探讨胶质瘤干细胞(GSC)诱导TME中多种间质细胞的恶性转化及其相关分子特征。
将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染人SU3－RFP的GSC与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因裸小鼠间质细胞体外共培养，将SU3－RFP细胞接种于EFGP－Balb/c裸小鼠不同部位，从体外培养基与体内肿瘤组织中分别单克隆具永生化特征的EGFP＋细胞，经染色体分析和致瘤试验证实其具有肿瘤细胞特征，再以RT－PCR、流式细胞术和细胞免疫化学染色等分子手段检测相关分子表型。
(1)体外培养共得到2株EGFP＋细胞系，体内致瘤实验共得到5株EGFP＋细胞系，所克隆的7株EGFP＋细胞具自我更新、呈异倍体染色体核型和100%致瘤率；(2)根据细胞标志物表达状况鉴定其分别起源于巨噬细胞(tMΦ1和tMΦ2)、树突状细胞(tDC1和tDC2)、成纤维细胞(tFB)、少突胶质细胞(tOG)和骨髓间充质干细胞(tBMSC)；(3)根据七株细胞共同表达Sca－1(髓源性干细胞标志物)和c－myc，分别表达Sox2、Nanog等诱导性多能干细胞(iPS)标志物，确定这些恶性转化细胞不同程度上兼具髓源干细胞和iPS细胞的分子特征。
(1)TME中肿瘤间质细胞自身恶变与GSC对TME组织重构相关，与其寄生地组织类型关系不大；(2)源于GSC的肿瘤细胞和GSC TME中恶变的间质细胞，是GSC重构的肿瘤组织内两大类不同起源的肿瘤细胞，由此构成广义肿瘤异质性概念的细胞学基础，后者有潜力作为靶向诊疗的新靶标。
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肿瘤干细胞(TSC)研究经历了克隆和鉴定、初步证实其在多种肿瘤广泛存在、并认定其与肿瘤发生、恶性进展、复发、放化疗耐受等生物学特性高度相关后，目前正进入TSC功能和靶向治疗研究阶段，但TSC在肿瘤组织重构进程中的许多生物学特征尚未完全阐明。国内我们很早就从人脑胶质瘤体外细胞系SHG44和临床标本中克隆、鉴定和建立了胶质瘤干细胞(GSC)株SHG44s[1]、SU1、SU2[2]、SU3及SU4[3]，除了见到了GSC必备的自我更新、多向分化、高致瘤和高侵袭等特征，还发现其诸多新生物学特征，即GSC分化后的下游细胞不能终末分化、还具备重新逆分化为GSC潜能[4] ，在重构TME进程中有转分化拟态构筑有功能的肿瘤血管能力[5]等。本文着重于GSC诱导TME中多种间质细胞的恶性转化及其相关分子特征。
EGFP转基因Balb/c裸鼠，6周龄、体质量20～24 g、饲育于无特殊病原体(SPF)的小鼠独立送风系统(IVC)内和人胶质瘤干细胞RFP稳定转染细胞株SU3－RFP均为本实验室自建。细胞培养基DMEM/F12、胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品。细胞生长因子EGF、bFGF、B27、N2等购于Gibco公司。抗Sca－1小鼠单克隆抗体为BD公司产品。3－BrPA购于Sigma公司。Sox2、Nanog、CD133、F4/80、Sca－1、c－myc等基因扩增引物由苏州金唯智公司合成。细胞培养箱为日本SANYO公司产品，倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品，流式细胞仪为美国Beckman公司产品。
