探讨三阴性乳腺癌(TNBC)中乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)DNA启动子甲基化修饰及其表达对癌细胞生物学行为的影响。
采用免疫组织化学法检测BRMS1在TNBC及癌旁组织标本中的表达情况。通过反转录PCR(reverse transcription－PCR，RT－PCR)和Western印迹法检测TNBC细胞及正常乳腺上皮细胞中BRMS1 mRNA及蛋白表达情况，应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测各细胞中BRMS1的甲基化状态，去甲基化制剂5－Aza－dC处理使BRMS1表达再活化，侵袭实验检测BRMS1去甲基化对癌细胞侵袭能力的影响，将数据进行统计学分析。
BRMS1蛋白在TNBC组织中的阳性表达率为29.9%(20/67)明显低于其在癌旁组织中的阳性表达率61.2%(41/67)，差异具有统计学意义(χ2＝6.635，P<0.05)，有淋巴结转移者BRMS1 mRNA的表达水平低于无淋巴结转移者(P＝0.018<0.05)，BRMS1表达下调与DNA启动子甲基化有关，差异有统计学意义(χ2＝14.68，P<0.05)。BRMS1 mRNA及蛋白表达与肿瘤大小及TNM分期亦有相关性(P＝0.000～0.003<0.05)。经5－Aza－dC处理后，侵袭细胞数目较对照组显著减低，差异有统计学意义(t＝3.262～10.72，P<0.05)。
TNBC中存在BRMS1表达下调，并与该基因DNA启动子甲基化修饰有关，去甲基化可使BRMS1表达再活化从而抑制细胞侵袭能力。
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有研究表明，BRMS1在乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、鼻咽癌和非小细胞肺癌等肿瘤中表达下调，且与癌细胞的侵袭、转移和患者的预后相关[1,2,3]。癌症是遗传学和表观遗传学现象共同作用的结果，在表观遗传学种种现象中，对DNA甲基化的研究最为深入。本研究旨在观察TNBC和癌旁组织及细胞中BRMS1的表达及甲基化状态，分析其表达与临床病理特征、甲基化、肿瘤转移之间的关系。
研究对象为116例TNBC患者标本及癌旁组织标本，取材自2013年1月至2016年1月在青岛大学附属医院行乳腺癌改良根治术的患者，癌旁组织取材距肿瘤边缘3 cm以上，标本离体后立即进行－80 ℃冻存和石蜡包埋保存。所有患者术前未接受化放疗等其他治疗，术后通过查阅病理切片记录确认组织病理类型，通过患者病历收集年龄、肿瘤大小、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况等资料。本研究得到患者知情同意及医院伦理委员会批准。
从北京癌症研究所购得有基底细胞样转录模式的三个TNBC细胞株(MDA－MB－435、MDA－MB－231和HCC－1937)和正常乳腺上皮细胞株(MCF－10A)[4]，细胞株培养于DMEM培养液中，购自上海杰美基因医药科技有限公司(美国，货号GMS12322.1)，并置于恒温培养箱中。将细胞在5－Aza－dC(购自北京宝希迪科技有限公司，货号A3656)的培养基上培养3 d后提取细胞RNA和DNA。取对数生长期的MDA－MB－231细胞株，稀释成单细胞悬液接种在24孔培养板上，过夜培养后，用小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA使细胞转染，购自上海杰美基因医药科技有限公司(产地美国，货号：GMS90005)。Perfect Real Time(PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser)、Sigma试剂盒购于大连宝生物公司。一抗小鼠抗人β－action多克隆抗体、二抗山羊抗小鼠IgG标记辣根过氧化物酶、RIPA裂解液购于康为世纪公司。EnVision法免疫组织化学检测试剂盒购于北京中杉金桥公司。
将石蜡包埋组织标本制成4 μm的切片，采用EnVision法行免疫组织化学染色，严格按说明书操作。BRMS1一抗稀释度为1∶100。染色前经微波加热抗原修复液(pH值6.0枸橼酸抗原修复液，100 ℃，15 min)修复抗原。PBS代替一抗作阴性对照，已知的阳性片作阳性对照，DAB显色，苏木精对比染色。
利用TRIzol(购自美国Invitrogen公司，货号：15596026)提取总RNA，根据Perfect Real Time反转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。使用Sigma试剂盒在ABI Fast7500荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。
按照RIPA裂解液说明书进行操作，提取组织蛋白；定量使用的蛋白浓度测定试剂从Bio－Rad公司购得。
