探讨一氧化氮（NO）在外源性硫化氢（H2S）抑制大鼠结肠动力中的作用。
免疫组化检测H2S合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚-β-合成酶（CBS）在成年Wistar大鼠近端结肠的分布；制备近端结肠纵行肌（LM）和环形肌条（CM），通过恒温浴槽实验观察NO相关工具药干预后外源性H2S供体硫氢化钠（NaHS）对LM和CM收缩活动的影响；通过膜片钳实验检测不同浓度NaHS对平滑肌细胞L型钙通道电流（ICa，L）的影响。
H2S合成酶CBS和CSE在近端结肠肌间神经丛、黏膜层及环纵平滑肌细胞均表达。河豚毒素孵育肌条后NaHS以浓度依赖的方式抑制LM和CM自发性收缩活动，LM最大抑制的半数有效浓度（IC50）为917.6 μmol/L（95% CI：776.3~1 085 μmol/L，n=6），CM的IC50为730.4 μmol/L（95% CI：592.2~900.8 μmol/L，n=6）。NO供体硝普钠（SNP）预处理肌条后加入NaHS（3×10-4~6×10-4mol/L），LM及CM收缩幅度呈现双向变化，其中低浓度NaHS使LM收缩幅度从（0.679±0.181）g增加至（0.840±0.400）g（n=8，P<0.01），使CM收缩幅度从（0.378±0.140）g增加至（1.176.±0.056）g（n=8，P<0.01）。sGC抑制剂可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂（sGC）ODQ孵育组NaHS的IC50高于对照组（P<0.05），而NO合成酶抑制剂L-NNA、NO前体L-精氨酸、环磷酸鸟苷（cGMP）竞争性拮抗剂PET-cGMP预处理肌条前后NaHS的IC50差异无统计学意义（P>0.05）。NaHS（100 μmol/L）使L型钙通道峰电流密度增加[（-4.29±0.29）比（-3.77±0.27）pA/pF，P<0.01]；而NaHS（300 μmol/L）使峰电流降低至（-2.96±0.34）pA/pF（P<0.05），并使电流-电压曲线右移。
外源性H2S对大鼠结肠动力可能具有双重调节作用，其中对结肠平滑肌的抑制作用不依赖NO；L型钙通道在H2S对结肠动力的双重调节作用中发挥重要作用。
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消化道组织表达内源性硫化氢（H2S）合成酶，主要为胱硫醚-β-合成酶（CBS）和酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）[1]。CBS和CSE可催化底物L-半胱氨酸生成H2S。H2S作为继一氧化氮（NO）、一氧化碳之后发现的第三种气体信号分子，已被证实可通过旁分泌方式迅速弥散并穿透细胞膜进而发挥多种生物学功能，包括抑制胃肠道动力[2,3,4]。然而，H2S抑制肠道动力的具体机制仍未完全明确。目前研究发现ATP敏感性钾通道（KATP），蜂毒明肽敏感的小电导钾通道（SK）等离子通道参与H2S对肠道的抑制作用[3,4]。NO作为肠道重要的抑制性神经递质，可通过激活鸟苷酸环化酶（GC），生成环磷酸鸟苷（cGMP）从而抑制平滑肌收缩[5]。有研究报道H2S可抑制磷酸二酯酶的活性，增加cGMP水平[6]。然而NO信号系统是否参与H2S对结肠收缩的抑制作用，目前尚无相关研究报道。本研究拟通过观察NO相关工具药干预后外源性H2S对大鼠结肠动力的改变，以明确NO信号系统是否参与H2S对结肠收缩的抑制作用，并探讨可能的作用机制。
清洁级雄性成年Wistar大鼠40只，体质量180~200 g，购自西安交通大学实验动物中心。饲养温度（23±0.5）℃，湿度65%~66%，自由饮食进水。动物实验方案获得西安交通大学第二附属医院医学伦理委员会批准。
