探讨子宫内膜异位症(以下简称内异症)患者卵泡液、卵泡刺激素(FSH)及骨形态发生蛋白－15(BMP－15)对离体培养的人黄素化颗粒细胞增殖及其孕酮分泌的影响。
取因管性/男方因素不孕行体外受精－胚胎移植(IVF－ET)患者促排卵后取卵日卵丘颗粒细胞。对照组用全DMEM/F－12培养液培养，试验组用分别加入12 μg/L卵泡刺激素(FSH)，为FSH组、6 μg/L BMP－15(BMP－15组)、5%管性/男方因素不孕患者卵泡液(管性组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液(内异组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液＋12 μg/L FSH(内异＋FSH组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液＋6 μg/L BMP－15(内异＋BMP－15组)的DMEM/F－12培养液培养。48 h后用血球计数法观察细胞的生长速度，采用化学发光法检测培养上清液孕酮的水平。
与对照组比，FSH组细胞增殖增加，内异组及内异＋BMP15组细胞增殖受抑制，差异均有统计学意义。与对照组比FSH组、管性组及内异组的颗粒细胞培养上清液的孕酮水平显著升高。内异组与管性组比孕酮分泌降低；在内异组中加入FSH(内异＋FSH组)后，孕酮分泌水平比对照组及单纯内异组显著增加，加入BMP－15(内异＋ BMP－15组)后，孕酮分泌水平比对照组增加，与单纯内异组差异无统计学意义。
FSH可以促进颗粒细胞的增殖及孕酮分泌功能，BMP－15对颗粒细胞的增殖及孕酮分泌功能无明显影响。内异症患者卵泡液对颗粒细胞的增殖及孕酮分泌均有抑制作用，FSH可以逆转其抑制作用，BMP－15不能改变内异症患者卵泡液的作用结局。
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子宫内膜异位症(以下简称内异症)是女性不孕的主要原因之一，其可能从多方面影响妊娠结局。研究表明，体外受精－胚胎移植(IVF－ET)能提高内异症患者的妊娠率[1]，但妊娠结局仍比输卵管性因素不孕患者差。在行IVF－ET的患者中，内异症患者的获卵数、卵子质量及受精率均比管性因素患者的明显降低[2]，提示内异症可通过影响卵子及胚胎质量，从而导致妊娠率下降。卵泡液是卵子及颗粒细胞的局部微环境，研究发现内异症患者卵泡液内多种因子水平异常，影响卵子质量、受精情况及妊娠结局[3]。但是内异症患者卵泡液具体通过哪种途径影响到卵子质量尚无报道，内异症患者卵泡液对颗粒细胞的增殖与孕酮分泌的影响也并无报道，本试验通过将内异症患者卵泡液添加至人黄素化颗粒细胞中，离体培养后，计数细胞数量及测定孕酮分泌水平，观察对颗粒细胞的影响。希望了解内异患者妊娠结局差是否与其卵泡液对颗粒细胞的作用相关。卵泡刺激素(FSH)是参与卵泡生长和发育过程的重要激素，它能促进卵泡成熟及排卵，促进卵丘颗粒细胞扩展，抑制颗粒细胞凋亡，同时也能加速颗粒细胞的有丝分裂。既往研究发现FSH可促进颗粒细胞增殖及增强其分泌功能。骨形态蛋白－15(BMP－15)由自身卵母细胞分泌，有研究发现，颗粒细胞是BMP－15作用的靶细胞，使之对FSH的刺激敏感，并抑制细胞凋亡[4]，内异患者卵泡液中BMP－15蛋白的表达降低，其卵丘颗粒细胞凋亡率增加[5]。本试验将FSH和BMP－15添加至加或不加内异患者卵泡液的人黄素化颗粒细胞中，离体培养后，计数细胞数量及测定孕酮分泌水平，观察对颗粒细胞的影响，进一步了解FSH、BMP－15对颗粒细胞的作用和对内异症患者有无调节作用。
DMEM培养液(Gibco，美国)，F－12培养液(Hyclone，美国)，胎牛血清(FBS，Gibco，美国)，0.25%胰蛋白酶(Solarbio，中国)，FSH(Gonal－F，MerckSeronoSA AubonneBranch瑞士)，BMP－15(PeproTech，美国)。