用DNazol分别提取两组细胞基因组DNA，然后用EpiT ect Bisulfite Kit对基因组DNA进行重亚硫酸钠处理并净化回收，以上操作过程均遵照说明书。2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射仪上观察并摄像。
24孔板Transwell小室(Corning)上室中加入无血清培养基重悬细胞，每孔50 000个细胞，置于细胞培养箱中正常孵育24 h后，4%多聚甲醇固定，考马斯亮蓝染色，PBS清洗擦拭上室表面细胞，显微镜下细胞计数。
分类变量检验采用χ2检验和Fisher精确检验，连续变量采用t检验或单因素方差分析法。相关mRNA表达水平(BRMS1/GAPDH)按照计量资料分析，数据表示为
±s。实验数据均使用SPSS 20.0统计分析软件进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。
通过免疫组化法对67组配对的TNBC及癌旁组织标本进行分析，结果示BRMS1在TNBC中的阳性表达率29.9%(20/67)明显低于其在癌旁组织中的阳性表达率61.2%(41/67)，差异有统计学意义(χ2＝6.635，P<0.05)。
通过RT－PCR技术分析BRMS1在MCF－10A、HCC－1937、MDA－MB－435和MDA－MB－231细胞株中的表达情况，结果示HCC－1937、MDA－MB－435和MDA－MB－231细胞株中BRMS1 mRNA表达较正常乳腺上皮细胞株MCF－10A表达下调，其中MDA－MB－231细胞株中BRMS1表达最低。且BRMS1 mRNA的表达仅与淋巴结转移存在相关性，有淋巴结转移者mRNA的表达水平明显低于无淋巴结转移者(P＝0.018)(图1、表1)。
A：RT－PCR分析BRMS1在4组细胞株中的表达，其中表达最低的是MDA－MB－231细胞株。B：免疫组化分析BRMS1在TNBC和癌旁组织标本中的表达。RT－PCR分析BRMS1基因表达的mRNA(C)和蛋白质(D)在TNBC和癌旁组织标本中的表达。N：癌旁组织，T：乳腺癌组织
三阴性乳腺癌组织中BRMS1的表达与临床病理参数(
±s)
三阴性乳腺癌组织中BRMS1的表达与临床病理参数(±s)
| 临床病理学变量 | 例数(n＝67) | BRMS1表达 | P值 | |
|---|---|---|---|---|
| 年龄(岁) | 0.882 | |||
| ≤45 | 29 | 1.301±0.862 | ||
| >45 | 38 | 1.344±0.669 | ||
| 肿瘤大小(cm) | 0.715 | |||
| ≤2 | 22 | 1.270±0.749 | ||
| >2 | 45 | 1.344±0.800 | ||
| 组织学分级 | 0.302 | |||
| Ⅰ＋Ⅱ | 15 | 1.504±0.877 | ||
| Ⅲ | 52 | 1.267±0.749 | ||
| 淋巴结转移 | 0.018 | |||
| 无 | 27 | 1.590±0.816 | ||
| 有 | 40 | 1.137±0.705 | ||
| TNM分期 | 0.119 | |||
| Ⅰ＋Ⅱ | 42 | 1.434±0.812 | ||
| Ⅲ | 25 | 1.127±0.693 | ||
116例乳腺癌组织及癌旁组织标本进行PCR，结果显示53.4%(62/116)乳腺癌组织及24.1%(28/116)癌旁组织中存在BRMS1 DNA启动子甲基化；19.8%(23/116)乳腺癌组织及13.8(16/116)癌旁组织存在部分甲基化；26.7%(31/116)乳腺癌组织和62.1%(72/116)癌旁组织中未观察到甲基化(图2B)，经统计学分析示乳腺癌组织中BRMS1 DNA启动子甲基化显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2＝14.68，P<0.05)。
1：相对参照物；2：MDA－MB231；3：MDA－MB－435；4：HCC－1937；5：MCF－10A M：甲基化，U：非甲基化，N：癌旁组织，T：乳腺癌组织
MSP分析显示BRMS1低表达细胞株MDA－MB－231存在BRMS1 DNA启动子区CpG岛甲基化，HCC－1937和MDA－MB－435细胞株中则存在部分甲基化，在HCC－1937、MDAMB－435细胞株中存在非甲基化和甲基化的两个条带，BRMS1高表达细胞株MCF－10A中没有观察到甲基化条带(图2A)，经统计学分析BRMS1表达与DNA启动子区CpG岛甲基化存在相关性(P<0.05)。此外，BRMS1 DNA启动子甲基化与肿瘤大小和TNM分期亦存在相关性(表2)。
三阴性乳腺癌组织中BRMS1甲基化与临床病理参数
三阴性乳腺癌组织中BRMS1甲基化与临床病理参数
| 临床病理学变量 | 例数(n＝116) | BRMS1表达 | P值 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| U(%) | P(%) | M(%) | ||||
| 年龄(岁) | 0.342 | |||||
| ≤45 | 45 | 16(35.6) | 6(13.3) | 23(51.1) | ||