（1）台式液（mmol/L）：氯化钾（KCl）4.0，氯化钠（NaCl）147.0，氯化钙2.0，磷酸二氢钠0.42，磷酸氢二钠2.0，氯化镁（MgCl2）1.05，葡萄糖5.5[以氢氧化钠（NaOH）调pH值至7.4]；（2）无钙生理盐溶液（PSS）（mmol/L）：NaCl 135.0，KCl 5.0，MgCl2 1.2，葡萄糖10.0，羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）10.0（以NaOH调pH值至7.4）；（3）L-型钙通道电极内液（mmol/L）：氯化铯135，MgCl2 4，HEPES 10，无水磷酸肌酸二钠盐2，乙二醇-双-（2-氨基乙醚）四乙酸10，四乙胺20（以氢氧化铯调pH至7.3）；（4）细胞消化液（质量/体积）：Ⅱ型胶原酶0.15%、胰蛋白抑制剂0.1%、牛血清白蛋白0.25%。
H2S供体硫氢化钠（NaHS）、河豚毒素（TTX）、NO前体L-精氨酸、NO供体硝普钠（SNP）、NO合酶抑制剂L-NNA、可溶性GC（sGC）抑制剂ODQ、cGMP竞争性拮抗剂（PET-cGMP）直接溶于台式液中配制母液。Ⅱ型胶原酶和牛血清白蛋白、胰蛋白抑制剂直接溶于无钙PSS制备细胞消化液。Ⅱ型胶原酶购自Gibico公司，胰蛋白抑制剂购自Amresco公司，CBS多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，美国），CSE多克隆抗体购自Abcam（Abcam Ltd.，香港），GAPDH购自CST公司，余试剂均购自Sigma公司。
断椎处死大鼠后取近端结肠约0.5 cm置于氧饱和的台式液中，剪去肠系膜，清洗肠内容物后立即置于含4%甲醛溶液中固定过夜。将固定的肠道标本依次用浓度递增的乙醇脱水，石蜡包埋，将石蜡块连续切4 μm的切片备用。切片经过二甲苯以及浓度递减乙醇溶液，用枸橼酸盐缓冲液修复组织抗原，经过用羊血清封闭后加兔抗鼠多克隆抗CBS（1∶250）和抗CSE抗体（1∶500）4 ℃过夜。冲洗一抗后加二抗在37 ℃孵育30 min，随后加DAB显色液在显微镜下观察玻片以控制反应时间，显色后冲洗玻片再用苏木素-伊红染色、脱水、干燥以及透明后中性树脂封片，显微镜下观察。
断椎处死大鼠后迅速取出约3 cm近端结肠置于氧饱和台式液中，沿肠系膜剪开肠管，清洗肠内容物，在解剖显微镜下剪去肠系膜，分别沿肠管纵轴及横轴方向制备纵行肌（LM）和环形肌（CM），大小约3 mm×10 mm。肌条一端系于肌槽底部，另一端连接张力换能器将信号传导至RM6240多通道生理信号采集处理系统。肌槽容积为6 ml，LM前负荷1.5 g，CM前负荷1.0 g，平衡1 h待肌条自发行收缩活动稳定后记录不同工具药物干预前后LM和CM收缩改变。
断椎处死大鼠后迅速取出近端结肠至于无钙PSS中，在正置显微镜下轻轻剪去肠系膜，沿系膜方向剪开肠管，清洗肠内容物，将黏膜面朝上固定于道康宁胶板上，剥离黏膜及黏膜下层，将肌层剪至2 mm×2 mm的组织块，置于37℃的消化液中消化15 min，然后分次取适量组织块置于含有氧饱和无钙PSS的EP管中冲洗3次，置于4℃冰箱保存，6~8 h内使用。实验前用巴氏吸管吹打组织块制备细胞悬液。将悬液滴于倒置显微镜上方的浴槽中，待细胞完全贴壁后用氧饱和台式液灌流（1ml/min）10 min。制备电阻为7MΩ的电极（P-97，美国Sutter公司），在显微镜下选择形态光滑、折光性好的细胞进行高阻（GΩ）封接，补偿电极电容后负压吸引破膜，形成全细胞记录模式。采用Axon700B放大器及pClamp10.2软件采集平滑肌细胞L型钙通道电流（ICa，L）。因ICa，L在记录最初5 min内及20 min后衰减严重，所以严格控制加药时间在电流记录开始后5~15 min内。
