本文于2020年4月22日优先发布于中华眼科杂志官网
探讨眼部组织新型冠状病毒侵染和激活关键蛋白人血管紧张素转换酶2（ACE2）和跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的情况，明确新型冠状病毒在眼部的侵染基础。
实验研究。选取30只小鼠，按性别、年龄、是否诱导糖尿病模型分为雄性组、雌性组、老年组、糖尿病组及糖尿病对照组，每组6只。使用荧光定量PCR分析小鼠结膜、角膜、泪腺、虹膜、晶状体、视网膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达情况，并与肺脏、心脏、肾脏、肝脏中两个基因的表达量进行比较。使用免疫组化染色分析了小鼠各组织中ACE2和TMPRSS2蛋白的分布和表达情况。另取山东省眼科研究所红十字眼库接收的符合捐献条件的志愿者角膜及结膜组织切片，与小鼠眼部ACE2蛋白和TMPRSS2蛋白表达进行验证比较。同时通过分析已发表的人眼部组织转录组数据库，比较人角膜和结膜中ACE2和TMPRSS2基因的表达情况。对不同性别、年龄、及糖尿病条件下小鼠眼表组织的ACE2基因表达变化进行分析，采用独立样本t检验对数据进行统计学分析。对数据库中人角膜和结膜组织两种基因表达分析，采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析。
在小鼠6种眼部组织中，结膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达量最高，但均低于肾脏和肺脏；ACE2和TMPRSS2蛋白阳性染色集中于结膜上皮、角膜上皮和泪腺腺泡。ACE2基因的表达具有性别差异，在雌性小鼠结膜和角膜的表达显著低于雄性小鼠，分别为雄性相应组织的43% （t=3.269，P=0.031）和63% （t=4.080，P=0.015）；糖尿病小鼠结膜和泪腺中的ACE2基因表达略高于非糖尿病小鼠，分别为1.21倍和1.10倍 （P>0.05）；不同年龄小鼠ACE2基因表达差异无统计学意义。与小鼠相似，人结膜ACE2和TMPRSS2基因表达量显著高于角膜（P=0.007），分别约为角膜上皮基因表达量的5.74倍和12.84倍。
结膜中ACE2和TMPRSS2的表达在6种检测的眼部组织中最高，提示结膜是新型冠状病毒眼部感染的主要靶组织。（中华眼科杂志，2020，56：438-446）
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新型冠状病毒为具有包膜的正链RNA病毒，与严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）同属乙型冠状病毒属。新型冠状病毒可利用包膜上刺突蛋白（S蛋白）与宿主细胞人血管紧张素转换酶2 （angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合[1]，并通过宿主细胞跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane serine proteases 2，TMPRSS2）进一步切割激活[2]，产生包含膜融合所需关键元件的S2亚基，介导病毒进入宿主细胞。与健康小鼠相比，TMPRSS2敲除小鼠感染SARS-CoV和MERS-CoV后肺部病毒量、病理和炎性反应明显减轻[3]。新型冠状病毒与SARS-CoV所结合的受体均为ACE2，但这两种病毒与ACE2直接结合的S蛋白中的关键受体结合域仍有不同[4]，新型冠状病毒显示出更高的ACE2亲和性[5]。
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的临床特征较为多样，其感染率和致病程度也具有一定的流行病学特征。对COVID-19死亡患者进行系统解剖后，观察到患者肺部损伤明显[6]；对25例死亡患者病程记录的回溯性研究发现，除肺部外，其他常见受损脏器分别为心脏、肾脏、肝脏[7]。对72 314例患者的流行病学调查分析后发现[8]，确诊患者中男性占比51.4%，女性占比48.6%；死亡患者中男性较多，占比63.8%；全国60岁以上老年患者为31.2%，80岁以上的患者粗病死率最高，为14.8%；未报告合并症的患者病死率为0.9%，而合并糖尿病患者病死率为7.3%。