| >45 | 71 | 15(21.1) | 17(23.9) | 39(54.9) | ||
| 肿瘤大小(cm) | 0.000 | |||||
| ≤2 | 43 | 23(53.5) | 14(32.6) | 6(14.0) | ||
| >2 | 73 | 8(11.0) | 9(12.3) | 56(76.7) | ||
| 组织学分级 | 0.497 | |||||
| Ⅰ＋Ⅱ | 36 | 7(19.4) | 9(25.0) | 20(55.6) | ||
| Ⅲ | 80 | 24(30.0) | 14(17.5) | 42(52.5) | ||
| 淋巴结转移 | 0.410 | |||||
| 0 | 9 | 0(0.0) | 3(33.3) | 6(66.7) | ||
| 1～3 | 59 | 17(28.8) | 12(20.3) | 30(50.8) | ||
| 3 | 48 | 14(29.2) | 8(16.7) | 26(54.2) | ||
| TNM分期 | 0.003 | |||||
| Ⅰ | 15 | 7(46.7) | 7(46.7) | 1(6.7) | ||
| Ⅱ | 82 | 20(24.4) | 13(15.9) | 49(59.8) | ||
| Ⅲ | 19 | 4(21.1) | 3(15.8) | 12(63.2) | ||
选取乳腺癌高转移细胞株MDA－MB－231加入5－Aza－dC，可使BRMS1 DNA启动子区CpG岛从甲基化状态转变为去甲基化状态，使BRMS1表达重新激活，基因表达显著增加，制剂浓度10 μmol/L时表达最高。为进一步验证BRMS1表达活化是否可以调节乳腺癌细胞侵袭能力，故进行侵袭实验，结果示未做处理组中穿膜细胞数为(62.3±5.9)个/HP。5－Aza－dC处理组中穿膜细胞数显著降低，计数为(37.3±6.8)个/HP。经统计学计算，差异有统计学意义(t＝3.262，P<0.05)。
另外，使用BRMS1特异性小干扰RNA(specific small interfering RNA，siRNA－BRMS1)敲弱BRMS1在MDA－MB－231细胞株中的表达，免疫印迹证实转染48 h后出现BRMS1表达下调。结果示使用siRNA－BRMS1转染后侵袭细胞数目(85.79±7.83)个/HP较对照组显著增多(t＝10.72，P<0.05)。
BRMS1是2000年由Seraj等[5]发现的一种转移抑制基因，现已明确证实其具有肿瘤转移抑制作用，但不影响肿瘤本身的生长。众所周知，肿瘤抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的恶性表型；而肿瘤转移抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的转移表型[6]。已有研究显示BRMS1显着抑制多种肿瘤的体外细胞转移表型，如黑色素瘤，卵巢癌，膀胱癌，肺癌[7,8,9,10]，且其在非小细胞肺癌的中的表达亦明显少于其在癌旁肺中的表达[11]。因此对BRMS1的研究不仅有助于我们更深入理解肿瘤侵袭转移的机制，而且也可作为肿瘤治疗的新靶点和诊断、判断预后的新指标。
本研究首先采用免疫组化法检测BRMS1的蛋白表达水平，结果显示乳腺癌组织BRMS1阳性表达率显著低于癌旁组织，RT－PCR分析结果示TNBC细胞株中BRMS1 mRNA表达较正常乳腺上皮细胞株表达下调，且BRMS1的表达与淋巴结转移情况密切相关，差异均有统计学意义(均P<0.05)，进一步证实了BRMS1是肿瘤抑制基因，并提示BRMS1低表达与TNBC发生发展过程密切相关，可作为预后评估及判断乳腺癌患者是否发生淋巴结转移的可靠指标。
其次，通过PCR检测TNBC及癌旁组织标本中BRMS1 DNA启动子甲基化情况，结果显示乳腺癌组织中BRMS1 DNA启动子甲基化显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。MSP技术检测结果示在细胞株中，BRMS1低表达细胞株(TNBC细胞株)中DNA甲基化水平明显高于BRMS1高表达细胞株(正常乳腺上皮细胞株)，经统计学分析，可以认为BRMS1表达与DNA启动子区CpG岛甲基化存在相关性(P<0.05)。此外，BRMS1基因DNA甲基化与肿瘤大小和TNM分期有关。这表明BRMS1的甲基化频率越高，TNBC的恶性程度可能也越高。
最后，为进一步探索DNA甲基化与基因表达及肿瘤转移的关系，我们用DNA甲基转移酶抑制剂5－Aza－dC处理MDA－MB－231细胞株，启动子区CpG岛由甲基化状态转变为去甲基化状态，使BRMS1重新激活，mRNA和蛋白质表达显著上调。Transwell试验证实5－Aza－dC可抑制肿瘤侵袭。siRNA－BRMS1敲弱BRMS1的表达后侵袭细胞数目较对照组显著增多。这些结果均表明，当BRMS1表达下调时，肿瘤细胞侵袭作用显着增强。
总之，本实验深入研究了BRMS1在TNBC中的表达情况及其意义，有助于了解癌细胞转移侵袭的分子机制，并为寻找TNBC抑制转移功能位点开辟了新道路，为乳腺癌的治疗和预后提供重要理论依据。
