表达中具有重要影响。本研究结果表明，ERK1/2信号通路的激活参与了IMD抗H2O2诱导的BMSCs凋亡作用。
总之，IMD在提高移植细胞对抗不良环境的影响，减少细胞凋亡，促进细胞存活，提高干细胞移植效率等方面具有一定价值。
