探讨硫化氢对吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠模型肺血管重塑的作用及机制。
24只清洁级雄性SD大鼠，按简单随机法分为4组：对照组、吸烟组、吸烟＋硫氢化钠(NaHS)组、吸烟＋炔丙基甘氨酸(PPG)组。对照组正常喂养，呼吸清洁空气，其余组均采用被动香烟烟雾吸入法构建慢阻肺模型，8周后对相应组的大鼠给予NaHS或PPG药物干预。16周后测定各组肺小动脉血管重塑指标；免疫组织化学方法检测各组肺血管中增殖指标增殖细胞核抗原(PCNA)以及氧化应激指标3－硝基酪氨酸(3－NT)的表达。
吸烟组气道阻力显著高于对照组(0.859±0.283比0.578±0.088，P<0.05)，小气道病理评分明显增高，模型构建成功。吸烟组肺小动脉中膜厚度和完全肌化程度均显著高于对照组、吸烟＋NaHS组(0.54±0.20比0.37±0.12、0.39±0.08和0.61±0.16比0.20±0.12、0.34±0.13，均P<0.01)，而吸烟＋PPG组与吸烟组差异无统计学意义。吸烟组肺血管中PCNA表达均显著高于对照组、吸烟＋NaHS组(0.27±0.08比0.12±0.06、0.14±0.06，均P<0.05)，吸烟＋PPG组与吸烟组差异无统计学意义；与形态学结果相一致。吸烟组3－NT表达显著高于对照组、吸烟＋NaHS组(0.26±0.08比0.18±0.04、0.19±0.06，均P<0.01)，吸烟＋PPG组与吸烟组差异无统计学意义；且肺小动脉中膜厚度与3－NT表达水平呈强相关(r＝0.906，P<0.001)。
硫化氢可显著改善吸烟所致慢阻肺模型的肺血管重塑，可能与其能够减轻氧化应激损伤有关。
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慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种以气流受限为特征的气道慢性炎症疾病，肺血管重塑在慢阻肺早期阶段就已经出现，甚至在轻度慢阻肺患者以及肺功能正常的吸烟者中肺血管结构的改变都很明显[1]。肺血管重塑的病理改变涉及血管全层，主要表现为内皮细胞功能失调，平滑肌细胞异常增殖和凋亡抑制，细胞外基质合成分泌失调等。传统的观点认为慢阻肺继发的肺血管改变是由于缺氧所致，导致肺动脉高压、肺心病、右心功能不全，但最近研究发现氧疗并不能逆转慢阻肺相关的肺血管重塑，吸烟可以直接导致肺血管重塑[2]，氧化应激在肺血管重塑中起主要作用[3]，是肺血管重塑治疗的重要靶点。
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的新型气体信号分子，具有抗炎、抗损伤和抗氧化等多种生物效应，为维持机体稳态发挥积极作用。同时，H2S是重要的血管保护分子，能够通过舒张血管，增加血管张力，促进血管新生内膜形成等机制调节血管生理过程。最近研究表明H2S能够改善糖尿病肾病中肾脏血管重塑[4]以及饮食诱导的肥胖小鼠中微血管重塑[5]。另外，既往研究发现，H2S能够抑制低氧诱导、高血流量及自发性肺动脉高压中的肺血管重塑[6,7,8]。本研究探讨H2S干预是否能够改善吸烟导致慢阻肺相关的肺血管重塑，并进一步探讨其中的机制。
24只6～8周龄清洁级健康雄性成年SD大鼠(200～250 g)，购于北京大学医学部实验动物部。
都宝牌香烟(焦油含量8 mg，烟气烟碱量0.7 mg，安徽中烟工业责任有限公司)。乌拉坦、4%多聚甲醛(北京市化学试剂公司)，弹性纤维范吉森(EVG)染色试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，鼠抗α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)抗体(武汉博士德生物公司)，兔抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体(美国Cell signaling公司)，硫氢化钠(NaHS)(H2S供体)、炔丙基甘氨酸(PPG)(H2S抑制剂)、3－硝基酪氨酸(3－NT)单克隆抗体(美国Sigma公司)，动式染毒箱(直径700 mm，天津合普公司)，Powerlab多导生理测试仪(澳大利亚AD Instruments公司)。