(1)取自2015年7至10月在浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心行IVF－ET的输卵管性因素或男方因素的不孕症患者，促排卵周期均为GnRH－a/FSH长方案，共70例，将同一天取卵患者的颗粒细胞混合作为1组用于试验，共取9组。(2)患者月经周期正常(28±7)d，排卵、内分泌功能无明显异常；排除卵巢多囊样改变、子宫肌瘤、子宫内膜异位症/子宫腺肌症等超声改变；排除发热、炎症、甲状腺、肾上腺相关疾病；无任何其他全身性内分泌、代谢性及肿瘤相关的疾病；所有患者均已签署知情同意书。(3)取卵日剥除的成熟卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞，4 h内提取原代细胞。经不含EDTA的0.25%的胰酶消化，2 000 r/min离心10 min，弃上清，所得卵丘颗粒细胞重悬成颗粒细胞悬液接种在直径3.5 cm的培养皿中培养24 h，消化细胞并重悬计数，按1.7×104/孔的细胞密度接种于24孔板上，共21孔，每组加样3个孔，每孔300 μl，分别加入DMEM/F－12培养液培养(对照组)，12 μg/L FSH(FSH组)、6 μg/L BMP－15(BMP－15组)、5%管性/男方因素不孕患者卵泡液(管性组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液(内异组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液＋12 μg/L FSH(内异＋FSH组)、5%内异症因素不孕患者卵泡液＋6 μg/L BMP－15(内异＋BMP－15组)的DMEM/F－12培养液培养，用加样器轻轻吹打溶液直至细胞悬浮均匀。将其置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h。
(1)管性组卵泡液：留取因男方因素不孕患者取卵日第一管无血液的清亮卵泡液2～4 ml，1 000 r/min离心10 min，过滤除菌，－80 ℃保存备用，共9例。(2)内异组卵泡液：留取子宫内膜异位症患者取卵日第一管无血液的清亮卵泡液2～4 ml，1 000 r/min离心10 min，过滤除菌，－80 ℃保存备用，共9例。
采用盖玻片培养法获得细胞爬片，经95%乙醇固定。采用免疫细胞化学染色方法，检测颗粒细胞的分子标志物α－Inhibin及CD99的表达。
(1)颗粒细胞培养48 h后留取上清液，同一组3个孔中的上清液合为一管，化学发光法测定孕酮水平；(2)吸去上清液的颗粒细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤贴壁细胞2次，弃去PBS。每孔加入不含EDTA的0.25%的胰酶150 μl消化，直至细胞消化成单个细胞，终止消化。经2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加培养液150 μl重悬细胞后用血球计数板计数每孔颗粒细胞，比较细胞生长速度。
应用SPSS 16统计软件，颗粒细胞计数及培养液孕酮水平均采用
±s表示，组间比较均采用两组独立样本t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
人卵巢颗粒细胞贴壁良好，细胞间明显可见延长的丝状突起相互连接。由图1可见，α－Inhibin受体定位于细胞质，阳性率为80%～85%；CD99受体定位于细胞膜和细胞质，阳性率为70%～80%。
由表1可见，与对照组比FSH组、内异组及内异＋BMP－15组细胞增殖差异有统计学意义，其他组差异无统计学意义。