(1)体外共培养：将人GSC SU3－RFP按照1∶50的比例，分别与源于EGFP－Balb/c裸小鼠的原代巨噬细胞(MΦ)、树突状细胞(DC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)及少突胶质细胞(OG)、成纤维细胞(FB)体外共培养，显微镜下动态观察细胞生长状况及形态改变，并以显微虹吸法单克隆高增殖力的EGFP＋细胞。作为实验对照，将原代正常人星形胶质细胞(HA)(北京北纳生物公司)亦按照1∶50的比例，分别与EGFP＋裸小鼠的原代细胞体外共培养，动态观察细胞生长状况及形态改变。(2)体内：5×105个SU3－RFP细胞分别于EGFP－Balb/c裸小鼠的脑、皮下、腹腔、肝脏等多部位接种，致瘤后取移植瘤组织制备单细胞悬液于含FBS的DMEM培养液中再培养，从中克隆增殖力强的EGFP＋细胞，并连续传代，获得永生化细胞后建株并分析相关生物学特征。然后将其转移到含生长因子、无FBS的干细胞条件培养基中培养，观察细胞形态、增殖及干性特征。
对7株所克隆的高增殖力EGFP＋细胞分别行染色体G显带分析，并参照试剂盒说明书以免疫组化/免疫荧光法检测相关细胞标志蛋白F4/80、SIRP－α、CD11c、FAP－α、CNP、CD29、CD44、CD90、CD105等，CCK8法测定增殖曲线，以流式细胞术检测细胞周期和髓源干细胞比例。
总RNA提取使用RNAprepPureCell/Bacteria Kit，反向转录使用Quantscript逆转录试剂盒，按说明书实验。cDNA合成使用SYBR@ Premix Ex Taq™ II Kit。反应条件为95 ℃ 5 s, 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环。内参为甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)。对检测数据进行相对定量分析。
将上述7株恶性转化的细胞，以5×106个细胞/鼠，皮下接种于6周龄体质量20～24 g的Balb/c裸小鼠前肢腋下，每种细胞接种10只鼠，按SPF级要求管理，接种1个月后取肿瘤组织做组织病理学检测。
取荷瘤鼠双侧股骨，以PBS冲洗骨髓腔，所得冲洗液1 000 r/min离5 min后弃上清，加入红细胞裂解液1 ml，吹打混匀，然后加入1 ml DMEM培养基，1 000 r/min再次离心5 min ，弃上清后PBS清洗2次，将细胞悬液分成3份：(1)不加抗体，作为空白对照；(2)加PE标记的抗小鼠单抗CD11b；(3)加FITC标记的抗小鼠单抗Gr－1；于流式细胞仪检测CD11b和Gr－1双阳性细胞。
SU3－RFP细胞在EGFP裸鼠体内不同部位生成的移植瘤组织再培养及体外SU3－RFP与EGFP鼠间质细胞共培养过程中，以显微虹吸法单克隆到7株高增殖力EGFP＋细胞(体外克隆到2株，体内5株)，连续传代培养最终获得永生化细胞，在倒置荧光显微镜下均能观察到细胞发出均匀绿色荧光；染色体核型G显带分析结果显示：全部符合鼠端着丝粒特征，提示其源于EGFP荧光鼠，还兼具异倍染色体(大部分是超4倍体)等符合肿瘤细胞特征的生物学表型，tDC仍然保留正常DC的典型多突起样结构(表1)。人原代正常星形胶质细胞分别与EGFP＋裸小鼠各类间质细胞共培养过程中，未观察到高增殖力的EGFP＋细胞。根据细胞标志物免疫组化或免疫荧光染色结果，这7株细胞分别为：(1)体内恶性转化的巨噬细胞－tMΦ1 (SU3－RFP腹腔移植诱导巨噬细胞恶性转化)，表达成熟小鼠巨噬细胞标志物F4/80；(2)体外恶性转化的巨噬细胞－tMΦ2(SU3－RFP与EGFP＋小鼠MΦ体外共培养诱导F4/80＋巨噬细胞转化)；(3)体内恶性转化的树突状细胞－tDC1(SU3－RFP肝脏移植诱导树突状细胞转化)，表达成熟小鼠树突状细胞标志物CD11c、SIRPα；(4)体外恶性转化的树突状细胞－tDC2(SU3－RFP与EGFP＋小鼠DC体外共培养诱导表达CD11c、SIRPα的树突状细胞转化)；(5)体内恶性转化的少突胶质细胞－tOG(SU3－RFP脑内接种诱导少突胶质细胞转化)，表达成熟小鼠少突胶质细胞标志物CNP；(6)体内恶性转化的成纤维细胞－tFB(SU3－RFP皮下接种诱导成纤维细胞转化)，表达小鼠成纤维细胞标志物FAPα；(7)体内恶性转化的骨髓间充质干细胞－tBMSC(SU3－RFP及EGFP＋鼠的BMSC联合移植骨髓毁损重建Balb/c裸鼠后，移植瘤内克隆的恶性转化的EGFP＋BMSC),表达小鼠BMSC标志物CD29、CD44、CD90、CD105(图1)。