24只大鼠以简单随机法平均分为4组：对照组、吸烟组、吸烟＋硫氢化钠(NaHS)组、吸烟＋炔丙基甘氨酸(PPG)组。对照组正常喂养，呼吸清洁空气。其余各组均采用被动香烟烟雾吸入法[9]。大鼠在动式染毒箱内吸烟，2次/d，2 h/次，两次之间间隔6 h；第1天10支/次，第2天15支/次，第3天起20支/次，共吸烟16周。第8周后每天吸烟前给予吸烟＋NaHS组腹腔注射NaHS 14 μmol/kg，吸烟＋PPG组腹腔注射PPG 37.5 mg/kg，对照组和吸烟组腹腔注射与吸烟＋NaHS组相同剂量的生理盐水(14 μmol/kg)。
参考文献[9]，16周后，各组大鼠进行肺功能检测，腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠。麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于鼠板上，分离气管，行气管插管，固定，连结自制的"Y"型玻璃管，另两端分别与流速传感器连接。流速传感器与小动物呼吸机连接，设置小动物呼吸机潮气量为10 ml/kg，呼吸频率60次/min，呼吸比为1∶1。流速传感器和压力传感器分别再与多导生理测试仪的桥式放大器相连，则大鼠呼吸的流量和压力曲线均可显示于电脑监视器上，经LabChart7软件系统分析，计算肺功能各项指标：气道阻力、顺应性。气道阻力＝(峰压－平台压)/吸气流速；顺应性＝潮气量/平台压。
16周后，采用脊椎脱臼法处死大鼠，取大鼠左肺，用冰生理盐水洗净残血，然后迅速置于4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定10 h，转入20%蔗糖溶液，然后做常规石蜡切片。大鼠肺组织HE染色片在光镜下进行病理学观察以及小气道8项指标评分。采用盲法，由北京大学医学部病理学专业人员进行评分。小气道评分指标详见[10]。
大鼠肺组织石蜡切片做EVG染色，光镜下观察EVG染色切片，应用Image pro Plus 6.0图像处理分析软件，选择直径50～150 μm的肺小动脉，按照Zhou等[11]介绍的方法测定肺小动脉的中膜厚度和血管外径(外弹力板的平均直径)。根据公式计算中膜厚度百分比：中膜厚度百分比＝(2×中膜厚度/血管外径)×100%。应用α－SMA免疫组织化学染色检测血管肌化情况，具体参照Kishimoto等[12]介绍的方法。
大鼠肺组织中PCNA、3－NT蛋白的表达采用常规SP法免疫组化技术，一抗浓度PCNA(1∶300)，3－NT(1∶150)，其中用PBS替代一抗作为阴性对照。光学显微镜下观察，细胞质或细胞核呈棕黄色为阳性表达。其中免疫组化结果分析PCNA表达采用肺血管中阳性细胞数占总细胞数的比例，3－NT采用阳性染色面积分析法即阳性表达光密度值与阳性表达实际面积的比值。
采用SPSS 20.0软件进行，正态分布的计量资料以
±s表示，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两之间比较采用Tukey's检验，相关分析采用Pearson相关检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
吸烟组气道阻力均显著高于对照组、吸烟＋NaHS组(均P<0.05)，吸烟＋PPG组与吸烟组差异无统计学意义。各组间大鼠肺顺应性相似(表1)。
各组间大鼠肺功能及病理评分的比较(
±s)
各组间大鼠肺功能及病理评分的比较(±s)
| 组别 | 只数 | 气道阻力(cmH2O·ml－1·s－1) | 肺顺应性(ml/cmH2O) | 病理评分 |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.578±0.088 | 0.12±0.03 | 0 |
