研究细菌耐药基因水平转移的控制技术。
以卡那霉素耐药基因Kan为靶基因设计3组靶向sgRNA，分别退火后插入到pCas9质粒中，重组菌用氯化钙法制成感受态，将含有Kan耐药基因的质粒pET-30a向其转化，转化菌液分别涂布含氯霉素和含氯霉素/卡那霉素平板，比较各组转化效率。将携带Kan特异性sgRNA的重组质粒分别转化含pET-30a的大肠埃希菌，PCR检测Kan耐药基因的降解，并绘制转化子在氯霉素平板上的生长曲线以分析特异性sgRNA对受体菌生长的影响。
所设计的3组sgRNA中有2组可以介导CRISPR/Cas9系统对Kan耐药基因水平转移的完全抑制，其余1组也可使转移效率降低88.08%。抑制机制为特异性CRISPR/Cas9系统降解了Kan耐药基因。未发现3组sgRNA对受体菌生长有明显影响。
特异性CRISPR/Cas9系统可抑制细菌Kan耐药基因的水平转移。
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细菌感染一直是常见的重要临床问题[1,2]。抗生素的运用使得抗感染治疗出现了新纪元，但抗菌药物发展的同时也伴随着细菌耐药性的产生和迅速扩散[3]。目前细菌耐药性形势十分严峻，甚至出现了多重耐药的超级细菌[4]，而新药研发速度远不及细菌耐药性产生和扩散的速度。如不及时控制细菌耐药性，人类可能将会回到细菌感染无药可用的时代[5]。耐药基因水平转移是细菌耐药性扩散的重要原因[6]，因此抑制耐药基因转移成为控制细菌耐药性形势的一个重要策略。CRISPR系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古菌的适应性免疫系统，可通过降解靶基因而抵御噬菌体和质粒等外源基因对宿主菌的侵害[7,8,9]。随着对CRISPR系统研究的深入，人们开始将其用于基因编辑。野生型Ⅱ型CRISPR系统已通过人工改造形成结构精巧但功能强大的简化版CRISPR/Cas9系统[9,10]，自行设计的靶基因sgRNA可方便地插入该系统以观察对靶基因的编辑效率。目前该技术已成功应用于人多能干细胞基因的高效敲除[11,12]、斑马鱼的高通量定点基因突变和大范围分型[13]，HBV、HIV-1等病毒感染的防御[14,15,16]以及欧洲蜜蜂的基因敲除等[17]。目前对CRISPR/Cas9的运用研究主要集中在基因编辑方面。本研究以Kan耐药基因为对象设计了3对靶向sgRNA，插入含简化版CRISPR系统的载体pCas9，含特异性sgRNA的重组载体可使Kan耐药基因的水平转移得到显著或完全抑制，提示该系统在控制细菌耐药基因扩散中可能具有重要应用价值。