眼表作为直接暴露于外界的黏膜组织，有被新型冠状病毒感染的风险，前期亦有研究表明角膜和结膜中存在ACE2表达[9]。目前已发现多例COVID-19患者首发或伴发结膜炎病例。在一项对全球COVID-19合并眼部症状病例的系统回溯研究中，研究人员对2 422项报道进行了筛选，最终对11例进行了深入分析，其中有3例结膜炎患者泪液病毒PCR检测阳性，8例泪液阳性患者未合并结膜炎，还有14例结膜炎患者泪液检测阴性[10]。在武汉2家医院共534例COVID-19患者中，25例患者出现了结膜充血症状，由于缺少结膜拭子阳性结果，这些患者并未被诊断为结膜炎；通过问诊发现其他眼部表现还包括112例干眼、68例视物模糊以及63例异物感；332例患者曾有过手-眼接触史[11]。这些结果为新冠肺炎病毒可进行眼部感染提供了线索，但由于现实诊疗过程中临床取样的样本量、取样时间、取样人群、问卷和诊疗手段的限制，以及患者所处周围环境中病毒浓度的差异，仍然无法就人在现实环境中通过眼表感染新型冠状病毒并进一步传播的风险给出定论。
本研究系统检测了新型冠状病毒侵染和激活关键蛋白ACE2和TMPRSS2在结膜、角膜、泪腺3种眼表组织以及虹膜、晶状体、视网膜3种眼内组织的表达情况，并与肺脏、心脏、肾脏、肝脏中的表达量进行比较。同时，我们也比较了不同性别、年龄以及糖尿病小鼠的眼表组织ACE2基因的表达情况，以评估新型冠状病毒感染眼表组织的可能性。
山东省眼科研究所红十字眼库接收的符合捐献条件的志愿者角膜及结膜组织各5例，组织取材后立刻固定于4%中性甲醛溶液，固定24 h后进行后续的石蜡切片及免疫组织化学染色。
小鼠按性别、年龄、是否诱导糖尿病模型分为雌性组、雄性组、老年组、糖尿病组及糖尿病对照组，每组6只，其中5只用于荧光定量PCR实验，1只用于石蜡切片及免疫组化染色，每只小鼠脱颈处死后取眼部各组织及主要脏器用于实验。其中雄性组和雌性组为12周龄对应性别的小鼠，购自北京斯贝福生物技术有限公司，雄性小鼠质量合格证号为1103241911036853，雌性质量合格证号为1103242011000196。老年组为24个月龄的雄性小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证为11400700276311。糖尿病组为在雄性小鼠基础上腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导糖尿病模型小鼠（28周龄），糖尿病对照组为同周龄未注射STZ的雄性小鼠。
糖尿病小鼠模型的建立：STZ（美国Sigma-Aldrich公司）溶解于0.1 mmol/L预冷的柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液（pH值为4.5）。使用6~8周龄，体重为20~25 g的C57BL/6J小鼠（雄性），连续腹腔注射5 d、每天1次，注射浓度为60 mg/kg体重，最后一次腹腔注射后3个月时取鼠尾静脉血，测量其血糖水平，血糖水平高于16.7 mmol/L的小鼠认为糖尿病小鼠模型建模成功。
本研究设计符合视觉与眼科学研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO）制定的动物使用规范。
Trizol裂解小鼠的各个组织，利用RNA提取试剂盒（北京全式金生物公司）提取组织的总RNA；将RNA逆转录为cDNA，构建cDNA文库（大连TAKARA公司）；以cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测（瑞士Roche公司）。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40 个循环，60 ℃时采集荧光信号，最后制作融解曲线，采用2-ΔΔCT 法来分析基因的相对差异表达。引物序列：ACE2 正向引物5’-CCC CAA AAT GTG TCT GAT GTC AT-3’； ACE2反向引物5’-AGG CTG GTA AGG TGG CTC AA-3’；TMPRSS2正向引物：5’-TCC AGC CCA GTA CTA CCC ATC T-3；TMPRSS2反向引物：5’-AGG GCG AGG GCT AAA CAC A-3；β-actin正向引物：5’-ACT GCC GCA TCC TCT TCC T-3’；β-actin反向引物：5’-TCA ACG TCA CAC TTC ATG ATG GA-3’。