各因素作用48 h后的细胞增殖情况(×107 /L，
±s)
各因素作用48 h后的细胞增殖情况(×107 /L，±s)
| 组别 | 例数 | 细胞数(×107/L) | P值 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 9 | 2.35±0.21 | － |
| FSH组 | 9 | 3.04±0.42 | 0.002a |
| BMP－15组 | 9 | 2.51±0.30 | － |
| 管性组 | 9 | 2.32±0.27 | － |
| 内异组 | 9 | 1.99±0.16 | 0.003a |
| 内异＋FSH组 | 9 | 2.30±0.18 | － |
| 内异＋BMP－15组 | 9 | 1.99±0.19 | 0.003a |
注：P值显示各组与对照组的差异统计学分析，其他组间差异无统计学意义，未显示P值；a表示与对照组比较
由表2可见，与对照组比较FSH组、管性组及内异组的颗粒细胞培养上清液孕酮水平显著升高，BMP－15无相应作用。内异组与管性组比，孕酮分泌降低；在内异组中加入FSH(内异＋FSH组)后，孕酮分泌水平比对照组及单纯内异组显著增加，加入BMP－15(内异＋ BMP－15组)后，孕酮分泌水平比对照组增加，与单纯内异组差异无统计学意义。
各因素作用48 h后培养上清液中孕酮的水平测定(μg/L，
±s)
各因素作用48 h后培养上清液中孕酮的水平测定(μg/L，±s)
| 组别 | 例数 | 孕酮 | P值 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 9 | 127.1±76.7 | － |
| FSH组 | 9 | 219.1±102.3 | 0.004a |
| BMP－15组 | 9 | 118.2±59.0 | － |
| 管性组 | 9 | 284.2±120.5 | 0.001a |
| 内异组 | 9 | 190.8±91.4 | 0.016a，0.001b |
| 内异＋FSH组 | 9 | 250.9±100.4 | 0.001a，0.012c |
| 内异＋BMP－15组 | 9 | 188.9±105.3 | 0.021a |
注：P值显示各组与对照组的差异统计学分析，其他组间差异无统计学意义，未显示P值；a与对照组比较；b与管性组比较；c与内异组比较
卵丘颗粒细胞在卵子成熟的过程中起着重要的作用，卵－丘复合体以卵泡液为生存的微环境，卵子质量、卵丘颗粒细胞功能与卵泡液的质量和成分有着密切的关系。本研究发现，内异症患者卵泡液有抑制颗粒细胞增殖及孕酮分泌作用。其原因可能为内异患者卵泡液中ENA－78、白细胞介素(IL)－6、－1、－8及肿瘤坏死因子(TNF)等多种炎性因子明显升高[6,7,8]，巨噬细胞、淋巴细胞、脂质过氧化物增多，T细胞的表达和分泌功能增强，单核细胞趋化蛋白(MCP)－1聚集，抑制氧化的维生素E减少[7,8,9,10]，导致颗粒细胞氧化应激增多从而使其增殖和分泌功能受到抑制[10]。此外，内异症患者卵泡液中TGF－β、TNF－α等升高[11,12]，也可能是导致颗粒细胞增殖及分泌功能抑制的原因。荟萃分析发现[13]，在ART周期中内异症患者结局较差，其受精率较非内异患者降低7%，说明内异患者卵子质量下降，其原因可能与内异患者卵泡液中这些相关因子的异常从而影响颗粒细胞的增殖与分泌功能进而影响颗粒细胞的质量，降低卵子质量相关。但是内异症患者卵泡液抑制颗粒细胞增殖及孕酮分泌的具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究。
