研究一个国内先天性双侧输精管缺如患病家系的囊性纤维化跨膜转导调节(CFTR)基因的突变基因型及遗传特征。
门诊收录因无精子症所致的不育症来就诊的两兄弟(33岁/29岁)，根据阴囊触诊、精液常规检查、阴囊及经直肠超声检查等诊断为先天性双侧输精管缺如，抽取该家系患者及双亲共4人的外周血样本，用试剂盒提取白细胞基因组，PCR法扩增CFTR基因上27个外显子及其侧翼序列并行Sanger测序，结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库在线比对。
基因测序筛查排除CFTR基因外显子区域无致病或可疑突变后，综合双向测序结果，在CFTR基因10号外显子前的剪切位点上的多T序列中发现患有先天性双侧输精管缺如的两兄弟相同的纯合5T突变(13TG-5T/12TG-5T)，2条5T等位基因分别源于父亲(12TG-5T/12TG-7T)和母亲(13TG-5T/11TG-7T)；家系图谱分析提示5T纯合突变与先天性双侧输精管缺如发病相关，带纯合5T等位基因的患者将致病基因传给后代的危险度约是正常人群的20倍。
CFTR基因上的5T突变是该患病家系中可遗传的致病基因位点，5T纯合突变可导致先天性双侧输精管缺如。从遗传咨询角度考虑，建议患病夫妻双方均行CFTR基因筛查并考虑胚胎植入前遗传学诊断。
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先天性双侧输精管缺如(CBAVD)是导致男性不育的重要病因。CBAVD在梗阻性无精子症中至少占6%，在男性不育症中占1%～2%[1]。目前研究认为，囊性纤维化跨膜转导(CFTR)基因突变是导致CBAVD的主要原因[2]。CFTR基因位于人类7号染色体长臂上(7q31.2)，全长188 704 bp，共有27个外显子，mRNA全长6 132 bp，编码一条1 480个氨基酸组成的肽链，命名为囊性纤维化跨膜转导调节因子，于1989年由Riordan等[3]首次定位克隆并鉴定，CFTR基因对于输精管道的成熟与发育过程中细胞膜氯离子通道起到重要的调节作用。本研究旨在通过对CBAVD合并无精子症的两个兄弟患者及双亲进行CFTR全外显子及侧翼序列基因突变检测，探讨该兄弟患者是否存在CFTR基因突变的病因基础，以及研究其致病遗传因素，进而探索CFTR基因的筛查指导意义。
2015年7月中山大学附属第三医院不育与性医学科门诊接诊诊断为无精子症的患者2例，为同父同母的两兄弟(先证者)，年龄分别为33/29岁，均在外院行精液分析发现无精子症，并于中山大学附属第三医院进行2次精液离心沉淀涂片未查找到精子确证(精液量约1.2 ml，精浆果糖测定低于正常水平)。阴囊触诊发现该2例患者都存在双侧输精管阴囊段缺如，阴囊超声及经直肠超声均提示双侧输精管阴囊段、盆腔段缺如，双侧附睾体部、尾部缺如，双侧精囊缺如或发育不良；双肾输尿管超声排除泌尿系畸形。正常睾丸体积和性激素水平提示他们都有正常的生精功能。考虑诊断为CBAVD所致的梗阻性无精子症。
因该兄弟患者表现出同样的生殖道缺如畸形，怀疑有家族性遗传因素，故对其55岁父亲及54岁母亲进行相似的临床检查，检查结果未发现明显的生殖系异常。本研究通过中山大学附属第三医院临床医学研究伦理审查，所有患者签署临床医学研究知情同意书。
抽取该兄弟患者及双亲的外周血2 ml置于EDTA抗凝管中，－80 ℃冰箱内保存。外周血DNA提取时恢复常温，使用德国凯杰公司(Qiagen)的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取白细胞中基因组DNA。DNA提取后，使用分光光度计测定DNA浓度，保留A260/A280值间于1.8～2.0之样品，于－20 ℃存放保存。
PCR扩增使用前期研究设计的CFTR基因全外显子引物27对[4]，PCR原料Taq酶和dNTP等购自上海博彩生物科技公司。PCR条件设置为：预热94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，保温72 ℃ 7 min。设置变性、退火、延伸循环次数为35次。采用琼脂糖电泳方式(电压100 V，时间30 min)验证PCR扩增产物。PCR产物浓度>30 ng/μl、条带清晰且无杂带的样品视为合格，送华大基因公司(BGI)进行Sanger法基因组测序，测序分析仪型号为3730XL，测序胶是POP7，荧光染料是Bigdye V3.1 Mix，均购自美国的AB公司(Applied Biosystems)。
使用Chromas软件对峰图进行读图分析，并采用Clustal X软件对测序结果与NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载序列作比对，参考HGMD数据库(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)筛查CFTR基因突变及基因型分析。