| 吸烟组 | 6 | 0.859±0.283a | 0.10±0.02 | 1.94±0.23b |
| 吸烟＋H2S组 | 6 | 0.538±0.077c | 0.13±0.02 | 1.44±0.14d |
| 吸烟＋PPG组 | 6 | 0.867±0.120 | 0.10±0.01 | 2.15±0.20 |
注：H2S：硫化氢，PPG：炔丙基甘氨酸；与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01；与吸烟组相比，cP<0.05，dP<0.01；1 cmH2O＝0.098 kPa
吸烟组大鼠支气管管壁明显增厚，黏膜上皮细胞损伤明显，大量炎症细胞浸润，同时伴有明显的肺气肿及肺大泡形成(图1)；小气道病理评分显著高于对照组(1.94±0.28比0，P<0.01)，证明慢阻肺模型构建成功。与吸烟组相比，吸烟＋NaHS组肺组织形态明显好转(图1)，小气道病理评分(1.44±0.14)显著低于吸烟组(P<0.01)。
注：A～D为HE染色(×400)，E～H为EVG染色(×400)；A～D和E～H分别依次为：对照组、吸烟组、吸烟＋硫氢化钠(NaHS)组、吸烟＋炔丙基甘氨酸(PPG)组；A、C示支气管结构完整，管壁薄，黏膜下无炎症细胞浸润；B、D示支气管管壁明显增厚，黏膜下大量炎症细胞浸润，黏膜上皮细胞损伤严重，且B示伴有明显的肺气肿和肺大泡形成；其中E、G示肺小动脉管壁薄，F、H示肺小动脉管壁厚度明显增加
对照组中肺小动脉管壁结构正常；吸烟组中肺小动脉中膜厚度及肌化程度均显著高于对照组(均P<0.01)；与吸烟组相比，吸烟＋NaHS组血管形态明显改善，管壁变薄，肺小动脉中膜厚度和完全肌化程度均显著低于吸烟组(均P<0.01)；吸烟＋PPG组与吸烟组差异均无统计学意义(图1、表2)。
各组间大鼠肺血管重塑指标比较(
±s)
各组间大鼠肺血管重塑指标比较(±s)
| 组别 | 只数 | 中膜厚度比例 | 完全肌化程度比例 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.37±0.12 | 0.20±0.12 |
| 吸烟组 | 6 | 0.54±0.20a | 0.61±0.16a |
| 吸烟＋NaHS组 | 6 | 0.39±0.08b | 0.34±0.13b |
| 吸烟＋PPG组 | 6 | 0.59±0.17 | 0.58±0.14 |
注：NaHS：硫氢化钠，PPG：炔丙基甘氨酸；与对照组相比，aP<0.01；与吸烟组相比，bP<0.01
吸烟组PCNA的表达均显著高于对照组、吸烟＋NaHS组(P<0.01、P<0.05)，吸烟＋PPG组与吸烟组差异无统计学意义(图2、表3)。
大鼠肺组织中PCNA和3－NT的表达比较(
±s)
大鼠肺组织中PCNA和3－NT的表达比较(±s)
| 组别 | 只数 | PCNA阳性细胞比例 | 3－NT表达(光密度值/面积) |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.12±0.07 | 0.18±0.04 |
| 吸烟组 | 6 | 0.27±0.06a | 0.26±0.08a |
| 吸烟＋H2S组 | 6 | 0.14±0.06b | 0.19±0.06c |
| 吸烟＋PPG组 | 6 | 0.21±0.07 | 0.26±0.15 |
注：PCNA：增殖细胞核抗原；3－NT：3－硝基酪氨酸；与对照组相比，aP<0.01；与吸烟组相比，bP<0.05，cP<0.01
注：A～D为PCNA免疫组化(×400)；E～H为3－NT免疫组化(×400)；A～D和E～H分别依次为：对照组、吸烟组、吸烟＋硫氢化钠(NaHS)组、吸烟＋炔丙基甘氨酸(PPG)组