FSH对颗粒细胞的增殖有促进作用[14,15]，本研究初步证实了FSH对体外培养人黄素化颗粒细胞的促增殖作用，并同时能改善内异症患者卵泡液对颗粒细胞增殖的负面作用。FSH促进颗粒细胞增殖的作用机制，可能通过PKA、PI－3K等多条信号通路网交叉沟通来实现[16], FSH可通过激活颗粒细胞上FSH受体偶联的G蛋白，激活腺苷酸环化酶，引起细胞内的cAMP升高，进而激活下PKA通路促进颗粒细胞的增殖。研究发现PKA抑制剂、MEK1/2抑制剂、p38MAPK抑制剂或PKC激活剂均可明显改变FSH对甾体激素生成的诱导作用，表明有多条信号通路参与颗粒细胞甾体生成的调控[16,17]。也有文献称[18]，PI3K通路在细胞周期中起主要作用，FSH促进颗粒细胞增殖是通过激活PI－3K和Smad2/3通路，从而作用于转录因子FOXO1，解除其对CyclinD2启动子的抑制作用，使细胞周期进行下去。但FSH对颗粒细胞的作用究竟是通过哪条信号通路起主导作用的目前尚待进一步研究。
el－Fouly等[19]在体外将兔成熟卵泡中的卵母细胞移除后，发现丘颗粒细胞自发地进行黄素化，孕酮的分泌增加。另有研究表明，体外将牛卵母细胞－卵丘复合物中的卵母细胞剥除后观察到，部分卵丘颗粒细胞向壁颗粒细胞表型转化，表现为细胞增殖能力明显下降，而甾体激素的生成显著升高[20]。本研究发现，加入FSH后颗粒细胞分泌孕酮增加，并且能逆转内异症患者卵泡液对颗粒细胞孕酮分泌的抑制作用。黄素化颗粒细胞在FSH作用下分泌孕酮增多一方面可能与其促进颗粒细胞增殖有关，另一方面可能与部分丘颗粒细胞向壁颗粒细胞转化有关。但FSH具体通过哪条通路促进丘颗粒细胞向壁颗粒细胞转化的，尚待进一步研究。
FSH可促进颗粒细胞增殖及促进其孕酮分泌作用，同时能改善内异症患者卵泡液对颗粒细胞的负向作用这一结果提示我们临床工作中可以采取促排卵治疗和IVF－ET改善内异症患者的生育能力，这与目前文献报道[21]的临床结局相一致并为此提供理论依据。
BMP－15来源于卵巢卵母细胞，是TGF－β基因超家族的成员，哺乳动物实验研究已证明，BMP－15对正常卵细胞发育及生殖功能均具有重要的影响[22]。鼠卵的研究发现卵母细胞中BMP－15的表达开始于始基卵泡向初级卵泡的转化阶段，并在卵泡发育过程中持续表达，直至排卵后12 h，这与FSH引起的卵泡生长、卵母细胞成熟一致，由此证明在促性腺激素诱导的卵泡发育过程中BMP－15参与了排卵前卵丘的扩展[23,24]。而已有动物实验表明，BMP－15推动哺乳动物体内卵母细胞卵泡生长，同时阻止黄体早熟[25]。BMP－15抑制FSH诱导的甾体激素合成快速调节蛋白、P450侧链裂解酶的表达和孕激素的合成，是黄体素化抑制物[26]。研究发现内异患者卵泡液中BMP－15蛋白的表达降低，卵丘颗粒细胞凋亡率增加。而对于人体排卵后黄素化颗粒细胞的影响，以及添加BMP－15后的内异患者卵泡液对颗粒细胞的影响目前尚无相关文献报道。本研究发现，BMP－15对颗粒细胞的增殖没有明显改变，与动物实验中发现的BMP－15促进颗粒细胞增殖明显相悖。分析原因，既往研究中均以卵泡期颗粒细胞为研究对象，BMP－15对卵泡期的颗粒细胞有促增殖作用；而本研究中的人颗粒细胞来自于排卵后，提示BMP－15对不同时期的颗粒细胞可能具有不同的作用方式。
总之，内异患者卵泡液抑制颗粒细胞增殖及孕酮分泌，从而影响卵子质量，这可能是其造成内异患者妊娠率及IVF－ET结局差的原因之一。临床上采取促排卵治疗或IVF－ET可提高内异症患者的妊娠率，这可能与FSH改善内异症患者卵泡液对颗粒细胞的负向作用有关。虽然ART可改善内异患者的结局，但是仍较非内异患者结局差，有待进一步研究内异患者卵泡液对颗粒细胞的作用机制，通过相关通路的阻断从而解除其抑制作用进而改善卵子质量进一步提高妊娠率。虽然BMP－15对黄素化颗粒细胞并无促进增殖及分泌功能的，并且对内异患者卵泡液对黄素化颗粒细胞的抑制无改善作用，但是在人体卵泡发育早期BMP－15是否可以促进颗粒细胞增殖及分泌功能并且是否可以改善内异患者的结局尚不明确，可以考虑取未为成熟卵卵丘颗粒细对BMP－15的作用方式进行研究。