SU3－RFP胶质瘤干细胞诱导的7株恶性转化间质细胞倒置显微镜下和染色体核型分析所见
SU3－RFP胶质瘤干细胞诱导的7株恶性转化间质细胞倒置显微镜下和染色体核型分析所见
| 共培养 | MΦ | DC | FB | OG | BMSC |
|---|---|---|---|---|---|
| 体内实验 | tMΦ1 | tDC1 | tFB | tOG | tBMSC |
| 体外实验 | tMΦ2 | tDC2 | － | － | － |
| 染色体核型 | 超四倍体 | 超四倍体 | 超四倍体 | 超四倍体 | 超四倍体 |
| 染色体种属 | 鼠 | 鼠 | 鼠 | 鼠 | 鼠 |
| EGFP荧光 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
根据CCK－8法检测所得细胞增殖曲线显示，SU3－RFP肿瘤微环境中7株已发生恶性转化的间质细胞均具有强增殖能力(图2)。在干细胞培养条件下，7株细胞均可呈干细胞球样生长(图3)。RT－PCR检测髓源性干细胞标志分子Sca－1和致癌基因c－myc在7株恶转化细胞中的表达均为阳性，成熟小鼠巨噬细胞标志物F4/80在tMΦ1、tMΦ2两株细胞表达(表2)；流式细胞术检测七株恶性转化细胞的Sca－1蛋白表达阳性细胞的比例由高到低分别是tFB 96.8%、tOG 96.5%、tMΦ2 96.2%、tMΦ1 88.9%、tDC1 88.7%、tBMSC 74.8%及tDC2 22.3%。所检测的tDC1、在干细胞培养条件下逆分化为干细胞球样生长的tDC1(rd－tDC1)，tMΦ1和tDC2四株细胞中，仅有SOX－2单个iPS细胞标志物与Sca－1一样呈阳性表达，而OTC4和Nanog仅在tMΦ1细胞高表达，神经干细胞标志蛋白CD133在tDC2、tMΦ1、tDC1、rd－tDC1这四株细胞中都未见表达(表3)，tOG细胞未检出CD133表达，可能与其在含血清(促分化)条件下培养相关。在接种tDC1细胞的荷瘤鼠骨髓冲洗液中，MDSC标志蛋白CD11b阳性细胞占83.69%、Gr－1阳性细胞占58.12%，双阳性细胞的比例高达43.81%。
RT－PCR检测七株恶性转化间质细胞的F4/80、Sca－1和c－myc基因表达
RT－PCR检测七株恶性转化间质细胞的F4/80、Sca－1和c－myc基因表达
| tMΦ1 | tDC1 | tFB | tOG | tBMSC | tMΦ2 | tDC2 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| F4/80 | ＋＋ | ＋ | － | － | － | ＋＋ | ＋ |
| Sca－1 | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ |
| c－myc | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ |
注：＋＋阳性，＋弱阳性，－阴性
RT－PCR检测tDC1、rd－tDC1、tMΦ1和tDC2的Nanog、CD133、OCT4、Sox－2和Sca－1的mRNA表达水平
RT－PCR检测tDC1、rd－tDC1、tMΦ1和tDC2的Nanog、CD133、OCT4、Sox－2和Sca－1的mRNA表达水平