通过对测序结果的人工判读，基因测序筛查排除CFTR基因外显子区域无致病或可疑突变后，综合双向测序结果，在患病的两兄弟身上发现了CFTR基因10号外显子前的剪切区域上纯合的5T等位突变基因，并联合增多的TG重复序列(13TG-5T/12TG-5T)(图1，图2)，其中一条等位基因源于父亲(12TG-5T/12TG-7T)(图3)，另一条源于母亲(13TG-5T/11TG-7T)(图4)。家系4人的DNA样品中，均未发现外显子突变。
将遗传分析结果汇总到家系图(图5)，生育力正常的双亲(父：Ⅰ-1，母Ⅰ-2)均是5T突变的杂合子，而患有CBAVD的两兄弟(先证者，兄：Ⅱ-3，弟：Ⅱ-4)均遗传获得了双亲的致病等位基因，组合成纯合子，提示5T纯合突变与CBAVD发病相关。
CBAVD是囊性纤维化病(CF)在生殖系统的主要表现形式，CF病是高加索人种中最常见的致死性常染色体隐性遗传病，几乎所有CF患者都合并CBAVD[5]。两者都与CFTR基因突变相关，突变的严重程度和突变的等位基因组合形式与有功能的CFTR蛋白表达量相关[5]，导致不同严重程度的临床表现[6]，如：CF病，表现为高汗氯浓度，慢性肺、肝、胰腺疾病等[7]；CF相关障碍：可检测到CFTR基因突变，表现为慢性胰腺炎、CBAVD等[8]。统计研究指出，约78%的CBAVD患者能检测到CFTR基因突变，不同人种突变位点有所不同：国外高加索人种突变率最高的热点位点是F508del(约占22%)，而在我国汉族人群中热点位点为5T突变(约占31%)[9]。Chilln等[1]对102个高加索人种CBAVD患者行CFTR基因筛查，提出一条等位基因上的5T突变与另一条等位基因上的严重CF突变或者5T突变组合是导致CBAVD的最常见突变基因型(33.3%)。而我们对CBAVD患者筛查的统计中发现5T等位基因频率约为34.7%，与Li等[10]统计相近(34.2%)；5T纯合突变的基因型相对高加索人种比例较多(20.4%)。
Chu等[11]在CF患者的CFTR基因研究中，通过逆转录、产物序列分析等技术对在气管上皮细胞提取的mRNA进行分析，发现与对照相比10号外显子存在不同程度的转录缺失，会在一定程度上影响CFTR蛋白的功能。他们进一步基因研究指出，10号外显子前的多T序列常见的有9T、7T、5T，转录过程中10号外显子的剪切效率随着多T序列的缩短而减小。9T与剪切位点的高效结合相关，可使10号外显子被正常剪切；而5T突变会导致大量10号外显子剪切失效，从而产生大量的不成熟、无功能的CFTR蛋白[12]。Disset等[13]发现1例罕见的3T突变，功能学实验验证其导致更大程度的10号外显子缺失，符合前述的理论。与多T序列紧接的上游TG重复序列对多T序列的外显有影响，TG重复数越多，多T序列外显率越高，与正常人群相比，13TG/5T和12TG/5T更多见于CBAVD患者中[14]。
在高加索普通人群中，CFTR基因5T突变率约为5.2%，而在CBAVD人群中突变率显著更高[1]。我们在中国汉族普通男性人群的统计中发现，5T突变率约为5.0%，与高加索人群相近，且未在正常人群中发现纯合5T等位基因。根据美国医学遗传学和基因组大学(ACMG)与美国分子病理学会(AMP)推荐的序列变异解读标准与指南联合共识[15]，上述的功能学验证、显著高于正常人群的基因突变率、家系遗传特征等提示纯合5T突变有强致病性，我们认为它是该家族性CBAVD的致病基因位点。
随着人类辅助生殖技术(ART)的不断发展，CBAVD患者有生育下一代的可能，然而，却有可能将致病基因遗传给下一代。我们发现的这个CBAVD家系遗传特征符合孟德尔隐性遗传规律，提示5T突变的携带者双亲理论上有1/4概率产生纯合5T突变的可致CBAVD的后代。我们估算，假设普通人群(不分男女)的5T突变率约为5.0%，一个有生育需求的CBAVD患者，如果经CFTR基因筛查发现为5T纯合突变，那么它将致病基因传给后代的危险度是普通人群的20倍，所以我们建议这些夫妻均行CFTR基因筛查并考虑胚胎植入前遗传学诊断(PGD)[16,17]。目前，在美国及一些欧洲国家，CFTR基因突变检测已应用于辅助生殖前的遗传学筛查[18]，而在我国，因对CFTR基因的研究深度和广度不足，相关筛查项目尚未广泛开展。有不少文献对CBAVD患者经ART生育的后代行基因测序显示其携带包括5T等突变的CFTR基因，即患者小孩可能将成为CBAVD的患者或携带者[18,19]。此外，Lu等[20]一项对实施ART生殖的945名无精子症患者的研究中发现，CBAVD患者携带CFTR突变基因的，其辅助生殖生育的下一代中有更高概率出现流产或死胎。在我们的CBAVD患者群中，2例患者就诊前曾行ART辅助生殖，均在胚胎发育过程中出现停育的情况，患者行CFTR基因筛查也发现带有突变基因。我们认为，将CFTR基因突变筛查加入我国PGD检查项目，对CBAVD患者生育健康下一代具有相当的临床意义。
综上所述，本研究报道了国内一例CBAVD家系并进行了遗传学分析，结合文献，我们认为CFTR基因上的5T突变是该患病家系中可遗传的致病基因位点，5T纯合突变可导致CBAVD；带纯合5T等位基因的患者将致病基因传给后代的危险度约是正常人群的20倍，夫妻双方检测CFTR基因突变有利于使患者行辅助生殖前将致病基因筛选出来，降低患者下一代罹患CBAVD的风险，对优生优育工作有重要帮助。我们将进一步随访跟踪这对兄弟患者的ART进展，扩大该家系的研究，观察CFTR基因对下一代的影响。