采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.01软件进行数据统计与分析，结果以均数±标准误表示。采用S型剂量反应曲线（可变斜率）进行曲线拟合计算最大抑制的半数有效浓度（IC50）。NaHS对L型钙通道激活和失活曲线由Boltzmann方程拟合而成。激活曲线方程为G/Gmax=1/[1+exp（VT-V1/2/κ）]，I/Imax代替G/Gmax（电导/最大电导），I/Imax为峰电流/最大峰电流，VT为测试电压，V1/2为半数激活电压。失活曲线方程为I/Imax=1/[1+exp（VT-V1/2/κ）]，VT为条件脉冲下的去极化电压，V1/2为半数失活电压，κ为斜率因子。自身比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
如图1A所示，CSE在肠神经丛、黏膜上皮细胞高表达；此外，CSE亦表达于纵行及环形平滑肌细胞的胞质。CBS在近端结肠的分布与CSE相似，肠神经丛、黏膜上皮细胞及平滑肌层均有表达（图1B）。而且CSE和CBS亦表达于黏膜下层的毛细血管上皮细胞。如图1C和图1D所示，TTX孵育后，NaHS（1×10-4~2×10-3mol/L）浓度依赖性抑制LM和CM自发性收缩活动，LM的IC50为917.6 μmol/L （95% CI：776.3~1 085 μmol/L，n=6），CM的IC50为730.4 μmol/L（95% CI：592.2~900.8 μmol/L，n=6）。
注：A：CSE在近端结肠的分布（苏木素-伊红染色×200）；B：CBS在近端结肠的分布（苏木素-伊红染色×200）；C：河豚毒素（TTX）孵育后NaHS对结肠纵行（LM）和环形（CM）肌自发性收缩活动的影响；D：LM和CM加入NaHS后的剂量依赖拟合曲线
SNP（10 nmol/L）预处理显著降低LM和CM肌条收缩幅度，LM收缩幅度由（1.039±0.121）g降低至（0.679±0.181）g（n=8，P<0.01），CM收缩幅度由（1.151±0.236）g降低至（0.378±0.140）g（n=8，P<0.01）；同时SNP降低CM基础张力至（-0.058±0.018）g（P<0.01）。加入NaHS（3×10-4~6×10-4mol/L）后LM及CM收缩幅度呈现双向变化。低浓度NaHS使LM收缩幅度增加至（0.84±0.4）g（P<0.01），使CM收缩幅度增加至（1.176.±0.056）g（P<0.01）；而高浓度NaHS使LM和CM收缩幅度显著下降，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）（图2A）。
注：A：NO供体硝普钠（SNP）孵育对NaHS抑制大鼠近端结肠平滑肌收缩的影响；B：NO合成酶抑制剂（L-NNA）孵育对NaHS抑制大鼠近端结肠平滑肌收缩的影响；C：NO前体L-精氨酸（L-Arginine）孵育对NaHS抑制大鼠近端结肠平滑肌收缩的影响.（与SNP组，L-NNA组，L-Arginine组比较，aP<0.05，bP<0.01，n=8）
L-NNA（1μmol/L）预处理阻断NO的合成，LM和CM肌条收缩幅度显著增加。加入NaHS（3×10-4~6×10-4 mol/L），LM的收缩幅度呈现双向改变，而CM收缩幅度单向被抑制。NaHS使LM收缩幅度短暂增加至（1.441±0.172）g（n=8，P<0.05），随后分别降低至（1.086±0.151）g（P<0.05），（0.692±0.115）g（P<0.01），（0.268±0.890）g，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）（图2B）。
NO前体L-arginine孵育肌条后LM和CM收缩幅度及基础张力变化较孵育前差异无统计学意义（P>0.05）。NaHS浓度依赖性抑制LM和CM自发性收缩活动。高浓度NaHS使CM基础张力较对照组下降（n=8，P<0.05）（图2C）。