组织经4%甲醛固定24 h以后，从80%乙醇开始进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋后切片，切片厚度4 μm，切片经二甲苯脱蜡后，梯度乙醇复水，苏木精伊红染色，中性树胶封片。
对于免疫组织化学染色，使用4 μm石蜡切片，应用防脱片黏附切片，60 ℃温箱过夜，二甲苯脱腊，梯度乙醇复水，放入柠檬酸抗原修复液（pH值为6.0）中高压修复，加入3% H2O2 封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次，山羊封闭血清室温孵育20 min，甩干，加入兔抗ACE2抗体（1∶200，美国Abcam公司，ab87436）或TMPRSS2抗体（1∶1 000，美国Abcam公司，ab92323），4 ℃湿盒中孵育过夜，同时设空白对照，不加入一抗，以PBS代替。PBS洗涤一抗后，滴加羊抗兔二抗（基因科技股份有限公司），室温中孵育20 min，PBS洗涤3次，5 min/次，DAB显色，蒸馏水洗涤，终止反应，苏木素复染细胞核，组织细胞呈现棕黄色染色为阳性。
采用SPSS 20统计学软件进行统计分析。ACE2基因在不同组小鼠同种组织之间的显著性检验，采用独立样本t检验。利用已发表的二代测序数据分析计算眼表组织中ACE2基因及TMPRSS2基因表达量差异，均采用Mann-Whitney U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。相对基因表达量倍数变化展示为平均值±标准差。
定量PCR结果显示，5只健康雄性12周龄小鼠眼部组织中结膜的ACE2基因表达最高，为角膜的（3.04±0.28）倍，泪腺的（2.91±0.40）倍，虹膜的（8.43±4.49）倍，晶状体的（38.63±10.15）倍，视网膜的（3.96±0.35）倍；与其他内脏器官相比，结膜ACE2基因表达量是肾脏中的（0.08±0.02）倍，肺脏中的（0.51±0.39）倍，心脏的（0.75±0.11）倍，肝脏的（4.04±3.61）倍。免疫组织化学染色结果显示：与空白对照相比，ACE2主要分布于小鼠结膜、角膜上皮部位，基质部分呈弱阳性；在泪腺的腺泡中着色深而在导管中无染色（图1）。眼结膜和角膜上皮均为 与外界接触的部位，其表达的ACE2受体为新型冠状病毒侵染提供了潜在可能。
通过比较同年龄健康小鼠雄性和雌性结膜、角膜、泪腺中ACE2基因的表达，发现雌性小鼠的结膜中ACE2基因表达量雌性为雄性的（0.43±0.14）倍（t=3.269，P=0.031），而角膜中为雄性的（0.63±0.13）倍，差异有统计学意义（t=4.080，P=0.015）。雌性小鼠的泪腺中ACE2的表达是高于雄性小鼠的，为（1.14±0.36）倍，但由于有个体间差异，表达量的提高并不显著。蛋白染色结果也支持荧光定量中观察到的差异，雌性小鼠结膜（图2中A、B）和角膜（图2中C、D）中ACE2染色较雄性小鼠（图1中C）弱，泪腺（图2中E、F）中ACE2染色稍强于雄性小鼠（图1中G）。
12周龄年轻雄性小鼠结膜、角膜、泪腺组织中ACE2基因的表达量与24月龄老年雄性小鼠差异无统计学意义（P>0.05）。与年轻小鼠相比，老年小鼠结膜ACE2基因表达量为年轻小鼠的（0.71±0.35）倍；泪腺中略低，为（0.97±0.60）倍；角膜ACE2基因为年轻小鼠的（1.24±0.79）倍。免疫组织化学中老年小鼠结膜、角膜中ACE2着色较深，泪腺中ACE2染色程度与年轻小鼠类似（图3）。
糖尿病小鼠结膜中ACE2基因的表达量较同年龄未诱导糖尿病的健康小鼠相比提高为后者的（1.21±0.15）倍（P>0.05）；而糖尿病小鼠角膜和泪腺中ACE2基因表达量与健康小鼠基本持平（P>0.05），分别为（0.96±0.21）倍和（1.10±0.60）倍。免疫组织化学染色的结果与PCR类似，非糖尿病小鼠结膜和泪腺中ACE2染色较糖尿病小鼠结膜和泪腺阳性染色浅，而两者角膜着色相近（图4,5）。
人结膜和角膜中ACE2基因的表达情况与小鼠中类似。利用已发表的二代测序数据分析ACE2基因在结膜和角膜上皮、基质、内皮中的相对基因表达量可知，人结膜上皮中ACE2基因表达量显著高于角膜上皮，为角膜上皮的（5.74±2.47）倍；而角膜上皮中ACE2基因表达量高于角膜基质和内皮（图6）。新型冠状病毒除了依靠S蛋白与宿主细胞表面特异性受体结合，还需要被宿主蛋白酶进行切割激活，以侵染宿主细胞。因此笔者也检测比较了蛋白酶TMPRSS2基因在人眼表组织的表达情况。TMPRSS2基因在人结膜中的表达量显著高于角膜全层，其在结膜中表达量为在角膜上皮中的（12.84±3.81）倍；角膜上皮中TMPRSS2基因的表达量略高于角膜内皮和角膜基质（图7）。