| tDC1 | rd－tDC1 | tMΦ1 | tDC2 | |
|---|---|---|---|---|
| Nanog | － | － | ＋＋ | － |
| CD133 | － | － | － | － |
| OCT4 | － | － | ＋＋ | － |
| Sox－2 | ＋＋ | ＋ | ＋ | ＋＋ |
| Sca－1 | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ |
注：＋＋阳性，＋弱阳性，－阴性
7株恶性转化细胞接种于裸小鼠皮下，1周后所有实验鼠可在接种处皮下扪及肿瘤结节，10 d后可用游标卡尺测量出肿瘤结节的长、短径，连续测量后可绘制出包括缓慢生长期，快速生长期和平台期的新生物增殖曲线。接种鼠的生存期一般为12～16周，皮下肿瘤在光学显微镜下所见到的组织和细胞学形态符合恶性肿瘤的特征，7株恶性转化间质细胞的致瘤比例均为10/10。
1．GSC微环境中的间质细胞为何恶变？恶性转化是发生在肿瘤微环境内部，还是肿瘤微环境之外？根据Park等[6]报道，胶质瘤肿瘤微环境中存在多种免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等，还有胶质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞，本研究7株恶变间质细胞的类别亦属于上述范畴。这些细胞发生恶性转化的始动因素还是GSC，后者为了生存和发展，充分对其所寄居地周围的宿主细胞进行改造并加以利用(组织重构)[7]，凡能为己所用者均可称之为肿瘤相关细胞，如文献报道较多的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)[8]和肿瘤相关成纤维细胞(TAF)[9]等。前者属于天然免疫细胞，在到达肿瘤微环境前，甚至到达肿瘤微环境的早期仍保留程度不一的免疫识别或应答能力，进入肿瘤微环境一段时间后，M1型巨噬细胞及促瘤性M2型巨噬细胞同时存在，在肿瘤不同的发生发展时间所占比例不同，肿瘤进展时M2型为主，肿瘤在干预措施下缩小时，二者同时减少，但M1型所占比例增加。据此推论巨噬细胞恶变过程应发生在肿瘤微环境内。据报道，包括胶质瘤在内的恶性肿瘤患者骨髓、外周血和肿瘤组织中都存在髓源性免疫抑制细胞(MDSC)[10]，后者包含未成熟的粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和树突状细胞等多种细胞。由此可见，如果tMΦ1、tMΦ2、tDC1和tDC2归类于MDSC的话，其恶性转化的分子启动阶段在肿瘤微环境发生后可通过胶质瘤干细胞旁分泌机制远距离调控肿瘤微环境之外的免疫细胞，从而影响机体的全身免疫功能。另一可能性是肿瘤微环境内恶性转化的间质细胞也有可能来自间充质干细胞(MSC)，后者是一类异质性显著的干祖细胞，在机体各部位广泛存在，源于骨髓的MSC(BM－MSC)可向肿瘤迁移[11,12,13]。以EGFP鼠的骨髓冲洗细胞输注辐照毁损骨髓的无荧光裸鼠，重建骨髓功能后，相关实验结果显示GFP＋的BM－MSC被招募到肿瘤微环境内[14]，这与本文报道的tBMSC的情况相似。另外，BM－MSC进入肿瘤微环境内可转化为肿瘤相关MSC(TA－MSC)，并能使肿瘤微环境产生永久性变化[15]。这种变化不仅是起促进肿瘤生长作用，而且其自身也可发生恶性转化[16]，本结果与文献报道相符。TA－MSC和BM－MSC都可进一步进展为肿瘤相关成纤维细胞(CAF)[17]，本实验中所克隆到的tFB亦可来自于CAF。非可控性炎症(NRI)细胞，与MDSC的关系特别密切，存在互相调控的分子通路[18]。