sGC是NO抑制肠道动力的主要作用靶点。为进一步明确NO/sGC/cGMP信号系统是否参与NaHS抑制平滑肌收缩过程，首先观察sGC抑制剂ODQ（40 μmol/L）孵育10min后LM和CM IC50的改变。ODQ孵育后LM的IC50为1 599 μmol/L（95% CI：623~4 103 μmol/L，n=6），明显高于对照组（P<0.05）；CM的IC50为1 703 μmol/L（95% CI：612~4 732 μmol/L，n=5），与对照组比较差异也具有统计学意义（P<0.05）。而cGMP竞争性拮抗剂PET-cGMP孵育前后外源性H2S对近端结肠LM和CM的IC50差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。
注：A、B：ODQ孵育组与对照组相比LM和CM浓度依赖拟合曲线的变化；C、D：PET-cGMP孵育组与对照组相比LM和CM浓度依赖拟合曲线的变化
NaHS（100 μmol/L）不影响L型钙通道的电流-电压曲线（I-V曲线），但促进L型钙通道开放，使峰电流密度从（-3.77±0.27）pA/pF增加至（-4.29±0.29）pA/pF（n=10，P<0.01）；而NaHS（300 μmol/L）使I-V曲线右移，峰电位从0 mV变为20 mV；0mV处峰电流降低至（-2.96±0.34）pA/pF （n=10，P<0.05），但20 mV处峰电流从（2.78±0.21）pA/pF增加至（4.58±0.46）pA/pF，差异具有统计学意义（n=10，P<0.01）（图4A，图4B，图4C）。
注：A：不同浓度NaHS作用下L型钙通道电流曲线；B：不同浓度NaHS作用下L型钙通道电流-电压曲线；C：NaHS作用前后0 mV和20 mV处L型钙通道峰电流密度比较（与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01，n=10）；D：不同浓度NaHS对L型钙通道稳态激活曲线的影响；E：不同浓度NaHS对L型钙通道稳态失活曲线的影响
NaHS对L型钙通道激活曲线的影响：NaHS （100 μmol/L）作用前后V1/2和κ差异无统计学意义（n=5，P>0.05）。而NaHS（300 μmol/L）使激活曲线明显右移，V1/2从（-14.3±1.7）mV右移至（-4.8±2.2）mV（n=5，P<0.05）。但κ差异无统计学意义（图4D）。NaHS对L型钙通道失活曲线的影响：NaHS（100 μmol/L）作用前后V1/2和κ差异无统计学意义。NaHS（300 μmol/L）使失活曲线明显右移，V1/2从（-31.7±2.0）mV增加至（-20±1.7）mV（n=5，P<0.05），而κ差异无统计学意义（图4E）。
NO作为肠道重要的抑制性神经递质，是否参与H2S抑制消化道动力目前尚无定论[7,8]。而且，研究已证实H2S通过调控KATP和SK等离子通道的开放直接抑制平滑肌细胞收缩[3,4]。然而，L型钙通道作为调控结肠平滑肌细胞收缩和舒张的重要离子通道，却少有研究报道H2S对该离子通道的影响。此外，NaHS在体内生成H2S的有效率为33%[9]，而H2S在体内最高浓度达160 μmol[10]，意味着实验中可采用的最大NaHS浓度为约500 μmol左右。但大部分研究中NaHS的实验浓度超出H2S在体内的生理浓度，其作用可能系H2S的毒性作用而非生理作用。本研究通过观察NO相关工具药对外源性H2S供体NaHS对结肠抑制作用的影响及NaHS对平滑肌细胞L型钙通道电流的影响，证实NaHS对结肠的抑制作用不依赖NO信号系统，且发现NaHS对结肠动力具有双重调节作用，低浓度H2S通过促进L型钙通道开放进而促进平滑肌收缩、增加平滑肌基础张力；而高浓度H2S通过改变L型钙离子通道的电压依赖特性，抑制通道激活并延迟通道开放进而减少钙离子内流使平滑肌细胞舒张，但H2S浓度均在生理范围内。