进一步的免疫组织化学染色也验证了数据库中的分析结果。角膜上皮（图8中A、B）中ACE2蛋白表达较结膜上皮（图8中A、B）弱，ACE2蛋白在结膜上皮基底层细胞中表达量最高，而在杯状细胞上缘及结膜基质层表达量较低。TMPRSS2在人角膜中的染色分布与ACE2的染色分布基本一致。TMPRSS2在角膜上皮中染色较深，基质中着色较浅（图9中A、B），但强于ACE2在角膜基质中的表达。人结膜中的TMPRSS2蛋白主要表达在上皮基底层，基质层中TMPRSS2染色相对较弱（图9中C、D）。
健康雄性12周龄小鼠眼部组织中结膜的TMPRSS2基因表达最高，其他组织中TMPRSS2基因表达差异较大，其中晶状体、视网膜、心脏的TMPRSS2基因表达量极低，均低于结膜表达量的1%；在虹膜中表达量较低，为结膜中表达量的（0.12±0.03）倍；角膜、泪腺与肝脏中表达量与结膜持平；所有检测组织中肾脏TMPRSS2基因表达量最高，为结膜的（5.77±3.77）倍；其次为肺脏，约为结膜的（1.27±0.57）倍。综合ACE2基因与TMPRSS2基因在各组织中的表达可以看出，肾脏、肺脏、结膜环境在辅助新型冠状病毒进入宿主细胞方面较为有利。TMPRSS2蛋白在小鼠结膜中分布主要集中于上皮；在泪腺的腺泡中着色深而在导管中无染色（图10）。
ACE2为新型冠状病毒结合宿主细胞的受体，而TMPRSS2为病毒感染过程中起主要作用的蛋白酶。通过系统研究发现，人结膜和角膜均有ACE2和TMPRSS2表达，且结膜中这两种基因的表达丰度在眼部最高。结合既往报道部分患者泪液中可以检测到病毒核酸的临床发现[10,11]，本实验结果为结膜组织是新型冠状病毒感染的靶组织提供了直接证据。同时，结膜囊通过鼻泪管与鼻腔相连，而泪腺腺泡细胞中亦有较高的ACE2和TMPRSS2表达，提示新型冠状病毒存在通过结膜再感染呼吸道的可能性。
目前COVID-19患者结膜囊拭子病毒核酸检测阳性率较低，这可能与样本量、取样时间和检测手段有关，也可能与病毒在结膜细胞内的复制量有关。根据最新大动物模型的研究发现，恒河猴结膜接种新型冠状病毒后1 d内，结膜囊拭子病毒检测即呈阳性，而后转为低于检测标准，证明病毒可以感染结膜，并可快速转移至呼吸道或其他组织中[15]，这可能是临床发现只有极少数新冠肺炎患者结膜囊拭子检测呈阳性的原因之一。结膜感染后的恒河猴在病毒接种后1~7 d内，其鼻拭子和咽拭子均呈现病毒阳性，证明新型冠状病毒可通过结膜途径进一步感染呼吸道[15]。结膜感染后的恒河猴鼻腔组织的病毒载量远高于眼部组织，而经气道感染的恒河猴眼组织内几乎检测不到病毒[15]，提示结膜途径感染与呼吸道途径感染在病理进程上有明显区别，同时，这也解释了多数患者通过呼吸道途径感染，无眼部症状的临床现象。
通过结膜途径感染的恒河猴在感染7 d后尸检发现，病毒在眼部组织中主要分布于泪腺、视神经和结膜中[15]，该发现与我们本文的研究结果一致：泪腺ACE2和TMPRSS2均呈现广泛的阳性表达，表达量略低于结膜组织，泪腺可通过鼻泪管连接眼表和鼻咽处，有着病毒从结膜转移至呼吸道的分子基础，但结膜途径接种的病毒通过何种方式进入泪腺仍需要进一步的研究。在后续的研究工作中，也可以借助动物感染模型，深入分析新型冠状病毒眼部感染的表型特征及发病机制。
在综合对比不同性别、年龄和糖尿病小鼠各组织ACE2基因表达差异后发现，糖尿病小鼠结膜ACE2基因表达较健康小鼠有所提高，而糖尿病小鼠肺部ACE2基因的表达量较健康小鼠有所下降。我国糖尿病患者人数众多，糖尿病患者感染新型冠状病毒后病死率高是否与ACE2表达量有关仍需进一步研究。血管紧张素转换酶和其同源蛋白ACE2是肾素-血管紧张素系统中的关键作用酶。已经有多个研究发现，ACE2表达量在糖尿病小鼠中上升[16, 17]，而ACE2缺陷小鼠更倾向于发展成糖尿病状态[18]。研究认为，在糖尿病状态下，ACE2会拮抗ACE的作用，起到保护作用[17]。因此，在糖尿病小鼠中检测到ACE2高表达或许与其在糖尿病状态中的保护机制有关。
本研究中，老年小鼠ACE2基因表达量无显著变化，但对于老年人群，其患有基础疾病的可能性较大，免疫能力较低，可能是导致感染率或病死率高的原因。鉴于眼科患有基础疾病和老年患者基数大，更应该做好日常工作中的防护。
志谢 本文从立题至成文得到谢立信院士的悉心指导
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