肺血管重塑与氧化应激水平显著相关，肺小动脉中膜厚度百分比与氧化应激指标3－NT表达呈显著正相关(r＝0.906，P<0.001)(图3)。
慢阻肺是临床上常见病和多发病，以进行性的不可逆气流受限为特征，吸烟是其最主要的危险因素[13]。30%～70%的慢阻肺患者存在肺动脉高压，肺血管重塑是发展为肺动脉高压的关键环节[14]。慢阻肺自然病程的早期阶段已出现肺血管结构和功能破坏，肺血管重塑的发生使慢阻肺患者急性加重风险增加，生活质量和生存率降低，预后更差[1]。传统观点认为低氧是造成肺血管重塑的主要因素，但是肺功能轻度受限甚至正常的吸烟者出现肺血管重塑时没有明显的低氧，且氧疗也不能逆转慢阻肺相关的肺动脉高压，现在普遍认为吸烟可以直接导致慢阻肺患者肺血管重塑[2,15]。而氧化应激是导致慢阻肺中肺血管重塑发生重要机制。
H2S是继NO和CO之后的"第三种气体信号分子" ，其合成依赖三种酶：胱硫醚－β－合酶、胱硫醚－γ－裂解酶以及3巯基丙酮酸转硫酶[16]。然而，在发现生物体存在内源性H2S之前的很长一段时间，这种具有臭鸡蛋气味的气体一直被认为是环境污染物和有毒气体。随着对H2S研究的深入，逐渐认识到它在神经、心血管、呼吸等多个系统发挥抗炎、抗损伤和抗氧化等保护作用，维持正常的生理过程。
前期研究发现H2S在慢阻肺患者中发挥保护作用[17]；进一步研究发现吸烟者和慢阻肺患者H2S代谢发生改变，外源性给予H2S可以提高香烟烟雾提取物孵育后巨噬细胞的谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶水平，抑制炎症因子白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的分泌[18]。本研究显示H2S能显著改善大鼠慢阻肺相关的肺血管重塑，给予H2S干预后，肺血管重塑明显改善，肺血管中增殖指标PCNA的表达与对照组相比也明显减少。
目前H2S改善肺血管重塑的具体机制并不清楚，NaHS能够增加基质金属蛋白酶13和组织型基质金属蛋白酶抑制因子1表达减少细胞外基质的沉积从而抑制肺血管重塑[19]；肺动脉平滑肌细胞的异常增殖和凋亡抑制是肺血管重塑的重要病理改变，H2S可以通过上调Fas、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3，抑制B淋巴细胞瘤2表达促进肺动脉平滑肌细胞凋亡[20]，并可以提高ERK1/2磷酸化水平，降低细胞周期蛋白cylinD1的表达抑制细胞增殖[21]，从而改善肺血管重塑。
氧化应激是肺动脉高压和肺血管重塑发生发展的重要机制。3－NT是氧化应激损伤的产物，是氧化应激的标志性分子。本研究结果显示，肺血管重塑与氧化应激水平呈强相关；NaHS干预后，与吸烟组相比，吸烟＋NaHS组中大鼠的肺血管3－NT表达明显下降，提示H2S改善吸烟引起的肺血管重塑与其抗氧化应激作用相关。既往研究臭氧导致的氧化应激，外源性给予NaHS可以增加臭氧处理后肺组织中H2S的产生速率，降低肺泡灌洗液中丙二醛，提高GSH/氧化型GSH的比值[22]；另外，心血管系统中NaHS也可以降低血管紧张素Ⅱ诱导的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖的超氧化物产生[23]，这些效应都体现了H2S的抗氧化性。本研究结果也显示H2S通过抗氧化作用改善慢阻肺相关的肺血管重塑。但是H2S抑制吸烟诱导的慢阻肺相关的肺血管重塑具体分子机制和靶点还不清楚，需要进一步探究。
H2S作为新发现的气体信号传导分子，属于简单小分子，合成过程简单，传播速度快，可以自由穿过细胞膜，进出细胞不需要依赖特异性的受体或其他传导机制等特点[24]，可能改善血管重塑方面更具有特殊意义。需要注意的是H2S有效治疗窗相对较窄，高浓度H2S可能抑制线粒体呼吸链[25]而具有毒性反应。但合适浓度的H2S对血管重塑的改善作用仍令人振奋，值得深入探究。
综上所述，H2S能够明显改善吸烟引起的慢阻肺相关的肺血管重塑，其机制可能与其能够减轻氧化应激损伤相关。