本研究显示，CBS和CSE均显著表达于结肠肌间神经丛，说明肠神经元可生成H2S[1,11]。钙离子作为重要的第二信使，参与神经系统递质释放、突触可塑性及神经元兴奋等。有研究报道H2S可促进培养的神经元细胞Ca2+内流增加[10]，提示H2S可能通过自分泌的方式直接作用于肠神经元进而参与神经元功能的调节。此外，CBS和CSE在黏膜层高表达，说明黏膜层也是生成内源性H2S的重要来源，亦是H2S发挥生物学功能的重要靶细胞。平滑肌细胞作为肠道收缩和舒张的基础，也表达CBS和CSE，提示H2S可直接由平滑肌细胞生成并通过自分泌的方式直接影响肠道动力。
肠道平滑肌的收缩受神经源性和肌源性调控，本研究采用TTX阻断肠神经系统以观察外源性H2S对平滑肌肌源性收缩的影响。结果发现NaHS以浓度依赖的方式抑制结肠LM和CM收缩，不受TTX阻断的影响；而且，尽管LM和CM的IC50均超过H2S的最大生理浓度，但NaHS（500 μmol/L）仍降低平滑肌收缩幅度，说明生理浓度范围内的H2S对肠道收缩具有抑制作用且不依赖肠神经系统。为进一步明确NO信号系统在H2S抑制结肠收缩中的作用，首先采用NO供体SNP孵育肌条，结果发现LM和CM收缩幅度及基础张力明显下降，进一步证实了NO对肠道动力的抑制作用，且说明NO是维持平滑肌基础张力的重要因子之一。而NaHS却逆转SNP对平滑肌收缩的抑制作用，使LM和CM的收缩幅度明显增加，使CM的基础张力增加，但高浓度NaHS仍抑制平滑肌收缩，说明NaHS对肠道收缩具有潜在的双重调节作用，且具有浓度依赖特性，低浓度促进而高浓度抑制。然而，TTX孵育下NaHS对平滑肌的收缩却呈现单向抑制，可能是因为低浓度NaHS对平滑肌的潜在兴奋作用被其他抑制性递质的作用所抵消。为阻断内源性NO生成，本实验采用NO合成酶抑制剂L-NNA孵育肌条并不能阻断NaHS对平滑肌收缩的抑制作用，说明NaHS对平滑肌的抑制作用不依赖NO。如前所述，NO通过激活sGC生成cGMP从而发挥抑制平滑肌收缩的作用。为进一步验证sGC是否参与NaHS的抑制作用，本实验采用ODQ抑制sGC，结果发现LM和CM的IC50较对照组增加，提示sGC下游信号系统可能参与NaHS对肠道动力的抑制作用。因此，本研究还观察了cGMP拮抗剂PET-cGMP孵育后NaHS结肠平滑肌收缩活动的影响，结果发现LM和CM的IC50与正常对照组无显著差异。结合上述研究结果，本研究认为外源性H2S对肠道动力的抑制作用不依赖NO-sGC-cGMP信号系统，ODQ孵育增加NaHS的IC50认为是ODQ本身减少cGMP的生成，从而使下游抑制信号减少从而促进平滑肌收缩，抵消了NaHS的部分抑制作用。
为进一步明确NaHS对结肠平滑肌潜在的双重调节作用的可能机制，本实验采用全细胞膜片钳实验观察不同浓度NaHS对近端结肠单个平滑肌细胞L型钙通道电流的影响。结果发现NaHS（100 μmol/L）促进L型钙通道开放，使钙离子内流增加，但不影响L型钙通道的电压依赖特性；而NaHS（300 μmol/L）明显抑制L型钙通道开放，使L型钙通道的峰电位增加，改变L型钙通道的电压依赖特性，抑制L型钙通道激活和失活，从而使钙离子内流减少。结合肌张力浴槽实验，本研究认为L型通道参与了NaHS对平滑肌收缩的双重调节作用，低浓度NaHS促进L型钙通道开放，而高浓度抑制L型钙通道开放。高浓度NaHS改变L型钙通道的离子通道特性可能是由于H2S对L型钙通道蛋白游离巯基的调节作用[12]。但在心肌细胞的研究中发现，高浓度H2S抑制L型钙通道的开放，但不影响该通道的离子通道特性[13]，与本研究结果不一致，可能是由于H2S对不同靶细胞作用不同，也说明了H2S生物学功能的多样性。
综上所述，生理浓度的外源性H2S对结肠平滑肌收缩具有潜在的双重调节作用，L型钙通道在此过程中发挥重要作用，且H2S对结肠收缩的抑制作用不依赖NO信号系统。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