2．肿瘤微环境内间质细胞恶变的细胞分子调控：综上所述，如果恶变的免疫相关细胞来自MDSC，其调控机制涉及到髓源性造血干细胞(MDPSC)分化成MDSC这样一个由GSC诱导的病理生理过程。在肿瘤来源的造血干细胞分化因子特别是G－CSF或GM－CSF刺激下，可使MDSC大量扩增[19]，并创建了一个有利于GSC发挥多种新功能的环境。在小鼠模型中共表达标志物CD11b和Gr－1，可用于鉴定MDSC[20]。MDSC进入肿瘤微环境后可分化为包括TAM在内的多种免疫相关细胞，包括MΦ、DC以及淋巴细胞等。肿瘤浸润性MDSC是一种独特的炎症单核细胞/巨噬细胞，包括M1和M2型在内，因其同时表达M1型标志物iNOS、IL－1、TNF－α、CXCL10和M2型标志物CD206、CD36，并且通过TGF－β自分泌调节它们之间的互相转化[21]。在干细胞条件下培养，tMΦ2细胞球较tMΦ1大，形态接近球形，提示其干性较强。细胞增殖曲线显示，tMΦ1增殖较tMΦ2快。二者均表达鼠MΦ标志物F4/80以及髓源性干细胞标志物SCa－1，且二者癌基因c－myc表达水平均升高，提示其可能为参与MΦ恶性转化的分子机制，值得进一步研究。至于tMΦ1及tMΦ2是否为肿瘤微环境中的M1或M2型MΦ，尚需进行多个相关基因标志物的检测才能确认。
如果恶变的间质细胞来自MSC，其细胞分子调控首先涉及到BM－MSC是如何转化成TA－MSC的问题。BM－MSC与TA－MSC共培养能使BM－MSC获得类似于TA－MSC的促肿瘤生长潜能，提示一些旁分泌因子可以将BM－MSC向TA－MSC转化。在荷瘤小鼠模型中TNFα作用后的BM－MSC在产生趋化因子和促肿瘤生长方面酷似TA－MSC[11]，表明通过细胞－细胞接触或旁分泌作用，肿瘤细胞能使MSC在肿瘤微环境中演变为TA－MSC[11,12]。本研究tDC1、tDC2和tMΦ1、tMΦ2正是分别从体内和体外实验获得的，所发生的细胞分子调控有可能与之类似。
胶质瘤微环境中除了存在大量星形细胞和小胶质细胞外[22]，还有数量不等的少突胶质细胞(OG)或少突前体细胞(OPC)参与肿瘤微环境重构，这类少突来源的细胞成分在胶质瘤发生、进展过程中究竟发挥着何种作用及作用机制，目前研究甚少。转染PDGF－B基因的胶质瘤细胞系小鼠原位移植瘤组织中存在大量OPC及OG[23]，提示PDGF－B具有招募表达PDGFR－α的OPC能力；而转染PDGF－B基因的OPC细胞移植到小鼠体内能够恶性转化，进而形成少突胶质瘤细胞瘤。上述发现提示，PDGF－B及其受体在诱导神经前体细胞恶性转化过程中发挥着至关重要的作用。本实验前期工作发现，本实验室自建的人脑GSC系SU3自身稳定高表达PDGF－B，基于双色荧光示踪裸小鼠原位移植瘤模型，发现SU3细胞裸小鼠颅内移植瘤组织中存在大量表达GFP的宿主细胞，进一步体外分离、筛选获得两株表达OPC标志物(PDGFR－α、NG2)的恶变宿主细胞。
值得一提的是肿瘤微环境中的MSC与炎性免疫细胞存在互相促进关系，在后者分泌的IFN－γ、TNF和IL－1等炎性细胞因子作用下MSC的应答反应是产生TGF－β、趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11，以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和吲哚胺2，3－二氧化酶(IDO)[24]，MSC产生的趋化因子吸引更多的免疫细胞，来接受MSC高表达的iNOS和IDO调控，使其免疫功能进一步受到抑制。实际上这种互动作用还与肿瘤微环境的状态有关，因为肿瘤的免疫反应会随着肿瘤微环境的类型和炎症介质浓度的波动发生改变。IFN－γ、IL－17a和TGF－β已证明能依赖于特定的肿瘤微环境促进或抑制肿瘤的进展或转移，而这种情况又与前述的MDSC和非可控性炎症相关联。但这些复杂的不同的分子调控网络间相互作用及影响机制在很大程度上目前尚未完全阐明，需要用高通量、大数据分子生物学分析技术继续深入探索。
